內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性、分離純化和功能綜述,人體解剖學(xué)論文

內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性、分離純化和功能綜述,人體解剖學(xué)論文內(nèi)皮祖細(xì)胞〔endothelialprogenitorcells,EPCs〕是一群存在于臍帶血、成人骨髓和外周血、能增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的幼稚細(xì)胞。該類細(xì)胞不僅介入胚胎期血管生成，同時(shí)也在出生后血管新生和損傷血管修復(fù)經(jīng)過中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1].大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和早期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示清楚，EPCs移植可促進(jìn)機(jī)體損傷部位新生血管的構(gòu)成和受損血管的再內(nèi)皮化，加快組織或器官的再生和功能恢復(fù)[2-4].近來研究發(fā)現(xiàn)，移植到體內(nèi)的EPCs不是通過本身增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞介入血管新生和組織再生，而主要是通過旁分泌機(jī)制發(fā)動(dòng)、激活內(nèi)源性內(nèi)皮細(xì)胞和其他相關(guān)細(xì)胞介入組織修復(fù)[1,4-6].胞外囊泡〔extracellularvesicles,EVs〕是細(xì)胞旁分泌的生物活性物質(zhì)之一，在細(xì)胞間信息傳遞經(jīng)過中扮演著極為重要的角色[7-8].在EVs的構(gòu)成經(jīng)過中，會(huì)選擇性地分揀、富集與來源細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)、mRNAs和微小RNAs〔microRNAs,miRNAs〕等信號分子，這些信號分子在EVs與靶細(xì)胞互相作用后被釋放到靶細(xì)胞中，并在靶細(xì)胞中繼續(xù)發(fā)揮功能[7-8].近年已有不少研究報(bào)道EVs具有類似于干/祖細(xì)胞的組織修復(fù)功能[9-11],但當(dāng)前有關(guān)EPCs源性EVs〔EPC-EVs〕的研究尚處于初期階段。本文主要就EPC-EVs的生物學(xué)特性、分離純化和功能方面的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。1EPC-EVs的生物學(xué)特性EVs是指由細(xì)胞來源的脂質(zhì)雙分子層包繞的球囊狀構(gòu)造，包括微泡〔microvesicles,MVs〕和外泌體〔exosomes〕，二者具有不同的生物學(xué)特征，其主要區(qū)別在于構(gòu)成方式和直徑大小[7].MVs又稱脫落小體、微粒體，早在1946年Chargaf等[12]就提出了這一概念。MVs是細(xì)胞直接由胞質(zhì)膜出芽、脫落而釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的膜性小囊泡，透射電鏡下觀察其形態(tài)不均一，直徑通常在100~1000?nm,但可以能1?m或100nm[7].1981年Trams等[13]在利用透射電鏡測量正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的MVs時(shí)，發(fā)現(xiàn)除了一群直徑為500~1000nm的小囊泡〔即MVs〕外，還存在另外一群更小的囊泡狀物質(zhì)，其平均直徑為40nm.6年后，Johnstone等[14]將這種直徑100?nm的膜性囊泡正式命名為exosomes.Exosomes起源于細(xì)胞內(nèi)多泡體〔multivesicularbodies,MVBs〕，在MVBs與細(xì)胞膜融合后被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中[7,15];同源性exosomes形態(tài)均一、大小相近，不同來源的exosomes直徑能夠不同，但基本介于40~100?nm[7,15-17].然而，當(dāng)前有關(guān)exosomes與MVs的命名經(jīng)常混淆，有些研究者甚至將二者混為一談[18].如關(guān)于EPCs源性MVs的研究中，有較多研究者在定義MVs時(shí)采用的是exosomes的概念，但在鑒定這些MVs表型時(shí)采用的不是exosomes的特定標(biāo)志物，而是MVs的常規(guī)標(biāo)志物，混淆了MVs和exosomes的概念和特征。這些研究分離純化所得的MVs直徑多為60~160?nm[19-22],由于在該直徑范圍中的囊泡包括MVs和exosomes,故這些MVs很可能是兩種囊泡的混合物。也有部分研究者分離所得的EPCs源性MVs直徑在100~500nm[23]或1m左右[24],這更符合MVs的特點(diǎn)。當(dāng)前尚無研究明確報(bào)道EPCs源性exosomes的特性，但已有研究者初步探究了CD34+干細(xì)胞群〔EPCs是該干細(xì)胞群中的一類細(xì)胞〕來源的exosomes的相關(guān)特點(diǎn)。Sahoo等[25]從成人外周血中分選出CD34+干細(xì)胞群，并在培養(yǎng)上清中分離得到了大量exosomes,其直徑為40~60nm.提示人外周血源性EPCs分泌的exosomes直徑可以能在該范圍內(nèi)。除了透射電鏡觀察外，外表標(biāo)志物檢測是鑒定exosomes和MVs的另一必不可少的環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，某些蛋白質(zhì)〔如CD9、CD63、CD81和TSG101等〕在各種細(xì)胞來源的exosomes上均有分布，它們在exosomes的構(gòu)成、釋放等經(jīng)過中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7].因此研究者將這些蛋白質(zhì)作為exosomes的通用標(biāo)志物應(yīng)用于相關(guān)鑒定中。然而，當(dāng)前研究者尚未發(fā)現(xiàn)MVs外表的特定標(biāo)志物，其脂質(zhì)成分、膜蛋白的組成和密度還有待進(jìn)一步研究[7].現(xiàn)前階段主要用L-選擇素、整合素4和1等非特異性分子作為標(biāo)志物，這些分子在MVs與靶細(xì)胞的互相作用經(jīng)過中扮演重要角色[7,19-22,24,26-27].研究表示清楚，exosomes和MVs中還含有與來源細(xì)胞相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)、核酸等成分。如CD34+干細(xì)胞群分泌的exosomes表示出CD34蛋白分子[25];EPCs源性MVs表示出其來源細(xì)胞EPCs的特異性標(biāo)志物〔如CD31、CD34和VEGF受體2等〕，而不表示出血小板相關(guān)標(biāo)志物P-選擇素和CD42b以及單核細(xì)胞標(biāo)志物CD14[19-24,26-27];除此之外，EPCs源性MVs還富集了EPCs的血管新生相關(guān)mRNAs和miRNAs等[19-24,26-27].2EPC-EVs的分離純化當(dāng)前，大部分研究者主要從EPCs的培養(yǎng)上清液〔也稱條件培養(yǎng)基〕中提取EPC-EVs[19-24,26-27].為了避免血清源性EVs的影響，研究者通常會(huì)在收集EPCs條件培養(yǎng)基的前一天更換EPCs培養(yǎng)基中的血清，使其在無血清狀態(tài)下生長24h,然后再收集細(xì)胞上清液。也有少數(shù)研究者為了探究外周血中EPC-EVs的相關(guān)特性，直接從血漿標(biāo)本中提取EPC-EVs[28-29].為獲得純度較高的EPC-EVs,研究者會(huì)在分離EPC-EVs前將所得血漿標(biāo)本進(jìn)行離心〔11000g、2?min或3000g、15min〕，以去除混雜華而不實(shí)的大量血小板[28-29].現(xiàn)前階段用于分離純化EVs的方式方法有差速離心法、密度梯度離心法、微孔過濾技術(shù)、免疫磁珠分選和商品化試劑盒等，華而不實(shí)以差速離心法最為高效[7],成為提純EPC-EVs的常用方式方法。其步驟大致如下[18,30-32]:①收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2?000g離心20?min,以去除上清液中的死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片；②以〔10000~20000〕g離心30min,得到體積較大的囊泡，即MVs;③將經(jīng)步驟②離心所得的上清液以100000g離心60min,即得體積較小的囊泡，主要為exosomes.若想獲得較高純度的exosomes或MVs,可在離心后將沉積物用大量PBS重懸，然后重復(fù)超速離心1次，最后將所得沉積物重懸在PBS中.全程均在4℃條件下進(jìn)行，所得的exosomes或MVs置于-?80C保存?zhèn)溆肹18,30-32].值得注意的是，在與EPC-EVs相關(guān)的大量研究中，研究者將經(jīng)步驟③所得到的囊泡稱作MVs[19-24,26],而非exosomes.這可能是由于研究者將MVs和exosomes的概念混淆所致。也有研究者將經(jīng)100000g離心后所得沉積物直接稱為EVs[27].由于經(jīng)超速離心后所得exosomes的純度并不是非常高，可以能會(huì)含有一部分體積偏小的MVs[18],因此這樣命名更準(zhǔn)確。為此，下文綜述EPCs來源的MVs或exosomes功能時(shí)均將其統(tǒng)稱為EPC-EVs.3EPC-EVs的功能3.1EPC-EVs與缺血性損傷修復(fù)組織缺血可導(dǎo)致相應(yīng)器官功能障礙，甚至功能衰竭。EPCs移植可促進(jìn)損傷區(qū)血管新生和內(nèi)皮修復(fù)，進(jìn)而加速組織再生和功能恢復(fù)。但細(xì)胞直接移植存在一定風(fēng)險(xiǎn)，如異常分化、血管栓塞等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPC-EVs富集了其來源細(xì)胞EPCs的功能性RNAs,具有與EPCs類似的促血管再生和組織修復(fù)功能[19-21,26].Deregibus等[24]發(fā)現(xiàn)人外周血源性EPC-EVs中含有與磷脂酰肌醇-3-激酶〔phosphatidylinositol3-kinase,PI3K〕/Akt〔v-aktmurinethymomaviraloncogenehomolog〕/內(nèi)皮型一氧化氮合酶〔endothe-lialnitricoxidesynthase,eNOS〕信號通路相關(guān)的mRNAs;將其與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育一段時(shí)間后，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性和成血管能力加強(qiáng)，PI3K/Akt/eNOS信號通路被激活；若采用RNA酶作用于EPC-EVs,或采用PI3K或NOS抑制劑作用于內(nèi)皮細(xì)胞后，EPC-EVs對內(nèi)皮細(xì)胞的促成血管能力則明顯降低。該研究提示EPC-EVs可能通過靶向傳遞PI3K/Akt/eNOS信號通路相關(guān)mRNAs,促使本來處于靜止期的內(nèi)皮細(xì)胞獲得性高表示出該信號通路的關(guān)鍵分子，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的一系列促血管生成反響。近年來，已有研究者對人外周血來源的EPC-EVs在下肢缺血性損傷、腎臟缺血再灌注損傷和胰島移植后缺血缺氧性損傷中的作用進(jìn)行了探究。Ranghino等[19]將EPC-EVs移植至下肢缺血的免疫缺陷型小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠缺血后肢的毛細(xì)血管密度和血流灌注均增加，肌肉壞死程度較用等體積內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基處理的對照組明顯減輕，且有明顯的肌組織再生。Cantaluppi等[20]將EPC-EVs經(jīng)尾靜脈注射至腎缺血再灌注損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)如今EPC-EVs移植后第2天，損傷大鼠的血尿素氮、血肌酐水平即出現(xiàn)明顯下降；組織學(xué)結(jié)果顯示，EPC-EVs可明顯加強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞和管周血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、自我修復(fù)和抗凋亡能力，減少損傷腎組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，并能抑制損傷區(qū)腎小管周圍毛細(xì)血管減少、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)性纖維化等；除此之外，該研究組還發(fā)現(xiàn)EPC-EVs具有促進(jìn)胰島移植后血管重建的能力。胰島移植后的早期缺血缺氧是導(dǎo)致大量胰島死亡的主要原因，因此迅速、充分的再血管化對于移植胰島的存活及功能至關(guān)重要。Cantaluppi等[21]發(fā)現(xiàn)EPC-EVs能促進(jìn)胰島內(nèi)皮細(xì)胞從胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)爬出，并可加強(qiáng)其增殖、遷移、成血管和抗凋亡的能力；EPC-EVs還能干擾炎性細(xì)胞與胰島內(nèi)皮細(xì)胞的黏附反響，表示清楚EPC-EVs對內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反響具有抑制作用；研究者將EPC-EVs和Matrigel包裹的新鮮胰島經(jīng)皮下注射至免疫缺陷型小鼠的頸背部，發(fā)現(xiàn)EPC-EVs可加速移植胰島的早期血管化、提高其存活能力和改善分泌功能。經(jīng)進(jìn)一步分析，研究者發(fā)現(xiàn)EPC-EVs含有與增殖、抗凋亡和血管新生密切相關(guān)的miRNAs〔如miR-126和miR-296〕[19-21,26].若在移植前先將EPCs中miRNAs合成相關(guān)基因Dicer敲除或抑制EPCs中miR-126和miR-296的表示出，使其分泌的EVs不含這些miRNAs,或采用RNA酶作用于EPC-EVs后，EPC-EVs對缺血組織的修復(fù)作用則顯著減弱甚至消失[19-21,26],表示清楚EPC-EVs主要通過靶向傳遞這些關(guān)鍵miRNAs發(fā)揮對缺血性損傷組織的修復(fù)功能。3.2EPC-EVs與系膜增生性腎炎修復(fù)抗hy-1腎炎又稱抗胸腺細(xì)胞血清性腎炎，是經(jīng)典的系膜增生性腎炎模型，主要表現(xiàn)為補(bǔ)體依靠的系膜細(xì)胞溶解、系膜細(xì)胞異常增生、彌漫性炎性細(xì)胞浸潤和內(nèi)皮細(xì)胞損傷等[33].Cantaluppi等[27]將EPC-EVs經(jīng)股靜脈注射至抗hy-1腎炎損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠蛋白尿水平明顯降低，肌酐去除率顯著升高；組織學(xué)結(jié)果顯示，大鼠腎組織病理改變明顯減輕，表現(xiàn)為系膜細(xì)胞溶解和凋亡減少、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎性反響減輕等；經(jīng)透射電鏡和免疫組織化學(xué)染色觀察，研究者發(fā)現(xiàn)EPC-EVs可抑制系膜區(qū)補(bǔ)體復(fù)合物的沉積和系膜細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白的表示出，表示清楚EPC-EVs可減輕系膜細(xì)胞損傷并抑制其活化；再者，EPC-EVs還可減少足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和丟失，有助于維持腎小球?yàn)V過屏障的完好性；補(bǔ)體總活性測試結(jié)果表示清楚，EPC-EVs還可明顯降低大鼠血清補(bǔ)體的溶血活性。然而，成纖維細(xì)胞源性EVs則沒有上述修復(fù)作用，可見EPC-EVs攜帶某些獨(dú)特成分且這些成分對EPC-EVs修復(fù)抗hy-1腎炎不可或缺。研究者進(jìn)一步探究了EPC-EVs修復(fù)抗hy-1腎炎的機(jī)制。經(jīng)成分分析，研究者發(fā)現(xiàn)EPC-EVs中含有促血管新生miRNAs〔miR-126和miR-296〕以及補(bǔ)體活化抑制因子〔包括補(bǔ)體因子H、CD55和CD59〕的mRNAs和蛋白質(zhì)；將EPC-EVs作用于抗hy-1抗體損傷的大鼠系膜細(xì)胞后，系膜細(xì)胞增殖、抗凋亡能力提高，補(bǔ)體復(fù)合物的沉積減少，補(bǔ)體活化抑制因子的表示出水平明顯升高；而采用RNA酶作用于EPC-EVs后，上述效應(yīng)則消失。由此可見，EPC-EVs富集的這些功能性物質(zhì)使得其在治療補(bǔ)體介導(dǎo)的系膜增生性腎炎上具有獨(dú)特優(yōu)勢。3.3EPC-EVs與心肌肥厚修復(fù)心肌肥厚是心肌工作超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反響，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、凋亡和間質(zhì)細(xì)胞增生及纖維化，是多種心血管疾病的發(fā)展基礎(chǔ)。研究表示清楚，局部過量血管緊張素Ⅱ〔angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ〕可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、凋亡和氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引起心肌重構(gòu)[34].Gu等[22]報(bào)道，在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、凋亡反響中，小鼠骨髓源性EPC-EVs可通過向心肌細(xì)胞傳遞功能性RNAs加強(qiáng)心肌細(xì)胞的增殖活性和抗凋亡能力，并抑制心肌細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，而這一保衛(wèi)作用可能與EPC-EVs激活心肌細(xì)胞PI3K/Akt/eNOS信號通路密切相關(guān)。該研究結(jié)果表示清楚，EPC-EVs還具有修復(fù)心肌肥厚的潛能。3.4EPC-EVs對心血管疾病的預(yù)測價(jià)值外周血中EPCs數(shù)量降低可獨(dú)立預(yù)測心腦血管疾病的病程和預(yù)后[35].研究表示清楚，EPC-EVs也具有預(yù)測心腦血管疾病的作用[28-29].研究者發(fā)現(xiàn)，外周血中EPC-EVs的水平與各種心腦血管危險(xiǎn)因素〔如高血壓、糖尿病等〕成正相關(guān)[28-29].動(dòng)脈硬化通常被以為是多種心腦血管危險(xiǎn)因素對血管壁損害的綜合表現(xiàn)，是血管病變的特異性和敏感性標(biāo)志，臨床上常采用主動(dòng)脈脈搏波傳導(dǎo)速度〔aorticpulsewaveveloc-ity,aPWV〕反映動(dòng)脈硬度。Pirro等[28]發(fā)現(xiàn)，外周血中EPC-EVs的水平與aPWV成顯著正相關(guān)，提示EPC-EVs水平升高能預(yù)測動(dòng)脈硬化進(jìn)程和衡量疾病嚴(yán)重程度。糖尿病是缺血性腦卒中的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠外周血中EPC-EVs的基礎(chǔ)水平明顯偏高，并與小鼠血糖濃度和小鼠腦卒中后的梗死面積成正相關(guān)，與腦微血管密度成負(fù)相關(guān)。由此可見，EPC-EVs水平升高對腦缺血損傷的預(yù)后也具有預(yù)測作用。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)EPCs受損、凋亡時(shí)，所釋放的EVs在數(shù)量、成分和功能上有所改變。Pirro等[28]將EPCs置于過氧化氫介導(dǎo)的促凋亡環(huán)境或高膽固醇患者的血清中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)EPCs凋亡比例和EPC-EVs生成明顯增加，表示清楚不利刺激能加速EPC-EVs的產(chǎn)生。Wang等[23]報(bào)道，在普通無血清環(huán)境下培養(yǎng)的EPCs所分泌的EVs〔starvingst