大鼠中樞g(shù)hrelin和GHS-R的分布及其促胃腸動(dòng)力作用,人體生理學(xué)論文

大鼠中樞g(shù)hrelin和GHS-R的分布及其促胃腸動(dòng)力作用,人體生理學(xué)論文Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growthhor-monesecretagoguereceptor，GHS-R)的內(nèi)源性配體，主要由胃黏膜組織中的泌酸細(xì)胞分泌。Ghrelin的生物學(xué)作用特別廣泛，可促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌;調(diào)節(jié)攝食和能量代謝;刺激胃動(dòng)力和胃酸分泌;調(diào)節(jié)心血管功能等。新近研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin與消化道運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，外周和中樞給予ghrelin可加速胃排空，改善術(shù)后腸梗阻，促進(jìn)胃和十二指腸消化間期復(fù)合肌電活動(dòng)。Gong等用蛋白印跡方式方法和聚合酶鏈反響(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)發(fā)現(xiàn)GHS-R在大鼠的下丘腦有表示出;Gnanapavan等用PCR技術(shù)證實(shí)，ghrelin和GHS-R在人的胃、小腸、結(jié)腸、胰腺、膽囊、肺臟、垂體、卵巢、血管等處均有表示出;Dass和Xu等利用熒光免疫組織化學(xué)方式方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結(jié)腸也發(fā)現(xiàn)了ghrelin及其受體。然而，關(guān)于ghrelin和GHS-R在中樞的組織細(xì)胞學(xué)分布及表示出量的比擬尚未見(jiàn)報(bào)道。除此之外，由于新鮮腦組織比擬難以斷定各核團(tuán)的精到準(zhǔn)確界限，PCR及蛋白印跡技術(shù)只能分離出大鼠的部分腦區(qū)(如海馬和下丘腦)，不能分離出華而不實(shí)包括的微小核團(tuán)和亞核團(tuán)，并進(jìn)行表示出量比擬。因而，作者采用免疫組織化學(xué)和圖像分析方式方法觀察大鼠中樞g(shù)hrelin和GHS-R的分布，重點(diǎn)分析比擬二者在與消化功能相關(guān)腦區(qū)的表示出，為說(shuō)明中樞給予ghrelin的促胃腸動(dòng)力作用提供理論根據(jù)。1材料與方式方法1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康純種Sprague-Dawley大鼠8只，雌雄不拘，體質(zhì)量220～240g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1．2主要試劑與儀器兔抗人GHS-R抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司，兔抗鼠ghrelin抗體購(gòu)自美國(guó)鳳凰生物制品有限公司，鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(strept-avidin-biotincomplex，SABC)羊抗兔免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，Q550CW型圖像采集與分析系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。1．3取材與標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)大鼠用含100gL－1的水合氯醛400mgkg－1腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室穿刺至主動(dòng)脈，用生理鹽水快速?zèng)_血管，含40gL－1的多聚甲醛緩沖液經(jīng)升主動(dòng)脈灌注。取出大腦和小腦，切成厚4mm小塊，40gL－1的多聚甲醛緩沖液固定8h，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～30%的蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍后，組織包埋劑包埋，恒冷冰凍切片機(jī)切片。腦片行連續(xù)切片，厚15m。1．4免疫組織化學(xué)染色用SABC法進(jìn)行g(shù)hrelin和GHS-R的免疫組織化學(xué)染色。詳細(xì)步驟如下:冷凍切片用磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline，PBS)浸泡5min，參加檸檬酸緩沖液(pH6．0)，微波修復(fù)，晾至室溫，PBS沖洗3次，每次5min;體積分?jǐn)?shù)3%的過(guò)氧化氫溶液(hydrogenperoxide，H2O2)浸泡30min，PBS沖洗3次，每次5min;體積分?jǐn)?shù)0．5%的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)浸泡20min，PBS沖洗3次，每次5min。體積分?jǐn)?shù)10%正常山羊血清封閉(37℃，30min)，甩去多余液體，切片分別滴加兔抗鼠ghrelin抗體(1:2500)和兔抗人GHS-R抗體(1:100)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5min，滴加羊抗兔抗體(37℃，40min)，PBS沖洗3次，每次10min，滴加生物素化的辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(avidin-biotinylatedhorseradishperoxidasecomplex，ABC)(37℃，20min)。PBS沖洗3次，每次10min，DAB顯色，中性樹(shù)膠封片，用圖像分析系統(tǒng)觀察ghre-lin和GHS-R陽(yáng)性表示出。用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，其余步驟不變。本實(shí)驗(yàn)選取與消化功能相關(guān)的核團(tuán)進(jìn)行重點(diǎn)觀察，并分析了ghrelin和GHS-R陽(yáng)性反響細(xì)胞在各核團(tuán)不同分區(qū)的表示出。中樞陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):每只大鼠計(jì)數(shù)5張切片，每張切片在陽(yáng)性細(xì)胞最密集處隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值作為該切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。對(duì)每只大鼠同一腦區(qū)的ghrelin和GHS-R陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)時(shí)必須選擇在一樣平面。1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，免疫反響陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x珋s)表示，多組間比擬采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2．1Ghrelin與GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞的染色特征在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ghrelin與GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于多個(gè)腦區(qū)，二者的陽(yáng)性表示出類似，陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著，細(xì)胞核無(wú)棕黃色顆粒沉著。二者的免疫強(qiáng)陽(yáng)性反響在大腦皮質(zhì)、下丘腦、丘腦室周核、海馬(hippocamp，HIP)、杏仁核、小腦及腦干等部位均可見(jiàn)(圖1、圖2)?！緢D1-2略】2．2Ghrelin和GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞在與消化道功能相關(guān)腦區(qū)的表示出在下丘腦區(qū)室旁核(periven-tricularnucleus，PVN)、弓狀核(arcuatenucleus，ARC)、視前核(preopticnucleus，PON)、視上核(su-praopticnucleus，SON)、下丘腦外側(cè)區(qū)(lateralhypo-thalamicarea，LH)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedialhypothalamicnucleus，VMH)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(dor-somedialhypothalamicnucleus，DMH)、下丘腦背側(cè)核(dorsalhypothalamicnucleus，DO)等處均可見(jiàn)ghre-lin及GHS-R陽(yáng)性反響細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜為棕黃色顆粒沉著，細(xì)胞核無(wú)棕黃色顆粒沉著。華而不實(shí)，ghrelin在PVN和LH陽(yáng)性反響最強(qiáng)，免疫反響陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為116．317．76和107．028．80，明顯高于ARC(75．125．59)、DMH(56．847．07)和VMH(62．546．93)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1、圖3);GHS-R在PVN和ARC陽(yáng)性反響強(qiáng)，免疫反響陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為111．0611．80和97．0610．37，明顯高于LH(74．706．04)、DMH(58．657．28)和VMH(48．246．58)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);陽(yáng)性細(xì)胞染色深，數(shù)目多，細(xì)胞體呈圓形或橢圓形，多數(shù)細(xì)胞有粗短突起。其余核團(tuán)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少，分布稀疏，染色呈淡黃色(圖2、圖3)?！緢D3】Ghrelin和GHS-R在HIP的CA1、CA2、CA3、CA4區(qū)的顆粒層均有分布，細(xì)胞多數(shù)呈橢圓形，細(xì)胞膜呈深棕色，細(xì)胞體較小，分布密集。華而不實(shí)，ghrelin在CA3區(qū)陽(yáng)性反響最強(qiáng)，免疫反響陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為123．2011．17，明顯高于CA1(67．466．93)、CA2(37．915．21)、CA4(59．966．73)區(qū)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)(圖1、圖4);GHS-R在CA3和CA4區(qū)均有強(qiáng)陽(yáng)性反響，免疫反響陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為103．799．23和86．487．25，明顯高于CA1(51．166．56)、CA2(43．395．11)區(qū)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。錐體細(xì)胞層可見(jiàn)二者的強(qiáng)陽(yáng)性反響(圖2、圖4)，細(xì)胞膜著深棕色，細(xì)胞體較大，呈圓形、橢圓形或錐形，突起粗短，著色明顯，細(xì)胞質(zhì)淡染。二者在分子層均未見(jiàn)著色?！緢D4】在杏仁核區(qū)，ghrelin和GHS-R陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)為棕色顆粒沉著，細(xì)胞核不著色。二者均在杏仁內(nèi)側(cè)核(medialamygdaloidnucleus，Me)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為140．229．07和115．667．35，明顯高于杏仁基底內(nèi)側(cè)核(basomedialnucleusoftheamygdale，BM)(67．847．36)、杏仁基底外側(cè)核前部(anteriordivi-sionofthebasolateralnucleusoftheamygdale，BLA)(33．464．24)、杏仁基底外側(cè)核后部(posteriordi-visionofthebasolateralnucleusoftheamygdale，BLP)(43．066．24)、杏仁核(centralamygdaloidnu-cleus，CeA)(22．583．60)、杏仁外側(cè)核(laterala-mygdaloidnucleus，LA)(31．955．77)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)(圖1、圖2、圖5)，細(xì)胞體多數(shù)呈橢圓形，細(xì)胞膜為深棕色，很多細(xì)胞有短粗突起。Ghrelin在BLA與BLP也有較多陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞體較大，有短粗突起，形態(tài)以圓形居多，細(xì)胞膜染色呈淡棕色。GHS-R在BM有較多陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞體較小，呈圓形或橢圓形，染色呈棕黃色。在CeA和LA，二者的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少，細(xì)胞體較小，染色呈淡黃色。2．3Ghrelin和GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞在中樞其他部位的表示出在大腦皮層區(qū)，各層均有g(shù)hrelin與GHS-R陽(yáng)性反響細(xì)胞。二者在分子層、外顆粒層、多形細(xì)胞層陽(yáng)性反響均較弱，染色呈淡黃色，陽(yáng)性細(xì)胞輪廓不清楚明晰，體積較小，形態(tài)以圓形和橢圓形居多，還可見(jiàn)梭形細(xì)胞。在內(nèi)顆粒層和外錐體細(xì)胞層，ghrelin陽(yáng)性反響較強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，輪廓清楚明晰，形態(tài)呈圓形或橢圓形，無(wú)突起染色，細(xì)胞核不著色。GHS-R陽(yáng)性表示出在外錐體細(xì)胞層較多，內(nèi)顆粒層較弱。在內(nèi)錐體細(xì)胞層，GHS-R和ghrelin陽(yáng)性反響均較強(qiáng)(圖1、圖2)，細(xì)胞呈棕黃色，突起染色明顯，細(xì)胞核不著色，形態(tài)多為錐形?！緢D5】在小腦蒲肯野細(xì)胞，ghrelin與GHS-R均呈強(qiáng)陽(yáng)性反響(圖1、圖2)，細(xì)胞胞體大，呈梨形，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著深棕色，突起無(wú)明顯著色。二者陽(yáng)性反響在小腦的分子層和顆粒層較弱，細(xì)胞小而圓，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。除此之外，在前庭神經(jīng)上核、外側(cè)核、中縫核、小細(xì)胞網(wǎng)狀核和面神經(jīng)核等處均可見(jiàn)ghrelin和GHS-R陽(yáng)性細(xì)胞。在延髓，ghrelin與GHS-R均有強(qiáng)陽(yáng)性反響(圖1、圖2)，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈深棕色，細(xì)胞體呈多形性，有明顯突起。在孤束核、迷走神經(jīng)背核、延髓網(wǎng)狀核及最后區(qū)等處可以見(jiàn)ghrelin和GHS-R陽(yáng)性細(xì)胞。3討論新近研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin與消化道運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，可促進(jìn)攝食和胃排空，增加胃酸分泌，加速小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，有效改善術(shù)后腸梗阻。近來(lái)的研究多關(guān)注于ghrelin的組織分布，已有研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有分布，主要由胃黏膜內(nèi)分泌細(xì)胞(主要為X/A樣細(xì)胞)分泌，在小腸、腎臟、下丘腦、腺垂體、胰腺、甲狀腺、心臟、卵巢及胎盤(pán)等處也有少量分泌，可通過(guò)內(nèi)分泌或旁分泌形式作用于受體，在局部發(fā)揮作用。但對(duì)其受體GHS-R分布的研究并不充分。以往研究發(fā)現(xiàn)，GHS-R主要分布于垂體、下丘腦和胃，在心臟、肺、胰腺、腸、脂肪組織及腎也有分布，介入調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與能量代謝。當(dāng)前，關(guān)于二者在中樞各腦區(qū)的組織學(xué)定位及微小核團(tuán)和亞核團(tuán)的表示出水平比擬尚未見(jiàn)報(bào)道。作者就此進(jìn)行了進(jìn)一步研究，并重點(diǎn)分析了二者在與消化功能密切相關(guān)腦區(qū)的表示出水平比擬。研究結(jié)果顯示，GHS-R在大鼠中樞廣泛存在，陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核不著色，細(xì)胞膜著黃色或棕黃色，細(xì)胞質(zhì)有少量著色，主要分布于大腦皮質(zhì)、下丘腦、丘腦室周核、HIP、杏仁核、小腦及腦干等部位。以往研究用蛋白印跡法和PCR技術(shù)證實(shí)GHS-R在中樞和外周均有表示出，用熒光免疫組織化學(xué)方式方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結(jié)腸腸神經(jīng)叢也發(fā)現(xiàn)ghrelin及GHS-R。本研究結(jié)果與其結(jié)果相符，并在這里基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了二者在與消化功能密切相關(guān)腦區(qū)(包括核團(tuán)及亞核團(tuán))的表示出。下丘腦位于間腦的腹側(cè)部，構(gòu)成第3腦室下部的底壁和側(cè)壁。除介入神經(jīng)內(nèi)分泌、水電解質(zhì)代謝和體溫調(diào)節(jié)等功能的調(diào)整，下丘腦也是調(diào)節(jié)攝食和消化道運(yùn)動(dòng)的重要中樞。下丘腦從前向后分為3個(gè)區(qū):視上部位于視穿插上方，由SON和PVN組成;結(jié)節(jié)部位于漏斗的后方;乳頭部位于乳頭體。下丘腦與其他腦區(qū)有復(fù)雜而廣泛的纖維聯(lián)絡(luò)，它不僅接受來(lái)自大腦皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)、腦干的傳入纖維，還發(fā)出大量的纖維到達(dá)大腦皮質(zhì)、邊緣系統(tǒng)、中腦、腦橋和延髓。下丘腦能通過(guò)3種途徑對(duì)機(jī)體進(jìn)行調(diào)節(jié):(1)由下丘腦核發(fā)出的下行傳導(dǎo)束到達(dá)腦干和脊髓的植物性神經(jīng)中樞，再通過(guò)植物性神經(jīng)調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng);(2)下丘腦的SON和PVN發(fā)出的纖維構(gòu)成下丘腦-垂體束到達(dá)神經(jīng)垂體，兩核分泌的加壓素(抗利尿激素)和催產(chǎn)素沿此束流到神經(jīng)垂體內(nèi)儲(chǔ)存，在神經(jīng)調(diào)節(jié)下釋放入血液循環(huán);(3)下丘腦可分泌多種多肽類神經(jīng)激素對(duì)腺垂體的分泌起特異性刺激作用或抑制作用，稱為釋放激素或抑制釋放激素。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin的促胃腸動(dòng)力作用與下丘腦密切相關(guān)，下丘腦ARC可介入調(diào)節(jié)其促動(dòng)力作用。以往研究證實(shí)，大鼠腦內(nèi)存在ghrelin和GHS-R，主要分布于下丘腦，但并未研究其在下丘腦主要亞核團(tuán)的表示出。本研究結(jié)果顯示，ghrelin和GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞在下丘腦PVN、ARC、LH、VMH、DMH等處均有分布。Ghrelin免疫陽(yáng)性細(xì)胞在LH和PVN居多，GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞在PVN和ARC居多。這提示在消化道運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)中，下丘腦發(fā)揮著重要作用，ghrelin可能通過(guò)PVN、ARC及LH發(fā)揮其生理學(xué)作用。HIP不僅與認(rèn)知功能如學(xué)習(xí)、情感、記憶有關(guān)，也是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)的重要中樞，它與下丘腦、杏仁核、延髓髓質(zhì)有著極其復(fù)雜的互相聯(lián)絡(luò)，在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的進(jìn)食行為、飽感及胃腸運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。HIP構(gòu)造由HIP本部、齒狀回、下托、束狀回和灰被組成。它從室間孔處延至側(cè)腦室下腳頂部，全形呈弓形。根據(jù)HIP本部的細(xì)胞構(gòu)筑可再將其劃分為4個(gè)亞區(qū)，分別命名為CA1、CA2、CA3及CA4區(qū)，CA4區(qū)與下托相連接。齒狀回的皮質(zhì)分為分子層、顆粒層和多形層。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GHS-R免疫陽(yáng)性細(xì)胞在HIP各區(qū)均有分布。HIP在解剖構(gòu)造上屬于邊緣前腦皮質(zhì)構(gòu)造，邊緣系統(tǒng)不是一個(gè)獨(dú)立的解剖學(xué)和功能性實(shí)體，它是管理學(xué)習(xí)經(jīng)歷體驗(yàn)、整合新近與既往經(jīng)歷體驗(yàn)，同時(shí)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)種種行為和情