菌種的選育和保存課件

第四章菌種選育與保存第四章菌種選育與保存抗生素生產(chǎn)基于微生物本體可以產(chǎn)生抗生素，依賴于微生物機(jī)體在反應(yīng)器內(nèi)的生長繁殖及代謝過程來合成抗生素，通過分離純化進(jìn)行提取精制，并最終制劑成型來實(shí)現(xiàn)藥物生產(chǎn)的過程?？股厣a(chǎn)制種：選取改良合適的菌種發(fā)酵：繁殖得到大量的菌體提?。簭木w中提取抗生素制種：選取改良合適的菌種

菌種選育理論與技術(shù)利用工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，決定生產(chǎn)水平高低最主要的有三個方面的因素：生產(chǎn)菌種，發(fā)酵工藝和后提取工藝。其中最重要的是生產(chǎn)菌種。菌種選育的最初目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。菌種選育理論與技術(shù)利用工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的過產(chǎn)生抗生素的優(yōu)良菌種應(yīng)具備條件1.產(chǎn)量高；2.生長快；3.性能穩(wěn)定；4.容易培養(yǎng)。產(chǎn)生抗生素的優(yōu)良菌種應(yīng)具備條件菌種選育：根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求用隨機(jī)方法或理性化方法進(jìn)行篩選，獲得目的變種。第一節(jié)菌種選育菌種選育：第一節(jié)菌種選育菌種選育的目的菌種選育的目的遺傳—DNA的半保留復(fù)制，保持物種的相對穩(wěn)定性變異—DNA4種核苷酸堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)、順序或數(shù)目發(fā)生變化，導(dǎo)致生物體表型的改變，通常稱為基因突變，這種表型改變可穩(wěn)定地一代一代傳遞下去。促使新性狀的產(chǎn)生、獲得新的優(yōu)良品種一、微生物的遺傳和變異

遺傳—DNA的半保留復(fù)制，保持物種的相對穩(wěn)定性一、微生物遺傳型變異：在遺傳物質(zhì)水平上發(fā)生了改變，從而引起某些相應(yīng)性狀發(fā)生改變的特性

變異性表型變異：微生物在生活條件發(fā)生改變時，發(fā)生暫時的形態(tài)、生理等特性的改變，但隨著環(huán)境條件的復(fù)原，它們又恢復(fù)了原有的特性遺傳變異：1、突變

2、重組突變：1、自發(fā)突變（10-7）

2、誘發(fā)突變（10-4），為育種主要手段。遺傳變異：1、突變（一）基因突變基因突變是指遺傳物質(zhì)（DNA）中的核苷酸發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化，主要包括點(diǎn)突變和染色體畸變兩大類。

1、點(diǎn)突變是由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變引起的。

2、染色體畸變是指DNA大段變化（損傷）的現(xiàn)象，主要包括染色體結(jié)構(gòu)上的變化和染色體數(shù)目的變化。（二）基因重組

指兩個或多個不同性狀個體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一個體細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)重新組合后，造成菌種變異，形成新的遺傳型個體。

（一）基因突變二、菌種選育的意義1、提高單位產(chǎn)量和改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量青霉素發(fā)酵：2g/ml→250g/ml→1000g/ml→70000g/ml1928年1943年1945年現(xiàn)在產(chǎn)黃色色素的原始菌種產(chǎn)黃青霉WisQ-176，產(chǎn)生黃色色素，提煉過程中難以去除，影響產(chǎn)品質(zhì)量，在菌種選育過程中獲得無色素突變型菌株，解決了產(chǎn)品質(zhì)量問題。二、菌種選育的意義2、改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業(yè)生產(chǎn)如選育抗噬菌體的菌株、能利用廉價的發(fā)酵原料或需氧量較小的菌株、改變菌種代謝產(chǎn)物的組成配比等。2、改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業(yè)生產(chǎn)二、菌種選育的經(jīng)典方法

1、自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。自發(fā)突變機(jī)制：自發(fā)突變產(chǎn)生原因：1、多因素低劑量長期綜合誘變的結(jié)果；2、自然界存在低濃度的誘變物質(zhì)；3、微生物自身產(chǎn)生的誘變物質(zhì)（咖啡堿、過氧化氫等）4、堿基互變異構(gòu)效應(yīng)。二、菌種選育的經(jīng)典方法1、自然選育二、菌種選育的經(jīng)典方法:自然選育特點(diǎn)：（1）能純化、復(fù)壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高平均生產(chǎn)水平。（2）難以選育高產(chǎn)突變菌株，不能使生產(chǎn)水平大幅度提高。二、菌種選育的經(jīng)典方法:自然選育特點(diǎn)：2、誘變育種誘變育種是指人工有意識地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的一種或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。特點(diǎn)：與自然選育比較，由于引進(jìn)了誘變劑處理，因而加速了菌種突變的頻率，擴(kuò)大了變異的幅度，從而提高了獲得優(yōu)良特性的突變株的幾率。2、誘變育種

物理誘變劑：紫外線、x射線、Y射線、快中子、β射線、超聲波、激光誘變劑化學(xué)誘變劑：氮芥、乙烯亞胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基甲基脲、亞硝酸生物誘變劑：噬菌體、轉(zhuǎn)座因子物理誘變劑：紫外線、x形成胸腺嘧啶二聚體，影響DNA復(fù)制物理誘變劑CTAGGATCCTAGGATC紫外線形成胸腺嘧啶二聚體，影響DNA復(fù)制物理誘變劑CTAGGATC是一些能和DNA起作用，改變其結(jié)構(gòu)，從而引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。如烷化劑、亞硝基類化合物，堿基類似物（5-溴尿嘧啶），吖啶類化合物。烷化鳥嘌呤與胸腺嘧啶錯誤配對化學(xué)誘變劑是一些能和DNA起作用，改變其結(jié)構(gòu)，從而引起遺傳變異的化學(xué)物1).烷化劑一類重要的誘變劑，可引起堿基的錯誤配對而引起的多種類型突變，如轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和移碼誘變，以及染色體畸變。使用最為廣泛的是亞硝基胍（NTG）和乙基磺酸乙酯（EMS），主要因?yàn)樗鼈儦⑺缆氏鄬^低，而獲得的突變頻率較高。2).嵌合劑常用有啞啶類染料、溴乙錠、ICR等化合物。能引起移碼突變。1).烷化劑3).堿基類似物分子結(jié)構(gòu)與DNA上的堿基相似的化合物稱為堿基類似物。如5-溴尿嘧啶（5-BU）、6-氨基嘌呤等。這些化合物干擾了DNA分子內(nèi)酮式與烯醇式的平衡。它們摻入DNA分子，使其出現(xiàn)烯醇的比例增加。分別形成AT向GC和GC向AT的轉(zhuǎn)換。4).亞硝酸主要是通過氧化脫氨基作用脫去DNA堿基上的氨基，如C氧化脫氨基成為U，A脫氨成為次黃嘌呤等。3).堿基類似物第四章菌種的選育和保存課件5).抗生素絲裂霉素C、放線菌素D等抗癌抗生素作用于DNA合成，從而干擾細(xì)胞正常分裂。3、生物誘變劑噬菌體：溶源性噬菌體是一種遺傳信息的傳遞者，因而人們把噬菌體看作是一種誘變劑。在選育抗噬菌體菌種時，噬菌體顯示出明顯的誘變效應(yīng)。轉(zhuǎn)座因子：轉(zhuǎn)座因子是一類能夠轉(zhuǎn)移位置的遺傳因子。5).抗生素誘變劑的選擇及影響誘變效果的因素（一）、誘變劑的選擇誘變劑作用：1、提高突變頻率；2、擴(kuò)大變異產(chǎn)生的幅度。合適劑量：凡是既能增加變異幅度，又能促使變異向正突變范圍移動的劑量就是合適的劑量。一般認(rèn)為高劑量（致死率在90%以上）引起的變異范圍大，變株比較多，適用于單位產(chǎn)量較低的菌株，而長期用于工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)過多次誘變選育的菌株，則宜用中等劑量（致死率為70%~80%），甚至更低。并且一般認(rèn)為低劑量可以提高正變率。誘變劑的選擇及影響誘變效果的因素（二）影響誘變效果的因素1、選擇合適的出發(fā)菌株即用來育種的原始菌株，多采用生產(chǎn)能力高，具有良好性狀的菌株作為親本。用作誘變的出發(fā)菌株必須產(chǎn)量高，生長速度快，營養(yǎng)要求低，產(chǎn)生孢子多，對誘變劑的敏感性大，變異幅度大。（二）影響誘變效果的因素2、采用分散狀態(tài)的孢子懸浮液處理誘變劑所處理的微生物一般要求呈懸浮狀態(tài)，并使細(xì)胞盡量處于分散狀態(tài)。有利于細(xì)胞均勻接觸誘變劑，也可以部分避免出現(xiàn)不純菌落。3、采用單核細(xì)胞處理誘變劑所處理的細(xì)胞中的細(xì)胞核愈少愈好，最好是處理單核細(xì)胞（用玻璃珠打散）。如處理霉菌或放線菌，則盡量采用孢子進(jìn)行處理。如是芽孢桿菌，則處理芽孢。4、注意微生物的生理狀態(tài)一般對數(shù)期的細(xì)菌對誘變最為敏感。讓霉菌或放線菌的分生孢子稍稍萌發(fā)，可以提高誘變效果。2、采用分散狀態(tài)的孢子懸浮液處理5、適宜的誘變方法兩種或多種誘變劑先后使用；同一誘變劑重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑同時使用。誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)。同時,抗生素產(chǎn)量是數(shù)量性狀,是微效多基因作用的結(jié)果,即抗生素的增產(chǎn)是一種累積效應(yīng)。因此,這種復(fù)合誘變應(yīng)多次循環(huán)進(jìn)行,誘變效果會更理想。5、適宜的誘變方法四、突變株的篩選1、隨機(jī)篩選指菌種經(jīng)過誘變處理后，僅憑經(jīng)驗(yàn)隨機(jī)篩選菌落。（1）肉眼觀察法排除低產(chǎn)菌落：經(jīng)驗(yàn)性（2）瓊脂塊法排除低產(chǎn)菌落：春日霉素的篩選，提高效率，穩(wěn)定性差（3）直接搖瓶篩選法：準(zhǔn)確性高，但工作量大，效率低四、突變株的篩選肉眼觀察法排除低產(chǎn)菌落：比如，在四環(huán)素突變株篩選過程中人們發(fā)現(xiàn)，突變株的菌落形態(tài)與四環(huán)素發(fā)酵效價之間存在有一定的對應(yīng)關(guān)系。即菌落呈圓形或梅花形、表面粗糙、孢子鼠灰色或深灰色、孢子量大、豐滿且菌落較小的突變株,往往是發(fā)酵效價得以提高的表現(xiàn)。

肉眼觀察法排除低產(chǎn)菌落：又如在康樂霉素C產(chǎn)生菌在紫外線處理過程中發(fā)現(xiàn)了自然分離過程中沒有的形態(tài)變異,對各種菌落形態(tài)與產(chǎn)量的正變關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(以抑菌圈比出發(fā)實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌圈大10%以上的菌株為正變菌株)。菌落形態(tài)有草帽型、饅頭型、中間開花型及小菌落。草帽型是最常見的,而中間開花的與之形態(tài)相近,只不過草帽型中間是一個尖,而開花型中間裂開花。小菌落是紫外處理出現(xiàn)的少量菌落,而自然分離中未發(fā)現(xiàn)。草帽型有穩(wěn)定的高正變率。又如在康樂霉素C產(chǎn)生菌在紫外線處理過程中發(fā)現(xiàn)了自然分離過程中2、半理性化篩選隨著人們對抗生素生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)制的了解不斷深入，產(chǎn)生了推理選育技術(shù)。指運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進(jìn)行設(shè)計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株的篩選方法。2、半理性化篩選如氯霉素的生物合成過程中，芳基胺合成酶為關(guān)鍵酶，當(dāng)氯霉素濃度到達(dá)100u/ml時，可完全抑制該酶的合成。因此，可以考慮選育解除終端產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)的突變株。類似還有：新生霉素影響產(chǎn)生菌的琥珀酸脫氫酶活力、制霉菌素影響醛縮酶活力，瑞斯托霉素影響磷酸甘油醛脫氫酶活力等。如氯霉素的生物合成過程中，芳基胺合成酶為關(guān)鍵酶，當(dāng)氯霉素濃度在青霉素發(fā)酵過程中加入苯乙酸或苯氧乙酸作為前體，分別能合成青霉素G和V。但培養(yǎng)基中過量的前體有較強(qiáng)毒性，且可抑制終產(chǎn)物生物合成。選育對毒性前體的抗性突變株，可消除反饋抑制作用。又如氯化物是灰黃霉素發(fā)酵前體，選用耐氯化物的變株，提高灰黃霉素產(chǎn)量。在青霉素發(fā)酵過程中加入苯乙酸或苯氧乙酸作為前體，分別能合成青三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離，篩選出具有新性狀的菌株。優(yōu)點(diǎn)：能集中位于不同品種中的優(yōu)良性狀。缺點(diǎn)：只能利用已有的基因組，并不能產(chǎn)生新的基因。雜交進(jìn)程緩慢，過程繁瑣。三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株2、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用融合劑（如聚乙二醇）促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。

細(xì)胞（A+B—）

細(xì)胞（A—B+）

脫壁處理

脫壁處理

原生質(zhì)體（A+B—）

原生質(zhì)體（A—B+）

混合

加融合劑

原生質(zhì)體融合

涂平板（原生質(zhì)體再生）

形成菌落

檢出重組子菌落（A+B+）

2、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生3、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）是指按照人的意志，將某一生物體(供體)的遺傳信息在體外經(jīng)人工與載體相接(重組)，構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一生物體(受體)細(xì)胞中，使被引進(jìn)的外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達(dá)和遺傳。3、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）自20世紀(jì)，80年代以來，對鏈霉素抗生素產(chǎn)生菌分子遺傳學(xué)的研究取得較大進(jìn)展。對多種抗生素的生物合成基因進(jìn)行了不同程度的研究。比如：1、增加限速酶基因拷貝數(shù)，提高菌種生產(chǎn)能力限速步驟：在抗生素合成過程中，某些步驟對整個生物合成是至關(guān)重要的。限速酶：控制限速步驟的酶叫限速酶，通過增加限速酶基因的劑量，可能會緩解限速酶引起的“瓶頸”效應(yīng)。如構(gòu)建基因工程菌，將編碼限速酶的基因克隆至載體，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)菌株，可篩得高產(chǎn)菌株。自20世紀(jì)，80年代以來，對鏈霉素抗生素產(chǎn)生菌分子遺傳學(xué)的研2、引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因，增加抗生素單位產(chǎn)量許多抗生素生物合成基因經(jīng)常與菌種對自身抗生素耐藥基因連鎖存在，因此可利用高拷貝質(zhì)粒的基因劑量，提高菌種對自身抗生素的抗性，可提高抗生素產(chǎn)量。另外，調(diào)節(jié)基因在抗生素的生物合成中也起很重要的作用，增加正調(diào)節(jié)基因的拷貝數(shù)也能大幅度地提高次級代謝物的合成能力。2、引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因，增加抗生素單位產(chǎn)量3、引入血紅蛋白基因，改善微生物的工業(yè)狀況70年代末在專性好氧菌透明顫菌(Vit-reoscilla)中發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白(VHb),這是迄今在原核生物中發(fā)現(xiàn)的唯一一種血紅蛋白。對VHb的功能研究表明,它作為一個氧氣攜帶者,能促進(jìn)氧氣擴(kuò)散到細(xì)胞末端氧化酶上,使細(xì)胞在貧氧狀態(tài)下也能很好地生長。3、引入血紅蛋白基因，改善微生物的工業(yè)狀況可將Vgb通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌中,在限氧條件下不僅使菌體生長量增加,還使其放線紫紅素產(chǎn)量提高。也可將Vgb引入產(chǎn)黃頂頭孢霉菌及產(chǎn)黃青霉菌中,限氧時VHb在前者的表達(dá)量較高,而且頭孢菌素C的產(chǎn)量比對照菌株提高5倍。但這些實(shí)驗(yàn)僅在“限氧”這個特定條件下進(jìn)行，而在工業(yè)發(fā)酵上，它的表達(dá)量很低，沒有顯示出產(chǎn)量增加優(yōu)勢，還有待進(jìn)一步深入研究?？蓪gb通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌中,在限氧條件菌種的退化

退化：連續(xù)傳代基因突變

環(huán)境不良污染雜菌生產(chǎn)能力下降抵抗不良環(huán)境條件能力減弱菌種的退化退化：生產(chǎn)能力下降第二節(jié)菌種保藏

定義：將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持菌種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。條件及原理：

1.

低營養(yǎng)

2.

干燥

3.隔氧

4.低溫降低代謝速率或使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)第二節(jié)菌種保藏定義：降低代謝速率或使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)一、定期移植保藏法

（斜面低溫保藏法）1．原理制造低溫環(huán)境，降低菌種的新陳代謝活動能力。2、方法將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上、置最適溫度下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，放在4℃左右，濕度小于70％的條件下保藏．每間隔一定時間重新移植培養(yǎng)1次。一、定期移植保藏法（斜面低溫保藏法）1．原理3、特點(diǎn)（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的短期保藏，一般可保存1～6個月左右。（2）優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，容易推廣，存活率高；缺點(diǎn)：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。3、特點(diǎn)（二）石蠟油封藏法1、原理用液體石蠟防止或減少培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，降低微生物的代謝活動，推遲細(xì)胞老化，延長保存時間。2、方法在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。（二）石蠟油封藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蠟油管的轉(zhuǎn)接和搬運(yùn)不方便。（2）不適用于保藏某些能分解烴類的菌種。3、特點(diǎn)三、砂土管保藏法1、原理低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物2、方法將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口（或用石蠟封口），置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。三、砂土管保藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細(xì)菌，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌及酵母則不適用。（2）保藏期較長，約1～10年。效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡便。3、特點(diǎn)四、麩皮保藏法1、原理以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。2、方法將麩皮與水以一定的比例拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。四、麩皮保藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。（2）操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。3、特點(diǎn)五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理在較低的溫度下（一15℃以下），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。經(jīng)過冷凍干燥的微生物的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因此菌種可以保存很長時間。2、方法將準(zhǔn)備保存的新鮮斜面菌種，在無菌條件下，裝入滅菌的保護(hù)劑（常用脫脂牛奶和血清），制成菌懸液，再用無菌帶橡皮頭的滴管將菌懸液分裝到準(zhǔn)備好的安瓿管中，-35℃下預(yù)凍15min一2h，然后進(jìn)行真空干燥，最后將試管真空熔封，低溫避光保存。五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理3、特點(diǎn)（1）此法適用于各大類微生物。（2）此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護(hù)劑，保藏期一般長達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。（3）該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。3、特點(diǎn)六、液氮超低溫保藏法1、原理微生物在－130℃的低溫下，所有的代謝活動暫時停止而生命延續(xù)，微生物菌種得以長期保存?？赏ㄟ^加入保護(hù)劑來降低細(xì)胞內(nèi)溶液的冰點(diǎn)，減少冰晶對細(xì)胞的傷害。

2、方法取合適的培養(yǎng)物，以5～10％的甘油或二甲亞砜制成孢子懸液或菌懸液。將此懸液注入無菌的安瓿管或聚丙烯小管內(nèi)，密封，在液氮超低溫（－196℃）下保藏。六、液氮超低溫保藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）適用于各種微生物菌種的保藏。（2）保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。（3）優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。缺點(diǎn)：需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。3、特點(diǎn)菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡介菌種是一個國家的重要生物資源，所以菌種保藏是一項(xiàng)重要的菌物學(xué)工作。隨著科技的進(jìn)步和生產(chǎn)的發(fā)展，對菌物資源的利用正在不斷擴(kuò)大，所以菌種保藏工作顯得更加重要。為此，在一些發(fā)達(dá)國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)。其任務(wù)是廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂和便于研究、交換、使用的目的。菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡介菌種保藏機(jī)構(gòu)ATCC（美國典型菌種保藏中心）CMCC(中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心)NBRC(日本技術(shù)評價研究所生物資源中心)菌種保藏機(jī)構(gòu)第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義種子制備是抗生素發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序。種子制備：利用生產(chǎn)菌種，在一定的條件下，經(jīng)過擴(kuò)大繁殖，成為具有一定質(zhì)量和數(shù)量的純種，供給抗生素生產(chǎn)使用。種子制備：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義種子制備：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義作為種子的準(zhǔn)則：

菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理形狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。

作為種子的準(zhǔn)則：菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速

包括三個過程：1、孢子制備：生產(chǎn)大量孢子2、搖瓶種子制備：生產(chǎn)大量種子菌絲某些抗生素產(chǎn)生菌的孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度較緩慢，為了縮短種子罐培養(yǎng)周期和穩(wěn)定種子質(zhì)量，將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)罐，這就是所謂的搖瓶種子。3、種子罐種子制備種子制備是指孢于懸浮液或搖瓶種子接人種子罐后，在罐中繁殖成為大量菌絲的過程，從而縮短發(fā)酵罐繁殖苗絲的時間，增加合成抗生素的時間，種子罐種子經(jīng)移植到發(fā)酵罐后，進(jìn)一步繁越并產(chǎn)生抗生索。二、種子的制備過程二、種子的二、種子的制備過程二、種子的制備過程1、實(shí)驗(yàn)室種子制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式：孢子進(jìn)罐法、搖瓶菌絲進(jìn)罐法孢子進(jìn)罐法對于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。如：細(xì)菌、霉菌、一些放線菌（四環(huán)素、土霉素產(chǎn)生菌）等菌種1、實(shí)驗(yàn)室種子制備搖瓶菌絲進(jìn)罐法對于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。如鏈霉素產(chǎn)生菌搖瓶菌絲進(jìn)罐法2、生產(chǎn)車間種子制備實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，在罐中繁殖成大量菌絲的過程。（1）種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；所采用發(fā)酵罐的容積2、生產(chǎn)車間種子制備如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵如青霉菌，三級發(fā)酵確定種子罐級數(shù)需注意的問題種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。

確定種子罐級數(shù)需注意的問題（2）接種齡與接種量

種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達(dá)到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)來確定。嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。（2）接種齡與接種量

種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入接種量

接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中，大多數(shù)抗生素發(fā)酵的最適接種量為7％~18％，有時可增加到20％~28％。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。接種量接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。近年來，生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。雙種法，采用二只種子罐接一只發(fā)酵罐。倒種法，即以適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一發(fā)酵罐作種子。近年來，生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措三、種子質(zhì)量的影響因素與控制（一）影響因素1、原材料質(zhì)量生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。三、種子質(zhì)量的影響因素與控制（一）影響因素2、培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37?C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子斜面的培養(yǎng)溫度。（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。（3）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。2、培養(yǎng)條件（1）溫度3、培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因?yàn)樗ダ系逆咦右言谥鸩竭M(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。（2）冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。3、培養(yǎng)時間和冷藏時間（二）控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。菌種穩(wěn)定性的檢查無（雜菌）檢查（二）控制措施第二章思考題1、菌種選育的基本原理及主要方法有哪些？2、菌種保藏的主要方法有哪些？3、種子制備具體有哪三個過程？第二章思考題1、菌種選育的基本原理及主要方法有哪些？第四章菌種選育與保存第四章菌種選育與保存抗生素生產(chǎn)基于微生物本體可以產(chǎn)生抗生素，依賴于微生物機(jī)體在反應(yīng)器內(nèi)的生長繁殖及代謝過程來合成抗生素，通過分離純化進(jìn)行提取精制，并最終制劑成型來實(shí)現(xiàn)藥物生產(chǎn)的過程。抗生素生產(chǎn)制種：選取改良合適的菌種發(fā)酵：繁殖得到大量的菌體提取：從菌體中提取抗生素制種：選取改良合適的菌種

菌種選育理論與技術(shù)利用工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，決定生產(chǎn)水平高低最主要的有三個方面的因素：生產(chǎn)菌種，發(fā)酵工藝和后提取工藝。其中最重要的是生產(chǎn)菌種。菌種選育的最初目的是改良菌種的特性，使其符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。菌種選育理論與技術(shù)利用工業(yè)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的過產(chǎn)生抗生素的優(yōu)良菌種應(yīng)具備條件1.產(chǎn)量高；2.生長快；3.性能穩(wěn)定；4.容易培養(yǎng)。產(chǎn)生抗生素的優(yōu)良菌種應(yīng)具備條件菌種選育：根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)生產(chǎn)的要求用隨機(jī)方法或理性化方法進(jìn)行篩選，獲得目的變種。第一節(jié)菌種選育菌種選育：第一節(jié)菌種選育菌種選育的目的菌種選育的目的遺傳—DNA的半保留復(fù)制，保持物種的相對穩(wěn)定性變異—DNA4種核苷酸堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)、順序或數(shù)目發(fā)生變化，導(dǎo)致生物體表型的改變，通常稱為基因突變，這種表型改變可穩(wěn)定地一代一代傳遞下去。促使新性狀的產(chǎn)生、獲得新的優(yōu)良品種一、微生物的遺傳和變異

遺傳—DNA的半保留復(fù)制，保持物種的相對穩(wěn)定性一、微生物遺傳型變異：在遺傳物質(zhì)水平上發(fā)生了改變，從而引起某些相應(yīng)性狀發(fā)生改變的特性

變異性表型變異：微生物在生活條件發(fā)生改變時，發(fā)生暫時的形態(tài)、生理等特性的改變，但隨著環(huán)境條件的復(fù)原，它們又恢復(fù)了原有的特性遺傳變異：1、突變

2、重組突變：1、自發(fā)突變（10-7）

2、誘發(fā)突變（10-4），為育種主要手段。遺傳變異：1、突變（一）基因突變基因突變是指遺傳物質(zhì)（DNA）中的核苷酸發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化，主要包括點(diǎn)突變和染色體畸變兩大類。

1、點(diǎn)突變是由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變引起的。

2、染色體畸變是指DNA大段變化（損傷）的現(xiàn)象，主要包括染色體結(jié)構(gòu)上的變化和染色體數(shù)目的變化。（二）基因重組

指兩個或多個不同性狀個體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一個體細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)重新組合后，造成菌種變異，形成新的遺傳型個體。

（一）基因突變二、菌種選育的意義1、提高單位產(chǎn)量和改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量青霉素發(fā)酵：2g/ml→250g/ml→1000g/ml→70000g/ml1928年1943年1945年現(xiàn)在產(chǎn)黃色色素的原始菌種產(chǎn)黃青霉WisQ-176，產(chǎn)生黃色色素，提煉過程中難以去除，影響產(chǎn)品質(zhì)量，在菌種選育過程中獲得無色素突變型菌株，解決了產(chǎn)品質(zhì)量問題。二、菌種選育的意義2、改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業(yè)生產(chǎn)如選育抗噬菌體的菌株、能利用廉價的發(fā)酵原料或需氧量較小的菌株、改變菌種代謝產(chǎn)物的組成配比等。2、改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業(yè)生產(chǎn)二、菌種選育的經(jīng)典方法

1、自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。自發(fā)突變機(jī)制：自發(fā)突變產(chǎn)生原因：1、多因素低劑量長期綜合誘變的結(jié)果；2、自然界存在低濃度的誘變物質(zhì)；3、微生物自身產(chǎn)生的誘變物質(zhì)（咖啡堿、過氧化氫等）4、堿基互變異構(gòu)效應(yīng)。二、菌種選育的經(jīng)典方法1、自然選育二、菌種選育的經(jīng)典方法:自然選育特點(diǎn)：（1）能純化、復(fù)壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高平均生產(chǎn)水平。（2）難以選育高產(chǎn)突變菌株，不能使生產(chǎn)水平大幅度提高。二、菌種選育的經(jīng)典方法:自然選育特點(diǎn)：2、誘變育種誘變育種是指人工有意識地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的一種或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。特點(diǎn)：與自然選育比較，由于引進(jìn)了誘變劑處理，因而加速了菌種突變的頻率，擴(kuò)大了變異的幅度，從而提高了獲得優(yōu)良特性的突變株的幾率。2、誘變育種

物理誘變劑：紫外線、x射線、Y射線、快中子、β射線、超聲波、激光誘變劑化學(xué)誘變劑：氮芥、乙烯亞胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基甲基脲、亞硝酸生物誘變劑：噬菌體、轉(zhuǎn)座因子物理誘變劑：紫外線、x形成胸腺嘧啶二聚體，影響DNA復(fù)制物理誘變劑CTAGGATCCTAGGATC紫外線形成胸腺嘧啶二聚體，影響DNA復(fù)制物理誘變劑CTAGGATC是一些能和DNA起作用，改變其結(jié)構(gòu)，從而引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。如烷化劑、亞硝基類化合物，堿基類似物（5-溴尿嘧啶），吖啶類化合物。烷化鳥嘌呤與胸腺嘧啶錯誤配對化學(xué)誘變劑是一些能和DNA起作用，改變其結(jié)構(gòu)，從而引起遺傳變異的化學(xué)物1).烷化劑一類重要的誘變劑，可引起堿基的錯誤配對而引起的多種類型突變，如轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和移碼誘變，以及染色體畸變。使用最為廣泛的是亞硝基胍（NTG）和乙基磺酸乙酯（EMS），主要因?yàn)樗鼈儦⑺缆氏鄬^低，而獲得的突變頻率較高。2).嵌合劑常用有啞啶類染料、溴乙錠、ICR等化合物。能引起移碼突變。1).烷化劑3).堿基類似物分子結(jié)構(gòu)與DNA上的堿基相似的化合物稱為堿基類似物。如5-溴尿嘧啶（5-BU）、6-氨基嘌呤等。這些化合物干擾了DNA分子內(nèi)酮式與烯醇式的平衡。它們摻入DNA分子，使其出現(xiàn)烯醇的比例增加。分別形成AT向GC和GC向AT的轉(zhuǎn)換。4).亞硝酸主要是通過氧化脫氨基作用脫去DNA堿基上的氨基，如C氧化脫氨基成為U，A脫氨成為次黃嘌呤等。3).堿基類似物第四章菌種的選育和保存課件5).抗生素絲裂霉素C、放線菌素D等抗癌抗生素作用于DNA合成，從而干擾細(xì)胞正常分裂。3、生物誘變劑噬菌體：溶源性噬菌體是一種遺傳信息的傳遞者，因而人們把噬菌體看作是一種誘變劑。在選育抗噬菌體菌種時，噬菌體顯示出明顯的誘變效應(yīng)。轉(zhuǎn)座因子：轉(zhuǎn)座因子是一類能夠轉(zhuǎn)移位置的遺傳因子。5).抗生素誘變劑的選擇及影響誘變效果的因素（一）、誘變劑的選擇誘變劑作用：1、提高突變頻率；2、擴(kuò)大變異產(chǎn)生的幅度。合適劑量：凡是既能增加變異幅度，又能促使變異向正突變范圍移動的劑量就是合適的劑量。一般認(rèn)為高劑量（致死率在90%以上）引起的變異范圍大，變株比較多，適用于單位產(chǎn)量較低的菌株，而長期用于工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)過多次誘變選育的菌株，則宜用中等劑量（致死率為70%~80%），甚至更低。并且一般認(rèn)為低劑量可以提高正變率。誘變劑的選擇及影響誘變效果的因素（二）影響誘變效果的因素1、選擇合適的出發(fā)菌株即用來育種的原始菌株，多采用生產(chǎn)能力高，具有良好性狀的菌株作為親本。用作誘變的出發(fā)菌株必須產(chǎn)量高，生長速度快，營養(yǎng)要求低，產(chǎn)生孢子多，對誘變劑的敏感性大，變異幅度大。（二）影響誘變效果的因素2、采用分散狀態(tài)的孢子懸浮液處理誘變劑所處理的微生物一般要求呈懸浮狀態(tài)，并使細(xì)胞盡量處于分散狀態(tài)。有利于細(xì)胞均勻接觸誘變劑，也可以部分避免出現(xiàn)不純菌落。3、采用單核細(xì)胞處理誘變劑所處理的細(xì)胞中的細(xì)胞核愈少愈好，最好是處理單核細(xì)胞（用玻璃珠打散）。如處理霉菌或放線菌，則盡量采用孢子進(jìn)行處理。如是芽孢桿菌，則處理芽孢。4、注意微生物的生理狀態(tài)一般對數(shù)期的細(xì)菌對誘變最為敏感。讓霉菌或放線菌的分生孢子稍稍萌發(fā)，可以提高誘變效果。2、采用分散狀態(tài)的孢子懸浮液處理5、適宜的誘變方法兩種或多種誘變劑先后使用；同一誘變劑重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑同時使用。誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)。同時,抗生素產(chǎn)量是數(shù)量性狀,是微效多基因作用的結(jié)果,即抗生素的增產(chǎn)是一種累積效應(yīng)。因此,這種復(fù)合誘變應(yīng)多次循環(huán)進(jìn)行,誘變效果會更理想。5、適宜的誘變方法四、突變株的篩選1、隨機(jī)篩選指菌種經(jīng)過誘變處理后，僅憑經(jīng)驗(yàn)隨機(jī)篩選菌落。（1）肉眼觀察法排除低產(chǎn)菌落：經(jīng)驗(yàn)性（2）瓊脂塊法排除低產(chǎn)菌落：春日霉素的篩選，提高效率，穩(wěn)定性差（3）直接搖瓶篩選法：準(zhǔn)確性高，但工作量大，效率低四、突變株的篩選肉眼觀察法排除低產(chǎn)菌落：比如，在四環(huán)素突變株篩選過程中人們發(fā)現(xiàn)，突變株的菌落形態(tài)與四環(huán)素發(fā)酵效價之間存在有一定的對應(yīng)關(guān)系。即菌落呈圓形或梅花形、表面粗糙、孢子鼠灰色或深灰色、孢子量大、豐滿且菌落較小的突變株,往往是發(fā)酵效價得以提高的表現(xiàn)。

肉眼觀察法排除低產(chǎn)菌落：又如在康樂霉素C產(chǎn)生菌在紫外線處理過程中發(fā)現(xiàn)了自然分離過程中沒有的形態(tài)變異,對各種菌落形態(tài)與產(chǎn)量的正變關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(以抑菌圈比出發(fā)實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌圈大10%以上的菌株為正變菌株)。菌落形態(tài)有草帽型、饅頭型、中間開花型及小菌落。草帽型是最常見的,而中間開花的與之形態(tài)相近,只不過草帽型中間是一個尖,而開花型中間裂開花。小菌落是紫外處理出現(xiàn)的少量菌落,而自然分離中未發(fā)現(xiàn)。草帽型有穩(wěn)定的高正變率。又如在康樂霉素C產(chǎn)生菌在紫外線處理過程中發(fā)現(xiàn)了自然分離過程中2、半理性化篩選隨著人們對抗生素生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)制的了解不斷深入，產(chǎn)生了推理選育技術(shù)。指運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進(jìn)行設(shè)計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株的篩選方法。2、半理性化篩選如氯霉素的生物合成過程中，芳基胺合成酶為關(guān)鍵酶，當(dāng)氯霉素濃度到達(dá)100u/ml時，可完全抑制該酶的合成。因此，可以考慮選育解除終端產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)的突變株。類似還有：新生霉素影響產(chǎn)生菌的琥珀酸脫氫酶活力、制霉菌素影響醛縮酶活力，瑞斯托霉素影響磷酸甘油醛脫氫酶活力等。如氯霉素的生物合成過程中，芳基胺合成酶為關(guān)鍵酶，當(dāng)氯霉素濃度在青霉素發(fā)酵過程中加入苯乙酸或苯氧乙酸作為前體，分別能合成青霉素G和V。但培養(yǎng)基中過量的前體有較強(qiáng)毒性，且可抑制終產(chǎn)物生物合成。選育對毒性前體的抗性突變株，可消除反饋抑制作用。又如氯化物是灰黃霉素發(fā)酵前體，選用耐氯化物的變株，提高灰黃霉素產(chǎn)量。在青霉素發(fā)酵過程中加入苯乙酸或苯氧乙酸作為前體，分別能合成青三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離，篩選出具有新性狀的菌株。優(yōu)點(diǎn)：能集中位于不同品種中的優(yōu)良性狀。缺點(diǎn)：只能利用已有的基因組，并不能產(chǎn)生新的基因。雜交進(jìn)程緩慢，過程繁瑣。三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株2、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用融合劑（如聚乙二醇）促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。

細(xì)胞（A+B—）

細(xì)胞（A—B+）

脫壁處理

脫壁處理

原生質(zhì)體（A+B—）

原生質(zhì)體（A—B+）

混合

加融合劑

原生質(zhì)體融合

涂平板（原生質(zhì)體再生）

形成菌落

檢出重組子菌落（A+B+）

2、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生3、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）是指按照人的意志，將某一生物體(供體)的遺傳信息在體外經(jīng)人工與載體相接(重組)，構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一生物體(受體)細(xì)胞中，使被引進(jìn)的外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達(dá)和遺傳。3、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）自20世紀(jì)，80年代以來，對鏈霉素抗生素產(chǎn)生菌分子遺傳學(xué)的研究取得較大進(jìn)展。對多種抗生素的生物合成基因進(jìn)行了不同程度的研究。比如：1、增加限速酶基因拷貝數(shù)，提高菌種生產(chǎn)能力限速步驟：在抗生素合成過程中，某些步驟對整個生物合成是至關(guān)重要的。限速酶：控制限速步驟的酶叫限速酶，通過增加限速酶基因的劑量，可能會緩解限速酶引起的“瓶頸”效應(yīng)。如構(gòu)建基因工程菌，將編碼限速酶的基因克隆至載體，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)菌株，可篩得高產(chǎn)菌株。自20世紀(jì)，80年代以來，對鏈霉素抗生素產(chǎn)生菌分子遺傳學(xué)的研2、引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因，增加抗生素單位產(chǎn)量許多抗生素生物合成基因經(jīng)常與菌種對自身抗生素耐藥基因連鎖存在，因此可利用高拷貝質(zhì)粒的基因劑量，提高菌種對自身抗生素的抗性，可提高抗生素產(chǎn)量。另外，調(diào)節(jié)基因在抗生素的生物合成中也起很重要的作用，增加正調(diào)節(jié)基因的拷貝數(shù)也能大幅度地提高次級代謝物的合成能力。2、引入抗性基因和調(diào)節(jié)基因，增加抗生素單位產(chǎn)量3、引入血紅蛋白基因，改善微生物的工業(yè)狀況70年代末在專性好氧菌透明顫菌(Vit-reoscilla)中發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白(VHb),這是迄今在原核生物中發(fā)現(xiàn)的唯一一種血紅蛋白。對VHb的功能研究表明,它作為一個氧氣攜帶者,能促進(jìn)氧氣擴(kuò)散到細(xì)胞末端氧化酶上,使細(xì)胞在貧氧狀態(tài)下也能很好地生長。3、引入血紅蛋白基因，改善微生物的工業(yè)狀況可將Vgb通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌中,在限氧條件下不僅使菌體生長量增加,還使其放線紫紅素產(chǎn)量提高。也可將Vgb引入產(chǎn)黃頂頭孢霉菌及產(chǎn)黃青霉菌中,限氧時VHb在前者的表達(dá)量較高,而且頭孢菌素C的產(chǎn)量比對照菌株提高5倍。但這些實(shí)驗(yàn)僅在“限氧”這個特定條件下進(jìn)行，而在工業(yè)發(fā)酵上，它的表達(dá)量很低，沒有顯示出產(chǎn)量增加優(yōu)勢，還有待進(jìn)一步深入研究?？蓪gb通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌中,在限氧條件菌種的退化

退化：連續(xù)傳代基因突變

環(huán)境不良污染雜菌生產(chǎn)能力下降抵抗不良環(huán)境條件能力減弱菌種的退化退化：生產(chǎn)能力下降第二節(jié)菌種保藏

定義：將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持菌種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。條件及原理：

1.

低營養(yǎng)

2.

干燥

3.隔氧

4.低溫降低代謝速率或使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)第二節(jié)菌種保藏定義：降低代謝速率或使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)一、定期移植保藏法

（斜面低溫保藏法）1．原理制造低溫環(huán)境，降低菌種的新陳代謝活動能力。2、方法將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上、置最適溫度下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，放在4℃左右，濕度小于70％的條件下保藏．每間隔一定時間重新移植培養(yǎng)1次。一、定期移植保藏法（斜面低溫保藏法）1．原理3、特點(diǎn)（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的短期保藏，一般可保存1～6個月左右。（2）優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，容易推廣，存活率高；缺點(diǎn)：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。3、特點(diǎn)（二）石蠟油封藏法1、原理用液體石蠟防止或減少培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，降低微生物的代謝活動，推遲細(xì)胞老化，延長保存時間。2、方法在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。（二）石蠟油封藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蠟油管的轉(zhuǎn)接和搬運(yùn)不方便。（2）不適用于保藏某些能分解烴類的菌種。3、特點(diǎn)三、砂土管保藏法1、原理低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物2、方法將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口（或用石蠟封口），置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。三、砂土管保藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細(xì)菌，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌及酵母則不適用。（2）保藏期較長，約1～10年。效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡便。3、特點(diǎn)四、麩皮保藏法1、原理以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。2、方法將麩皮與水以一定的比例拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。四、麩皮保藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。（2）操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。3、特點(diǎn)五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理在較低的溫度下（一15℃以下），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。經(jīng)過冷凍干燥的微生物的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因此菌種可以保存很長時間。2、方法將準(zhǔn)備保存的新鮮斜面菌種，在無菌條件下，裝入滅菌的保護(hù)劑（常用脫脂牛奶和血清），制成菌懸液，再用無菌帶橡皮頭的滴管將菌懸液分裝到準(zhǔn)備好的安瓿管中，-35℃下預(yù)凍15min一2h，然后進(jìn)行真空干燥，最后將試管真空熔封，低溫避光保存。五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理3、特點(diǎn)（1）此法適用于各大類微生物。（2）此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護(hù)劑，保藏期一般長達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。（3）該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。3、特點(diǎn)六、液氮超低溫保藏法1、原理微生物在－130℃的低溫下，所有的代謝活動暫時停止而生命延續(xù)，微生物菌種得以長期保存?？赏ㄟ^加入保護(hù)劑來降低細(xì)胞內(nèi)溶液的冰點(diǎn)，減少冰晶對細(xì)胞的傷害。

2、方法取合適的培養(yǎng)物，以5～10％的甘油或二甲亞砜制成孢子懸液或菌懸液。將此懸液注入無菌的安瓿管或聚丙烯小管內(nèi)，密封，在液氮超低溫（－196℃）下保藏。六、液氮超低溫保藏法1、原理3、特點(diǎn)（1）適用于各種微生物菌種的保藏。（2）保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前公認(rèn)的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。（3）優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏。缺點(diǎn)：需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。3、特點(diǎn)菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡介菌種是一個國家的重要生物資源，所以菌種保藏是一項(xiàng)重要的菌物學(xué)工作。隨著科技的進(jìn)步和生產(chǎn)的發(fā)展，對菌物資源的利用正在不斷擴(kuò)大，所以菌種保藏工作顯得更加重要。為此，在一些發(fā)達(dá)國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)。其任務(wù)是廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂和便于研究、交換、使用的目的。菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡介菌種保藏機(jī)構(gòu)ATCC（美國典型菌種保藏中心）CMCC(中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心)NBRC(日本技術(shù)評價研究所生物資源中心)菌種保藏機(jī)構(gòu)第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義種子制備是抗生素發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序。種子制備：利用生產(chǎn)菌種，在一定的條件下，經(jīng)過擴(kuò)大繁殖，成為具有一定質(zhì)量和數(shù)量的純種，供給抗生素生產(chǎn)使用。種子制備：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義種子制備：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。第五節(jié)生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)（種子制備）一、定義作為種子的準(zhǔn)則：

菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；生理形狀穩(wěn)定；菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；無雜菌污染；保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。

作為種子的準(zhǔn)則：菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速

包括三個過程：1