色譜分離技術(shù)離子課件

第七章吸附分離技術(shù)（1）吸附分離的分類與原理（2）吸附分離的影響因素和操作模式（3）吸附分離的基本理論（4）吸附分離的應(yīng)用第七章吸附分離技術(shù)（1）吸附分離的分類與原理1（1）吸附分離的分類與原理吸附（Adsorption）：是指溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相的現(xiàn)象。固相—吸附劑（Adsorbent）：一般為多孔顆粒。按吸附作用力的不同將吸附分為三個(gè)類型：物理吸附：依靠吸附劑表面與溶質(zhì)間的范德華力化學(xué)吸附：吸附劑表面活性點(diǎn)與溶質(zhì)間發(fā)生化學(xué)結(jié)合、產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象功能基吸附：通過吸附劑表面固定化的功能基團(tuán)吸附目標(biāo)溶質(zhì)（1）吸附分離的分類與原理吸附（Adsorption）：是指2物理吸附吸附劑：主要指以物理吸附為主的固體吸附材料。吸附原理：主要依靠吸附劑與待分離物質(zhì)間的分子間引力，即范德華力。特點(diǎn)：（1）選擇性差（2）吸附和解吸速度快吸附本質(zhì)：U范德華=U定向+U誘導(dǎo)+U色散定向力：由于極性分子的永久偶極矩產(chǎn)生的分子間的靜電引力；誘導(dǎo)力：極性分子與非極性分子之間的吸引力，極性分子產(chǎn)生的電場(chǎng)會(huì)誘導(dǎo)非極性分子極化，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩。色散力：指非極性分子間的引力物理吸附吸附劑：主要指以物理吸附為主的固體吸附材料。3第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件4第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件5吸附劑類型：吸附劑類型：6功能基吸附離子交換吸附劑：靜電作用疏水吸附劑：疏水作用親和吸附劑：親和作用功能基吸附離子交換吸附劑：靜電作用7離子交換吸附原理：吸附劑表面由極性分子或離子組成，能夠吸附溶液中帶相反電荷的離子形成雙電層，同時(shí)在吸附劑與溶液間發(fā)生離子交換，即吸附劑吸附離子后，同時(shí)要放出相應(yīng)摩爾數(shù)的離子于溶液中。溶質(zhì)的電荷是交換吸附的決定因素，所帶電荷越多，在吸附劑表面相反電荷點(diǎn)上的吸附力越強(qiáng)。離子交換法:是利用帶電的被分離物質(zhì)與離子交換填料上的離子交換能力的不同而進(jìn)行分離的方法。離子交換吸附原理：吸附劑表面由極性分子或離子組成，能夠吸附溶8離子交換樹脂離子交換劑離子交換層析材料離子交換劑的組成：三部分惰性的不溶性的高分子固定骨架，也稱載體；與載體以共價(jià)鍵連接的不能移動(dòng)的活性基團(tuán)，也稱功能基團(tuán)；與功能基團(tuán)以離子鍵連接的可移動(dòng)的活性離子，也稱平衡離子。

9離子交換劑的載體及其特點(diǎn)1、離子交換樹脂載體：苯乙烯-二乙烯苯型最常用丙烯酸-二乙烯基苯酚醛樹脂多乙烯多胺-環(huán)氧氯丙烷樹脂特點(diǎn)：（1）強(qiáng)度好，流速較高（2）較高的離子交換當(dāng)量（3）耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿（4）抗污染能力強(qiáng)離子交換劑的載體及其特點(diǎn)1、離子交換樹脂10適用范圍：（1）中小生物物質(zhì)的純化：氨基酸、抗生素、部分中藥有效成分等；（2）除鹽、除重金屬離子（如去離子水）、去色素等。缺點(diǎn)：由于離子交換樹脂疏水性強(qiáng)、交聯(lián)度高、孔隙小、電荷密度高，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)和酶的失活，不適于生物大分子的分離。適用范圍：11

國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的骨架代號(hào)及分類代號(hào)代號(hào)分類名稱骨架名稱代號(hào)分類名稱骨架名稱0123強(qiáng)酸性弱酸性強(qiáng)堿性弱減性苯乙烯系丙烯酸系酚醛系環(huán)氧系456螯合性兩性氧化還原乙烯吡啶系脲醛系氯乙烯系國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的骨架代號(hào)及分類代號(hào)代號(hào)分類名12國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的命名原則：D

交聯(lián)度數(shù)字順序號(hào)

聯(lián)接符號(hào)骨架代號(hào)順序號(hào)分類代號(hào)骨架代號(hào)大孔型代號(hào)分類代號(hào)1~100為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂101~200為弱酸性陽離子交換樹脂201~300為強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂301~400為弱堿性陰離子交換樹脂如：0017是凝膠型苯乙烯系強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，交聯(lián)度7%；D201是大孔型苯乙烯系季胺I型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的命名原則：132、離子交換層析材料載體：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、纖維素和親水性聚乙烯等。特點(diǎn)：（1）大分子能自由在骨架之間自由擴(kuò)散和交換，親水性強(qiáng)、表面積大，易吸附大分子；（2）交換基團(tuán)稀疏，對(duì)大分子的實(shí)際交換容量大；（3）吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；（4）分辨力強(qiáng)，能分離復(fù)雜的生物大分子混合物。2、離子交換層析材料14應(yīng)用：用于分離蛋白質(zhì)、酶等大分子的生物活性物質(zhì)。缺點(diǎn)：（1）強(qiáng)度較差，流速低；（2）強(qiáng)酸、強(qiáng)堿容易破壞天然多糖的結(jié)構(gòu)；（3）易污染，易被微生物降解。應(yīng)用：15

強(qiáng)陽

陽離子交換劑弱陽離子交換劑強(qiáng)陰

陰離子交換劑弱陰

離子交換劑的類型離子交換劑的類型16第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件17陽離子交換劑能與陽離子進(jìn)行交換的離子交換劑。強(qiáng)陽（強(qiáng)酸性）離子交換劑活性基團(tuán)是磺酸基團(tuán)（-SO3H）或次甲基磺酸基團(tuán)-(CH2)2SO3H。都是強(qiáng)酸性基團(tuán)，其電離程度大且不受溶液pH的影響，當(dāng)pH值在1-14范圍內(nèi)時(shí)，均能進(jìn)行離子交換反應(yīng)。陽離子交換劑能與陽離子進(jìn)行交換的離子交換劑。18中和：RSO3-H++Na+OH-R-SO3-Na++H2O中性鹽分解：RSO3-H++Na+ClR-SO3-Na++HCl復(fù)分解：R-SO3-Na++K+Cl-R-SO3-K++NaCl

利用復(fù)分解原理，可將青霉素鉀鹽轉(zhuǎn)成青霉素鈉鹽R-SO3-Na++Pen-K+R-SO3-K++Pen-Na+中和：RSO3-H++Na+OH-19弱陽（弱酸性）離子交換劑：活性基團(tuán)是羧酸基團(tuán)-COOH、氧-OCH2COOH、酚羥基團(tuán)C6H5OH及-雙酮基團(tuán)-COCH2COCH3等。都是弱酸性基團(tuán)，其電離程度受溶液pH的變化影響很大，在酸性溶液中幾乎不發(fā)生交換反應(yīng)，其交換能力隨pH的下降而減少，隨pH的升高而遞增。羧酸陽離子交換樹脂必須在pH7的環(huán)境中才能正常工作，對(duì)于酸性更弱的酚羥基吸附劑，則應(yīng)在pH9的環(huán)境中才能正常反應(yīng)。弱陽（弱酸性）離子交換劑：20

羧酸陽離子交換樹脂在不同pH下的交換容量中和：RCOO-H++Na+OH-RCOO-Na++H2O復(fù)分解：RCOO-Na++K+Cl-RCOO-K++Na+Cl-利用復(fù)分解原理提取鏈霉素R(COO-Na+)3+Str?3H+Cl-

R(COO-)3Str3H++3NaClpH56789交換容量/（meq/g）0.82.58.09.09.0羧酸陽離子交換樹脂在不同pH下的交換容量21陰離子交換劑能與陰離子進(jìn)行交換的離子交換劑強(qiáng)陰（強(qiáng)堿性）離子交換劑：

活性基為季氨基團(tuán)，有三甲胺基團(tuán)RN+(CH3)3OH-(I型）和二甲基-羥基乙基胺基團(tuán)-RN+(CH3)2(C2H4OH)OH-(II型）和強(qiáng)酸性離子交換相似，其活性基團(tuán)電離程度較強(qiáng)，不受溶液pH變化的影響，在pH=1-14范圍內(nèi)均可使用。陰離子交換劑能與陰離子進(jìn)行交換的離子交換劑22中和：R-N+(CH3)3OH-+H+Cl-R-N+(CH3)3Cl-+H2O中性鹽分解：R-N+(CH3)3OH-+Na+Cl-R-N+(CH3)3Cl-+Na+OH-復(fù)分解：R-N+(CH3)3Cl-+Na2SO42-

R[N+(CH3)3]2SO42-+2Na+Cl-

主要用于制備無鹽水（除去SiO2-、CO32-等弱酸根）及卡那霉素、巴龍霉素、新霉素等的精制。中和：23弱陰（弱堿性）離子交換劑：

活性基有伯胺基團(tuán)-NH2，仲胺-NHR和叔胺-N（R）2以及吡啶C6H5N等基團(tuán)，如二乙氨乙基-(CH2)2N+H(C2H5)2(DEAE)就是在分離蛋白上常用的弱陰離子交換基團(tuán)?；鶊F(tuán)的電離程度弱，和弱酸陽離子樹脂一樣交換能力受pH的變化影響很大，pH越低，交換能力越高，故在pH7的溶液中使用。中和：RN+H3OH-+HClRN+H3Cl-+H2O復(fù)分解：R(N+H3Cl-)2+Na2+SO42-

R(N+H3)2SO42-+2NaCl弱陰（弱堿性）離子交換劑：24第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件25第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件26離子交換劑的性能評(píng)價(jià)1、交換容量：是指單位質(zhì)量的干燥離子交換劑或單位體積的濕離子交換劑所能吸附的一價(jià)離子的毫摩爾數(shù)，是表征離子交換能力的主要因素。測(cè)定方法：對(duì)于陽離子交換劑，先用鹽酸將其處理成氫型后，稱重并測(cè)其含水量，同時(shí)稱數(shù)克離子交換劑，加入過量已知濃度的NaOH，靜止24小時(shí)或數(shù)日，測(cè)定剩余的NaOH摩爾數(shù)。就可求得該陽離子交換劑的交換容量。離子交換劑的性能評(píng)價(jià)1、交換容量：是指單位質(zhì)量的干燥離子交換27滴定曲線滴定曲線28其它性能孔徑、孔徑分布、比表面積和孔隙率的表征吸附常數(shù)（吸附動(dòng)力學(xué)）其它性能孔徑、孔徑分布、比表面積和孔隙率的表征29吸附等溫線

假設(shè)只考慮溶質(zhì)在表面的吸附，而忽略溶劑在表面的吸附作用，則在恒定溫度下，吸附量只和溶質(zhì)的濃度有關(guān)。（b）—單分子層吸附（c）—多分子層吸附吸附等溫線假設(shè)只考慮溶質(zhì)在表面的吸附，而忽略溶劑在30不同溶質(zhì)對(duì)吸附劑親和力大小的評(píng)價(jià)：

>在這種情況下，A組分比B組分的親和力低，它將首先從柱中脫附下來。不同溶質(zhì)對(duì)吸附劑親和力大小的評(píng)價(jià)：31第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件32Langmuir等溫線：也被稱為單分子層吸附等溫線。假設(shè)：吸附在吸附劑的活性中心上進(jìn)行吸附物分子間無相互作用每一個(gè)活性中心只能吸附一個(gè)分子但在實(shí)際的吸附中，特別是在蛋白質(zhì)的吸附中，上述假設(shè)很難成立。在這種情況下，吸附方程可用如下方程描述。

Langmuir等溫線：33A—未被吸附的溶質(zhì)分子S—吸附劑表面未被占有的活性位點(diǎn)AS—占據(jù)活性點(diǎn)的吸附劑分子Kad—平衡熱力學(xué)常數(shù)理想條件下：Langmuir提出了表面占據(jù)分率的概念：A—未被吸附的溶質(zhì)分子34假如A占據(jù)了吸附劑表面上的所有活性位點(diǎn)，則將上述兩式結(jié)合，則得到Langmuir等溫方程：假如A占據(jù)了吸附劑表面上的所有活性位點(diǎn)，則35影響離子交換分離的因素離子交換的選擇性用交換常數(shù)表示：影響離子交換分離的因素離子交換的選擇性用交換常數(shù)表示：36（1）水合離子半徑的影響對(duì)無機(jī)離子而言，離子水合半徑越小，離子對(duì)樹脂活性基的親合力越大，也就容易被吸附。按水化半徑次序，各種離子對(duì)樹脂親合力大小的次序?yàn)?對(duì)一價(jià)陽離子：LiNa+、K+NH4+Rb+Cs+Ag+Pb2+對(duì)二價(jià)陽離子：Mg2+Zn2+Cu2+Ni2+Co2+Ca2+Sr2+Pb2+Ba2+對(duì)一價(jià)陰離子：F-HCO3-Cl-HSO3-Br-NO3-IClO4-（1）水合離子半徑的影響37

如果是強(qiáng)酸或強(qiáng)堿樹脂，H+和OH-的序位與Li+相當(dāng)或在F-之前，而對(duì)弱酸或弱堿樹脂，其交換序列在同價(jià)離子之后。（2）離子化合價(jià)若交換離子的價(jià)電數(shù)大于平衡離子時(shí)，若溶液較稀，有利于離子的交換，交換離子的吸附量將增大。如果是強(qiáng)酸或強(qiáng)堿樹脂，H+和OH-的序位與Li+38溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量（meq/g）溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量（meq/g）鏈霉素鈉鏈霉素鈉0.005170.002581.5000.7500.2560.8000.001030.000520.3000.1501.932.76當(dāng)有鈉離子存在時(shí)，溶液的稀釋對(duì)苯氧乙酸-酚-甲醛樹脂吸附鏈霉素的影響（樹脂對(duì)鏈霉素的交換容量為3.17meq/g)可見，在較稀的溶液中，樹脂幾乎僅吸附高價(jià)離子。溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量溶液中離子濃度（39（3）溶液的pH值由于溶液的pH值直接決定樹脂交換基團(tuán)及交換離子的解離程度，進(jìn)而影響樹脂對(duì)交換的選擇性和吸附容量。對(duì)于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性樹脂，溶液pH主要左右交換離子的解離度，決定它帶何種電荷以及電荷量，決定被樹脂吸附或吸附的強(qiáng)弱。對(duì)于弱酸、弱堿性樹脂，溶液的pH還是影響樹脂解離程度和吸附能力的重要因素。但過強(qiáng)的交換能力有時(shí)會(huì)影響到交換的選擇性，同時(shí)增加洗脫難度。（3）溶液的pH值40

對(duì)生物活性分子而言，過強(qiáng)的吸附以及劇烈的洗脫條件會(huì)增加變性失活的機(jī)會(huì)。另外，樹脂的解離程度與活性基團(tuán)的水合程度也有密切關(guān)系。水合度高的溶漲度大，選擇吸附能力下降。這就是為什么在分離蛋白質(zhì)或酶時(shí)較少選用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿樹脂的原因。對(duì)生物活性分子而言，過強(qiáng)的吸附以及劇烈41(4)離子強(qiáng)度高的離子濃度必與目的物離子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，減少有效交換容量。另一方面，離子的存在會(huì)增加蛋白質(zhì)分子以及樹脂活性基團(tuán)的水合作用，降低吸附選擇性和交換速度。所以一般在保證目的蛋白質(zhì)的溶解度和溶液緩沖能力的前提下，盡可能采用低離子強(qiáng)度。(4)離子強(qiáng)度42荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：I—流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，A和B為常數(shù)，為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，在物理意義上，B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與離子價(jià)數(shù)之比。在pH偏離等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)溶質(zhì)的靜電數(shù)常為兩位數(shù)以上，故B值較大，即蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對(duì)離子強(qiáng)度非常敏感。在同一離子強(qiáng)度下，不同蛋白質(zhì)的分配系數(shù)相差非常大（幾個(gè)數(shù)量級(jí))。

對(duì)于蛋白質(zhì)的離子交換層析分離常采用DEAE、CM等較弱的離子交換吸附劑。

第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件43(5)有機(jī)溶劑的影響

離子交換樹脂在水和非水體系中的行為是不同的。有機(jī)溶劑的存在會(huì)使樹脂收縮，也會(huì)使有機(jī)物的電離度降低，不利于分子量較大的有機(jī)物的吸附。利用這個(gè)特性，常在洗滌劑中加適當(dāng)有機(jī)溶劑來洗脫難洗脫的有機(jī)物質(zhì)。(5)有機(jī)溶劑的影響44(6)交聯(lián)度、膨脹度、分子篩

對(duì)凝膠型樹脂來說，交聯(lián)度大、結(jié)構(gòu)緊密、膨脹度小。樹脂篩分能力大，促使吸附量增加，其交換常數(shù)亦大。相反，交聯(lián)度小、結(jié)構(gòu)松弛、膨脹度大，吸附量減少，交換常數(shù)值亦減少子不受阻礙。對(duì)于交聯(lián)度大的凝膠型樹脂有機(jī)大分子與無機(jī)離子在樹脂內(nèi)擴(kuò)散速度不等，利用這一原理將大分子和無機(jī)離子分開的方法稱為分子篩法。在抗生素，如鏈霉索、慶大雷索、去甲基萬古霉素生產(chǎn)中，利用高交聯(lián)度的1×14樹脂去除Ca2+、Mg2+，能達(dá)到降低灰分，減少抗生素的損失的目的。(6)交聯(lián)度、膨脹度、分子篩45(7)樹脂與離子間的輔助力

離子交換樹脂與被吸附離子間的作用力除靜電力外，還存在一種輔助力，這一輔助力存在于被交換離子是有機(jī)離子的情況下。通常，無機(jī)離子進(jìn)行交換時(shí)的交換常數(shù)K多在1—10之間，而有機(jī)離子交換時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量越大，交換常數(shù)越大，K值有時(shí)可高達(dá)102-103，這種現(xiàn)象單純采用靜電吸附力無法解釋，實(shí)際上是由于存在著一些輔助力。四環(huán)素族抗生素分子中酰胺基(一CONH2)上的H和磺酸樹脂的功能基(一SO3H)上的氧易形成氫鍵，所以K值明顯增大，尿素是一種中性物質(zhì)，因能形成氫鍵，所以尿素溶液很容易將青霉素從磺酸樹脂上洗脫下來。(7)樹脂與離子間的輔助力46除氫鍵外，亦存在著樹脂與被交換離子間的范德華力。例如，骨架內(nèi)含有脂肪烴、苯環(huán)和萘環(huán)的樹脂，它對(duì)芳香族化合物的吸附能力依次相應(yīng)增加；酚硝酸樹脂對(duì)一價(jià)季胺鹽類陽離子的親和力隨離子的水合半徑的增加而增加，這種現(xiàn)象與天機(jī)離子交換情況相反，這是由于吸附大分子時(shí)起主導(dǎo)作用的是范德華力而不是靜電力。另有一些研究表明，樹脂吸附較大離子后，在被吸附離子間存在輔助力，樹脂吸附的大離子愈多，輔助力愈大。除氫鍵外，亦存在著樹脂與被交換離子間的范德華力。47離子交換吸附分離的操作方法（1）離子交換吸附劑的選擇

保證分離目標(biāo)物和主要雜質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附力有足夠的差異。目的物具有較強(qiáng)的堿性和酸性時(shí)，宜選用弱酸性弱堿性的吸附劑，有利于提高選擇性，并便于洗脫。目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物質(zhì)時(shí)，往往選用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸樹脂。如氨基酸的分離多用強(qiáng)酸樹脂，以保證有足夠的結(jié)合力。對(duì)于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性層析材料，以減少生物大分子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。

小分子選用離子交換樹脂，蛋白質(zhì)等生物大分子選用離子交換層析材料。離子交換吸附分離的操作方法（1）離子交換吸附劑的選擇48吸附條件（1）調(diào)整pH值使目標(biāo)物與吸附劑離子交換功能基帶相反電性（2）低的離子強(qiáng)度或低鹽濃度上樣洗脫條件調(diào)整pH值或增加離子強(qiáng)度(高鹽濃度洗脫）。吸附條件49第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件50離子交換(IEC)的應(yīng)用及特點(diǎn)IEC—是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段IEC分離的特點(diǎn)：（1）料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；（2）應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長(zhǎng)較短；（3）產(chǎn)品回收率高；（4）商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親合吸附劑。離子交換(IEC)的應(yīng)用及特點(diǎn)IEC—是蛋白質(zhì)、肽和核51疏水作用層析（色譜）一、原理疏水作用層析(Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)的疏水吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。疏水作用層析（色譜）一、原理52第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件53二、疏水性吸附劑將下表所列的各種凝膠過濾介質(zhì)偶聯(lián)上疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。

二、疏水性吸附劑54常用的疏水性配基：苯基、短鏈烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。吸附特點(diǎn)：疏水性吸附作用的大小與配基的疏水性（疏水鏈長(zhǎng)度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，疏水性高的配基較疏水性低的配基修飾密度低。一般配基修飾密度在10~40mol/ml，配基修飾密度過小則疏水性吸附不足，密度過大則洗脫困難。常用的疏水性配基：55第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件56第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件57三、HIC操作上樣及洗脫的一般規(guī)律：

在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時(shí)，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來。一般用pH6-8的鹽水溶液[如（NH4）2SO4]。鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的疏水性，從而影響蛋白質(zhì)的保留值。鹽：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc，KOAc，NaOAc，NaCl鹽析作用增強(qiáng)洗脫能力增強(qiáng)

三、HIC操作581、影響疏水性吸附的因素

蛋白質(zhì)的疏水性與其荷電性質(zhì)相比復(fù)雜得多，不易定量掌握。除疏水性吸附劑的性質(zhì)(疏水性配基的結(jié)構(gòu)和修飾密度)外，流動(dòng)相的組成以及操作溫度對(duì)蛋白質(zhì)疏水性吸附的強(qiáng)弱均產(chǎn)生重要影響。(1)離子強(qiáng)度及種類蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。因此HIC分離過程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動(dòng)相，在略低于鹽析點(diǎn)的鹽濃度下進(jìn)料，然后逐漸降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫分離。1、影響疏水性吸附的因素59(2)破壞水化作用的物質(zhì),,和等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用。這類陰離子與上述鹽析作用強(qiáng)的高價(jià)陰離子(如，等)的作用正好相反，前者稱為離液離子(chaotropicion)，后者稱為反離液離子(antichaotropicion)。在離液離子存在下疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫。除離液離子外，乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用，經(jīng)常用做洗脫促進(jìn)劑，洗脫疏水吸附強(qiáng)烈、僅靠降低鹽濃度難于洗脫的高疏水性蛋白質(zhì)。(2)破壞水化作用的物質(zhì)60(3)表面活性劑

表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。根據(jù)這一原理，難溶于水的膜蛋白質(zhì)可添加一定量的表面活性劑使其溶解，利用HIC法進(jìn)行洗脫分離。但此時(shí)選用表面活性劑的種類和濃度應(yīng)當(dāng)適宜：濃度過小則膜蛋白不溶解，過大則抑制蛋白質(zhì)的吸附。

(4)溫度一般吸附為放熱過程，溫度越低吸附結(jié)合常數(shù)越大。但疏水性吸附與一般吸附相反，吸附結(jié)合作用隨溫度升高而增大。蛋白質(zhì)疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸熱過程，即疏水性吸附為吸熱過程,0(3)表面活性劑61因?yàn)椋核晕狡胶獬?shù)K隨溫度的升高而增大。2，蛋白質(zhì)的分離

蛋白質(zhì)與HIC填料之間的作用很復(fù)雜，有時(shí)不能完全用疏水性相互作用來解釋，有時(shí)配基苯環(huán)還會(huì)與蛋白質(zhì)分子上的芳香族氨基酸產(chǎn)生-鍵。因此，在利用HIC分離蛋白質(zhì)混合物時(shí)，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進(jìn)行吸附與洗脫實(shí)驗(yàn)，確定最佳吸附劑和洗脫劑。因?yàn)椋?2第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件63羥基磷灰石層析羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAP):是一種磷酸鈣晶體，基本分子結(jié)構(gòu)為羥基磷灰石層析羥基磷灰石（hydroxyapatite,H64一般認(rèn)為，HAP的吸附主要基于鈣高子和磷酸根離子的靜電引力，即在HAP晶體表面存在兩種不同的吸附晶面，各存在吸附點(diǎn)c點(diǎn)和P點(diǎn)，前者起陰離于交換作用，后者起陽離于交換作用．因此，在中性pH環(huán)境下酸性蛋白質(zhì)(pI<7)主要吸附于c點(diǎn)，堿性蛋白質(zhì)(PI>7)主要吸附于P點(diǎn)．利用磷酸鹽緩沖液(K2HP04+KH2PO4）為流動(dòng)相洗脫展開時(shí)，磷酸根離子在c點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性吸附，交換出酸性蛋白質(zhì)，而K+在P點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性吸附，交換出堿性蛋白質(zhì)。所以HAP層析通常以磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，采用提高鹽濃度的線性梯度洗脫法。一般認(rèn)為，HAP的吸附主要基于鈣高子和磷酸根離子65應(yīng)用：

由于HAP晶體表面結(jié)構(gòu)特別，吸附機(jī)理特殊，因此可用于識(shí)別DNA及RNA的單鏈和雙鏈，分離IEC和HIC難于分離的蛋白質(zhì)物系。例如，人腫瘤壞死因子(humantumournecrosisfactor,hTNF)中構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的差異很小,利用IEC法、高效RPC法和電泳法只能得到一個(gè)洗脫峰或電泳帶，而利用HAP層析可分離得到4個(gè)洗脫峰。HAP吸附劑價(jià)格便宜，遠(yuǎn)低于高子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克降抗體的主要純化手段。應(yīng)用：66第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件67灌注層析(Perfusionchromatography)灌注層析(Perfusionchromatography)是美國(guó)PerSeptiveBiosystems公司于1989年開發(fā)的層析分離技術(shù)，Perfusionchromatography是該公司的注冊(cè)商標(biāo)．灌注層析的關(guān)鍵是其以POROS命名的固定相粒子的特殊結(jié)構(gòu)；POROS的基質(zhì)是聚苯乙烯—二乙烯苯，含有兩種大小不同的孔道。大孔直徑為0.6~0.8m，流體以對(duì)流形式通過，稱為穿透孔(throughpore);小孔直徑與一般介質(zhì)一樣，直徑500~1000，流體以擴(kuò)散的形式通過，稱為擴(kuò)散孔(diffusivepore)．如圖所示，穿透孔之間以擴(kuò)散孔相連，保證了灌注層析(Perfusionchromatography)68POROS介質(zhì)的大比表面積和溶質(zhì)吸附容量。同時(shí)，擴(kuò)散孔道長(zhǎng)度小于lm，溶質(zhì)擴(kuò)散所需時(shí)間極短，大大降低了利用傳統(tǒng)介質(zhì)進(jìn)行層析分離的擴(kuò)散傳質(zhì)阻力。POROS介質(zhì)的大比表面積和溶質(zhì)吸附容量。同時(shí)，擴(kuò)散69第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件70第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件71

為使流體以對(duì)流的形式通過穿透孔，灌注層析要求在較高流速下操作，以使每個(gè)粒子兩端產(chǎn)生足夠的壓差，推動(dòng)流體進(jìn)入穿透孔。對(duì)于POROS粒子，層析操作線速度超過300cm／h時(shí)，穿透孔內(nèi)對(duì)流流動(dòng)即占主導(dǎo)地位。PerSeptiveBiosystems公司的灌注層析的操作線速度在500-5000cm／h，比包括高效液相色譜(HPLC)在內(nèi)的傳統(tǒng)方法高10-100倍．因?yàn)榱黧w以對(duì)流形式透過穿透孔，并且擴(kuò)散孔道很短(小于lm)，在如此高的流速下操作并不影響灌注層析的柱效．為使流體以對(duì)流的形式通過穿透孔，灌注層析要求72POROS層析介質(zhì)包括離子交換、疏水作用、親和吸附和反相介質(zhì)等，其中前三種介質(zhì)的孔表面覆面有葡聚糖等親水性多糖，保證介質(zhì)表面的親水性和鍵合相應(yīng)的配基。灌注層析的最大特點(diǎn)是分離速度快，一般可在數(shù)分鐘內(nèi)完成，而利用HPLC則需數(shù)十分鐘到一小時(shí)。POROS層析介質(zhì)包括離子交換、疏水作用、親和吸73實(shí)例：丙磺酸型強(qiáng)陽離子交換劑灌注層析基因重組抗凝血多肽（rTAP)吸附劑體積：1.25L(25252)上樣液：80ml，lmgrTAP／ml沖洗：用相當(dāng)于3倍柱體積的平衡液(0.1mol／LNaCl，0.05mol／L富馬酸鈉，pH3.5)清洗洗脫：用洗脫液(0.5mol／LNaCl，0.05mol／L富馬酸鈉，pH3.5)洗脫，第二個(gè)峰即為純化的rTAP，收率為93.4％。實(shí)例：丙磺酸型強(qiáng)陽離子交換劑灌注層析基因重組抗凝74第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件75第七章吸附分離技術(shù)（1）吸附分離的分類與原理（2）吸附分離的影響因素和操作模式（3）吸附分離的基本理論（4）吸附分離的應(yīng)用第七章吸附分離技術(shù)（1）吸附分離的分類與原理76（1）吸附分離的分類與原理吸附（Adsorption）：是指溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相的現(xiàn)象。固相—吸附劑（Adsorbent）：一般為多孔顆粒。按吸附作用力的不同將吸附分為三個(gè)類型：物理吸附：依靠吸附劑表面與溶質(zhì)間的范德華力化學(xué)吸附：吸附劑表面活性點(diǎn)與溶質(zhì)間發(fā)生化學(xué)結(jié)合、產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象功能基吸附：通過吸附劑表面固定化的功能基團(tuán)吸附目標(biāo)溶質(zhì)（1）吸附分離的分類與原理吸附（Adsorption）：是指77物理吸附吸附劑：主要指以物理吸附為主的固體吸附材料。吸附原理：主要依靠吸附劑與待分離物質(zhì)間的分子間引力，即范德華力。特點(diǎn)：（1）選擇性差（2）吸附和解吸速度快吸附本質(zhì)：U范德華=U定向+U誘導(dǎo)+U色散定向力：由于極性分子的永久偶極矩產(chǎn)生的分子間的靜電引力；誘導(dǎo)力：極性分子與非極性分子之間的吸引力，極性分子產(chǎn)生的電場(chǎng)會(huì)誘導(dǎo)非極性分子極化，產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩。色散力：指非極性分子間的引力物理吸附吸附劑：主要指以物理吸附為主的固體吸附材料。78第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件79第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件80吸附劑類型：吸附劑類型：81功能基吸附離子交換吸附劑：靜電作用疏水吸附劑：疏水作用親和吸附劑：親和作用功能基吸附離子交換吸附劑：靜電作用82離子交換吸附原理：吸附劑表面由極性分子或離子組成，能夠吸附溶液中帶相反電荷的離子形成雙電層，同時(shí)在吸附劑與溶液間發(fā)生離子交換，即吸附劑吸附離子后，同時(shí)要放出相應(yīng)摩爾數(shù)的離子于溶液中。溶質(zhì)的電荷是交換吸附的決定因素，所帶電荷越多，在吸附劑表面相反電荷點(diǎn)上的吸附力越強(qiáng)。離子交換法:是利用帶電的被分離物質(zhì)與離子交換填料上的離子交換能力的不同而進(jìn)行分離的方法。離子交換吸附原理：吸附劑表面由極性分子或離子組成，能夠吸附溶83離子交換樹脂離子交換劑離子交換層析材料離子交換劑的組成：三部分惰性的不溶性的高分子固定骨架，也稱載體；與載體以共價(jià)鍵連接的不能移動(dòng)的活性基團(tuán)，也稱功能基團(tuán)；與功能基團(tuán)以離子鍵連接的可移動(dòng)的活性離子，也稱平衡離子。

84離子交換劑的載體及其特點(diǎn)1、離子交換樹脂載體：苯乙烯-二乙烯苯型最常用丙烯酸-二乙烯基苯酚醛樹脂多乙烯多胺-環(huán)氧氯丙烷樹脂特點(diǎn)：（1）強(qiáng)度好，流速較高（2）較高的離子交換當(dāng)量（3）耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿（4）抗污染能力強(qiáng)離子交換劑的載體及其特點(diǎn)1、離子交換樹脂85適用范圍：（1）中小生物物質(zhì)的純化：氨基酸、抗生素、部分中藥有效成分等；（2）除鹽、除重金屬離子（如去離子水）、去色素等。缺點(diǎn)：由于離子交換樹脂疏水性強(qiáng)、交聯(lián)度高、孔隙小、電荷密度高，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)和酶的失活，不適于生物大分子的分離。適用范圍：86

國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的骨架代號(hào)及分類代號(hào)代號(hào)分類名稱骨架名稱代號(hào)分類名稱骨架名稱0123強(qiáng)酸性弱酸性強(qiáng)堿性弱減性苯乙烯系丙烯酸系酚醛系環(huán)氧系456螯合性兩性氧化還原乙烯吡啶系脲醛系氯乙烯系國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的骨架代號(hào)及分類代號(hào)代號(hào)分類名87國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的命名原則：D

交聯(lián)度數(shù)字順序號(hào)

聯(lián)接符號(hào)骨架代號(hào)順序號(hào)分類代號(hào)骨架代號(hào)大孔型代號(hào)分類代號(hào)1~100為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂101~200為弱酸性陽離子交換樹脂201~300為強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂301~400為弱堿性陰離子交換樹脂如：0017是凝膠型苯乙烯系強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，交聯(lián)度7%；D201是大孔型苯乙烯系季胺I型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂國(guó)產(chǎn)離子交換樹脂的命名原則：882、離子交換層析材料載體：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、纖維素和親水性聚乙烯等。特點(diǎn)：（1）大分子能自由在骨架之間自由擴(kuò)散和交換，親水性強(qiáng)、表面積大，易吸附大分子；（2）交換基團(tuán)稀疏，對(duì)大分子的實(shí)際交換容量大；（3）吸附力弱，交換和洗脫條件緩和，不易引起變性；（4）分辨力強(qiáng)，能分離復(fù)雜的生物大分子混合物。2、離子交換層析材料89應(yīng)用：用于分離蛋白質(zhì)、酶等大分子的生物活性物質(zhì)。缺點(diǎn)：（1）強(qiáng)度較差，流速低；（2）強(qiáng)酸、強(qiáng)堿容易破壞天然多糖的結(jié)構(gòu)；（3）易污染，易被微生物降解。應(yīng)用：90

強(qiáng)陽

陽離子交換劑弱陽離子交換劑強(qiáng)陰

陰離子交換劑弱陰

離子交換劑的類型離子交換劑的類型91第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件92陽離子交換劑能與陽離子進(jìn)行交換的離子交換劑。強(qiáng)陽（強(qiáng)酸性）離子交換劑活性基團(tuán)是磺酸基團(tuán)（-SO3H）或次甲基磺酸基團(tuán)-(CH2)2SO3H。都是強(qiáng)酸性基團(tuán)，其電離程度大且不受溶液pH的影響，當(dāng)pH值在1-14范圍內(nèi)時(shí)，均能進(jìn)行離子交換反應(yīng)。陽離子交換劑能與陽離子進(jìn)行交換的離子交換劑。93中和：RSO3-H++Na+OH-R-SO3-Na++H2O中性鹽分解：RSO3-H++Na+ClR-SO3-Na++HCl復(fù)分解：R-SO3-Na++K+Cl-R-SO3-K++NaCl

利用復(fù)分解原理，可將青霉素鉀鹽轉(zhuǎn)成青霉素鈉鹽R-SO3-Na++Pen-K+R-SO3-K++Pen-Na+中和：RSO3-H++Na+OH-94弱陽（弱酸性）離子交換劑：活性基團(tuán)是羧酸基團(tuán)-COOH、氧-OCH2COOH、酚羥基團(tuán)C6H5OH及-雙酮基團(tuán)-COCH2COCH3等。都是弱酸性基團(tuán)，其電離程度受溶液pH的變化影響很大，在酸性溶液中幾乎不發(fā)生交換反應(yīng)，其交換能力隨pH的下降而減少，隨pH的升高而遞增。羧酸陽離子交換樹脂必須在pH7的環(huán)境中才能正常工作，對(duì)于酸性更弱的酚羥基吸附劑，則應(yīng)在pH9的環(huán)境中才能正常反應(yīng)。弱陽（弱酸性）離子交換劑：95

羧酸陽離子交換樹脂在不同pH下的交換容量中和：RCOO-H++Na+OH-RCOO-Na++H2O復(fù)分解：RCOO-Na++K+Cl-RCOO-K++Na+Cl-利用復(fù)分解原理提取鏈霉素R(COO-Na+)3+Str?3H+Cl-

R(COO-)3Str3H++3NaClpH56789交換容量/（meq/g）0.82.58.09.09.0羧酸陽離子交換樹脂在不同pH下的交換容量96陰離子交換劑能與陰離子進(jìn)行交換的離子交換劑強(qiáng)陰（強(qiáng)堿性）離子交換劑：

活性基為季氨基團(tuán)，有三甲胺基團(tuán)RN+(CH3)3OH-(I型）和二甲基-羥基乙基胺基團(tuán)-RN+(CH3)2(C2H4OH)OH-(II型）和強(qiáng)酸性離子交換相似，其活性基團(tuán)電離程度較強(qiáng)，不受溶液pH變化的影響，在pH=1-14范圍內(nèi)均可使用。陰離子交換劑能與陰離子進(jìn)行交換的離子交換劑97中和：R-N+(CH3)3OH-+H+Cl-R-N+(CH3)3Cl-+H2O中性鹽分解：R-N+(CH3)3OH-+Na+Cl-R-N+(CH3)3Cl-+Na+OH-復(fù)分解：R-N+(CH3)3Cl-+Na2SO42-

R[N+(CH3)3]2SO42-+2Na+Cl-

主要用于制備無鹽水（除去SiO2-、CO32-等弱酸根）及卡那霉素、巴龍霉素、新霉素等的精制。中和：98弱陰（弱堿性）離子交換劑：

活性基有伯胺基團(tuán)-NH2，仲胺-NHR和叔胺-N（R）2以及吡啶C6H5N等基團(tuán)，如二乙氨乙基-(CH2)2N+H(C2H5)2(DEAE)就是在分離蛋白上常用的弱陰離子交換基團(tuán)?；鶊F(tuán)的電離程度弱，和弱酸陽離子樹脂一樣交換能力受pH的變化影響很大，pH越低，交換能力越高，故在pH7的溶液中使用。中和：RN+H3OH-+HClRN+H3Cl-+H2O復(fù)分解：R(N+H3Cl-)2+Na2+SO42-

R(N+H3)2SO42-+2NaCl弱陰（弱堿性）離子交換劑：99第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件100第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件101離子交換劑的性能評(píng)價(jià)1、交換容量：是指單位質(zhì)量的干燥離子交換劑或單位體積的濕離子交換劑所能吸附的一價(jià)離子的毫摩爾數(shù)，是表征離子交換能力的主要因素。測(cè)定方法：對(duì)于陽離子交換劑，先用鹽酸將其處理成氫型后，稱重并測(cè)其含水量，同時(shí)稱數(shù)克離子交換劑，加入過量已知濃度的NaOH，靜止24小時(shí)或數(shù)日，測(cè)定剩余的NaOH摩爾數(shù)。就可求得該陽離子交換劑的交換容量。離子交換劑的性能評(píng)價(jià)1、交換容量：是指單位質(zhì)量的干燥離子交換102滴定曲線滴定曲線103其它性能孔徑、孔徑分布、比表面積和孔隙率的表征吸附常數(shù)（吸附動(dòng)力學(xué)）其它性能孔徑、孔徑分布、比表面積和孔隙率的表征104吸附等溫線

假設(shè)只考慮溶質(zhì)在表面的吸附，而忽略溶劑在表面的吸附作用，則在恒定溫度下，吸附量只和溶質(zhì)的濃度有關(guān)。（b）—單分子層吸附（c）—多分子層吸附吸附等溫線假設(shè)只考慮溶質(zhì)在表面的吸附，而忽略溶劑在105不同溶質(zhì)對(duì)吸附劑親和力大小的評(píng)價(jià)：

>在這種情況下，A組分比B組分的親和力低，它將首先從柱中脫附下來。不同溶質(zhì)對(duì)吸附劑親和力大小的評(píng)價(jià)：106第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件107Langmuir等溫線：也被稱為單分子層吸附等溫線。假設(shè)：吸附在吸附劑的活性中心上進(jìn)行吸附物分子間無相互作用每一個(gè)活性中心只能吸附一個(gè)分子但在實(shí)際的吸附中，特別是在蛋白質(zhì)的吸附中，上述假設(shè)很難成立。在這種情況下，吸附方程可用如下方程描述。

Langmuir等溫線：108A—未被吸附的溶質(zhì)分子S—吸附劑表面未被占有的活性位點(diǎn)AS—占據(jù)活性點(diǎn)的吸附劑分子Kad—平衡熱力學(xué)常數(shù)理想條件下：Langmuir提出了表面占據(jù)分率的概念：A—未被吸附的溶質(zhì)分子109假如A占據(jù)了吸附劑表面上的所有活性位點(diǎn)，則將上述兩式結(jié)合，則得到Langmuir等溫方程：假如A占據(jù)了吸附劑表面上的所有活性位點(diǎn)，則110影響離子交換分離的因素離子交換的選擇性用交換常數(shù)表示：影響離子交換分離的因素離子交換的選擇性用交換常數(shù)表示：111（1）水合離子半徑的影響對(duì)無機(jī)離子而言，離子水合半徑越小，離子對(duì)樹脂活性基的親合力越大，也就容易被吸附。按水化半徑次序，各種離子對(duì)樹脂親合力大小的次序?yàn)?對(duì)一價(jià)陽離子：LiNa+、K+NH4+Rb+Cs+Ag+Pb2+對(duì)二價(jià)陽離子：Mg2+Zn2+Cu2+Ni2+Co2+Ca2+Sr2+Pb2+Ba2+對(duì)一價(jià)陰離子：F-HCO3-Cl-HSO3-Br-NO3-IClO4-（1）水合離子半徑的影響112

如果是強(qiáng)酸或強(qiáng)堿樹脂，H+和OH-的序位與Li+相當(dāng)或在F-之前，而對(duì)弱酸或弱堿樹脂，其交換序列在同價(jià)離子之后。（2）離子化合價(jià)若交換離子的價(jià)電數(shù)大于平衡離子時(shí)，若溶液較稀，有利于離子的交換，交換離子的吸附量將增大。如果是強(qiáng)酸或強(qiáng)堿樹脂，H+和OH-的序位與Li+113溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量（meq/g）溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量（meq/g）鏈霉素鈉鏈霉素鈉0.005170.002581.5000.7500.2560.8000.001030.000520.3000.1501.932.76當(dāng)有鈉離子存在時(shí)，溶液的稀釋對(duì)苯氧乙酸-酚-甲醛樹脂吸附鏈霉素的影響（樹脂對(duì)鏈霉素的交換容量為3.17meq/g)可見，在較稀的溶液中，樹脂幾乎僅吸附高價(jià)離子。溶液中離子濃度（meq/ml）鏈霉素的吸附量溶液中離子濃度（114（3）溶液的pH值由于溶液的pH值直接決定樹脂交換基團(tuán)及交換離子的解離程度，進(jìn)而影響樹脂對(duì)交換的選擇性和吸附容量。對(duì)于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性樹脂，溶液pH主要左右交換離子的解離度，決定它帶何種電荷以及電荷量，決定被樹脂吸附或吸附的強(qiáng)弱。對(duì)于弱酸、弱堿性樹脂，溶液的pH還是影響樹脂解離程度和吸附能力的重要因素。但過強(qiáng)的交換能力有時(shí)會(huì)影響到交換的選擇性，同時(shí)增加洗脫難度。（3）溶液的pH值115

對(duì)生物活性分子而言，過強(qiáng)的吸附以及劇烈的洗脫條件會(huì)增加變性失活的機(jī)會(huì)。另外，樹脂的解離程度與活性基團(tuán)的水合程度也有密切關(guān)系。水合度高的溶漲度大，選擇吸附能力下降。這就是為什么在分離蛋白質(zhì)或酶時(shí)較少選用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿樹脂的原因。對(duì)生物活性分子而言，過強(qiáng)的吸附以及劇烈116(4)離子強(qiáng)度高的離子濃度必與目的物離子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，減少有效交換容量。另一方面，離子的存在會(huì)增加蛋白質(zhì)分子以及樹脂活性基團(tuán)的水合作用，降低吸附選擇性和交換速度。所以一般在保證目的蛋白質(zhì)的溶解度和溶液緩沖能力的前提下，盡可能采用低離子強(qiáng)度。(4)離子強(qiáng)度117荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：I—流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，A和B為常數(shù)，為離子強(qiáng)度無限大時(shí)溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，在物理意義上，B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與離子價(jià)數(shù)之比。在pH偏離等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)溶質(zhì)的靜電數(shù)常為兩位數(shù)以上，故B值較大，即蛋白質(zhì)的分配系數(shù)對(duì)離子強(qiáng)度非常敏感。在同一離子強(qiáng)度下，不同蛋白質(zhì)的分配系數(shù)相差非常大（幾個(gè)數(shù)量級(jí))。

對(duì)于蛋白質(zhì)的離子交換層析分離常采用DEAE、CM等較弱的離子交換吸附劑。

第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件118(5)有機(jī)溶劑的影響

離子交換樹脂在水和非水體系中的行為是不同的。有機(jī)溶劑的存在會(huì)使樹脂收縮，也會(huì)使有機(jī)物的電離度降低，不利于分子量較大的有機(jī)物的吸附。利用這個(gè)特性，常在洗滌劑中加適當(dāng)有機(jī)溶劑來洗脫難洗脫的有機(jī)物質(zhì)。(5)有機(jī)溶劑的影響119(6)交聯(lián)度、膨脹度、分子篩

對(duì)凝膠型樹脂來說，交聯(lián)度大、結(jié)構(gòu)緊密、膨脹度小。樹脂篩分能力大，促使吸附量增加，其交換常數(shù)亦大。相反，交聯(lián)度小、結(jié)構(gòu)松弛、膨脹度大，吸附量減少，交換常數(shù)值亦減少子不受阻礙。對(duì)于交聯(lián)度大的凝膠型樹脂有機(jī)大分子與無機(jī)離子在樹脂內(nèi)擴(kuò)散速度不等，利用這一原理將大分子和無機(jī)離子分開的方法稱為分子篩法。在抗生素，如鏈霉索、慶大雷索、去甲基萬古霉素生產(chǎn)中，利用高交聯(lián)度的1×14樹脂去除Ca2+、Mg2+，能達(dá)到降低灰分，減少抗生素的損失的目的。(6)交聯(lián)度、膨脹度、分子篩120(7)樹脂與離子間的輔助力

離子交換樹脂與被吸附離子間的作用力除靜電力外，還存在一種輔助力，這一輔助力存在于被交換離子是有機(jī)離子的情況下。通常，無機(jī)離子進(jìn)行交換時(shí)的交換常數(shù)K多在1—10之間，而有機(jī)離子交換時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量越大，交換常數(shù)越大，K值有時(shí)可高達(dá)102-103，這種現(xiàn)象單純采用靜電吸附力無法解釋，實(shí)際上是由于存在著一些輔助力。四環(huán)素族抗生素分子中酰胺基(一CONH2)上的H和磺酸樹脂的功能基(一SO3H)上的氧易形成氫鍵，所以K值明顯增大，尿素是一種中性物質(zhì)，因能形成氫鍵，所以尿素溶液很容易將青霉素從磺酸樹脂上洗脫下來。(7)樹脂與離子間的輔助力121除氫鍵外，亦存在著樹脂與被交換離子間的范德華力。例如，骨架內(nèi)含有脂肪烴、苯環(huán)和萘環(huán)的樹脂，它對(duì)芳香族化合物的吸附能力依次相應(yīng)增加；酚硝酸樹脂對(duì)一價(jià)季胺鹽類陽離子的親和力隨離子的水合半徑的增加而增加，這種現(xiàn)象與天機(jī)離子交換情況相反，這是由于吸附大分子時(shí)起主導(dǎo)作用的是范德華力而不是靜電力。另有一些研究表明，樹脂吸附較大離子后，在被吸附離子間存在輔助力，樹脂吸附的大離子愈多，輔助力愈大。除氫鍵外，亦存在著樹脂與被交換離子間的范德華力。122離子交換吸附分離的操作方法（1）離子交換吸附劑的選擇

保證分離目標(biāo)物和主要雜質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附力有足夠的差異。目的物具有較強(qiáng)的堿性和酸性時(shí)，宜選用弱酸性弱堿性的吸附劑，有利于提高選擇性，并便于洗脫。目的物是弱酸性或弱堿性的小分子物質(zhì)時(shí)，往往選用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸樹脂。如氨基酸的分離多用強(qiáng)酸樹脂，以保證有足夠的結(jié)合力。對(duì)于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性層析材料，以減少生物大分子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。

小分子選用離子交換樹脂，蛋白質(zhì)等生物大分子選用離子交換層析材料。離子交換吸附分離的操作方法（1）離子交換吸附劑的選擇123吸附條件（1）調(diào)整pH值使目標(biāo)物與吸附劑離子交換功能基帶相反電性（2）低的離子強(qiáng)度或低鹽濃度上樣洗脫條件調(diào)整pH值或增加離子強(qiáng)度(高鹽濃度洗脫）。吸附條件124第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件125離子交換(IEC)的應(yīng)用及特點(diǎn)IEC—是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段IEC分離的特點(diǎn)：（1）料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；（2）應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長(zhǎng)較短；（3）產(chǎn)品回收率高；（4）商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親合吸附劑。離子交換(IEC)的應(yīng)用及特點(diǎn)IEC—是蛋白質(zhì)、肽和核126疏水作用層析（色譜）一、原理疏水作用層析(Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)的疏水吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。疏水作用層析（色譜）一、原理127第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件128二、疏水性吸附劑將下表所列的各種凝膠過濾介質(zhì)偶聯(lián)上疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。

二、疏水性吸附劑129常用的疏水性配基：苯基、短鏈烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。吸附特點(diǎn)：疏水性吸附作用的大小與配基的疏水性（疏水鏈長(zhǎng)度）和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，疏水性高的配基較疏水性低的配基修飾密度低。一般配基修飾密度在10~40mol/ml，配基修飾密度過小則疏水性吸附不足，密度過大則洗脫困難。常用的疏水性配基：130第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件131第七章-色譜分離技術(shù)-離子課件132三、HIC操作上樣及洗脫的一般規(guī)律：

在高鹽濃度條件下，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；濃度降低時(shí)，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來。一般用pH6-8的鹽水溶液[如（NH4）2SO4]。鹽的濃度影響蛋白質(zhì)的疏水性，從而影響蛋白質(zhì)的保留值。鹽：Na2SO4，KH2PO4，NaHPO4，(NH4)2SO4，NH4OAc，KOAc，NaOAc，NaCl鹽析作用增強(qiáng)洗脫能力增強(qiáng)

三、HIC操作1331、影響疏水性吸附的因素

蛋白質(zhì)的疏水性與其荷電性質(zhì)相比復(fù)雜得多，不易定量掌握。除疏水性吸附劑的性質(zhì)(疏水性配基的結(jié)構(gòu)和修飾密度)外，流動(dòng)相的組成以及操作溫度對(duì)蛋白質(zhì)疏水性吸附的強(qiáng)弱均產(chǎn)生重要影響。(1)離子強(qiáng)度及種類蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。因此HIC分離過程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動(dòng)相，在略低于鹽析點(diǎn)的鹽濃度下進(jìn)料，然后逐漸降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫分離。1、影響疏水性吸附的因素134(2)破壞水化作用的物質(zhì),,和等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互