分子診斷學(xué)緒論

分子診斷學(xué)緒論危敏副教授南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室最早的疾病診斷疾病的發(fā)展過程基因細(xì)胞組織臟器個(gè)體全身實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)發(fā)展簡史第四類20世紀(jì)80年代第三類20世紀(jì)60年代第二類20世紀(jì)50年代第一類分子診斷免疫學(xué)檢驗(yàn)代謝產(chǎn)物、酶活性變化細(xì)胞學(xué)檢查緒論什么是分子診斷學(xué)？為什么學(xué)分子診斷學(xué)？學(xué)什么內(nèi)容？怎么學(xué)？本章內(nèi)容第一節(jié)

分子診斷學(xué)的概念、任務(wù)和特點(diǎn)第二節(jié)分子診斷學(xué)的發(fā)展簡史第三節(jié)分子診斷的基本策略及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第四節(jié)展望第一節(jié)分子診斷學(xué)的概念、任務(wù)和特點(diǎn)分子生物學(xué)基因診斷分子診斷分子診斷學(xué)基本概念分子生物學(xué)molecularbiology研究核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)、調(diào)控的一門學(xué)科。基因診斷genediagnosis

指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，通過檢測基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)功能的異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。對象（材料）：DNA、RNA病因?qū)W診斷

分子診斷應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。

分子診斷是預(yù)測診斷的主要方法，既可以進(jìn)行個(gè)體遺傳病的診斷，也可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷。一、分子診斷學(xué)的概念moleculardiagnostics利用分子生物學(xué)技術(shù)，研究機(jī)體外源性和內(nèi)源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的改變，從而為疾病的預(yù)測、預(yù)防、診治和轉(zhuǎn)歸提供分子水平信息。臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)的重要分支分子免疫學(xué)分子遺傳學(xué)分子腫瘤學(xué)分子診斷學(xué)分子病理學(xué)分子生物學(xué)分子微生物學(xué)二、分子診斷學(xué)的任務(wù)闡明疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)制；為疾病進(jìn)程的各階段探尋準(zhǔn)確、特異的分子診斷指標(biāo)；運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)為分子診斷指標(biāo)建立臨床實(shí)用、可靠的檢測方法。三、分子診斷學(xué)的特點(diǎn)1.對有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷2.早期快速診斷3.確定個(gè)體對疾病的易感性4.疾病的分期分型、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷等

分子診斷不僅可準(zhǔn)確診斷有基因表型異常的疾病，更重要的是其可對疾病基因型的變異做出判斷。掌握！第二節(jié)分子診斷學(xué)的發(fā)展簡史

20世紀(jì)50年代Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，標(biāo)志著分子生物學(xué)作為一門獨(dú)立學(xué)科的誕生。分子生物學(xué)的基本法則，是1958年由克里克(Crick)提出的遺傳信息傳遞的規(guī)律。1869年FridrichMiescher

從膿細(xì)胞中提取核素1949年

Pauling分子病1953年

Watson和CrickDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1960年JuliusMarmur核酸雜交技術(shù)1975年EdwardSouthernSouthern印跡1977年Gilbert和SangerDNA測序方法1977年YuetWaiKan鐮狀細(xì)胞貧血基因診斷1985年MullisPCR技術(shù)1996年AppliedBiosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR1996年KozalDNA芯片2001年美英等國完成人類基因組計(jì)劃2001年Hutchens蛋白質(zhì)指紋技術(shù)應(yīng)用

相關(guān)的分子生物學(xué)重大發(fā)現(xiàn)一、分子診斷學(xué)的歷史1.

1949年，Pauling發(fā)現(xiàn)鐮形細(xì)胞貧血癥由β-珠蛋白鏈上一個(gè)氨基酸改變引起，并首次引入“分子病”這個(gè)名詞，為分子診斷學(xué)奠定了基礎(chǔ)。2.70年代末，美國科學(xué)院院士美籍華裔科學(xué)家Kan等應(yīng)用液相DNA分子雜交成功地進(jìn)行了鐮形細(xì)胞貧血癥的基因診斷，標(biāo)志著進(jìn)入基因診斷時(shí)代。分子診斷學(xué)研究的主流技術(shù)核酸分子雜交PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）DNA測序掌握！核酸分子雜交

MolecularhybridizationSouthernblot——DNANorthernblot——RNADotblot，SlotblotInSituHybridization,ISH復(fù)性RNADNA基本原理：核酸變性復(fù)性NNTTNTTSouthernblotFISHN／原位雜交可檢出被檢基因的空間位置狀況，即細(xì)胞的具體定位、數(shù)目及類型。PCRPolymeraseChainReactionPCR又稱為基因擴(kuò)增技術(shù)，通過采用特異性引物擴(kuò)增特異DNA片段，具有周期短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、快速以及對原始DNA樣品的數(shù)量和質(zhì)量要求低等特點(diǎn)，極大地推動了基因診斷的發(fā)展，在基因診斷中已得到了廣泛應(yīng)用。

1993年，Mullis因發(fā)明PCR技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)!發(fā)展簡史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想基本原理變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C在體外不斷進(jìn)行DNA復(fù)制的過程DNAsequencing

DNA測序是基因診斷中最直接、最準(zhǔn)確的方法，通過直接分析待測基因的堿基排列順序檢測基因的突變并確定突變的部位、性質(zhì)。由于自動測序技術(shù)的發(fā)展及商業(yè)化，DNA測序有望應(yīng)用于臨床。二、分子診斷學(xué)的現(xiàn)狀1、PCR技術(shù)的優(yōu)化、生物芯片（biochip）技術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)步使分子診斷學(xué)的檢測技術(shù)不斷得到提高，應(yīng)用范圍更廣。2、1999年11月，美國研究病理學(xué)會和分子病理學(xué)協(xié)會創(chuàng)刊出版了《TheJournalofMolecularDiagnostics》雜志，這標(biāo)志著分子診斷已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科——分子診斷學(xué)。

RealTimePCR流程實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量生物芯片（biochip)信息芯片：

DNA芯片（基因芯片）蛋白質(zhì)芯片組織芯片細(xì)胞芯片優(yōu)勢：

高通量、密集型、自動化基因芯片打印儀自動化單色熒光雜交結(jié)果Cye3Cye5雙色熒光疊加結(jié)果蛋白質(zhì)組學(xué)隨著二維凝膠電泳等蛋白質(zhì)分離技術(shù)的不斷完善，生物質(zhì)譜技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了研究蛋白質(zhì)的新領(lǐng)域——蛋白質(zhì)組學(xué)。DNA序列分析基因突變檢測及多態(tài)性分析基因表達(dá)譜分析基因診斷新藥研發(fā)及藥物篩選基因芯片基因芯片技術(shù)的應(yīng)用第三節(jié)分子診斷的基本策略及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄SouthernblotDNA測序FISH實(shí)時(shí)熒光定量PCRDNA芯片NorthernblotFISH逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR轉(zhuǎn)錄譜芯片Westernblot免疫組織化學(xué)染色ELISA蛋白質(zhì)芯片基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常分子診斷學(xué)的主要應(yīng)用：（1）感染性疾病的分子診斷（2）遺傳性疾病的分子診斷（3）腫瘤的分子診斷（4）個(gè)體化醫(yī)療（5）藥物遺傳學(xué)的分子診斷（6）其它血源篩查HBV、HCV、HIV-1病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)

NucleicAcidTestKitforHBVHCVHIV(Type-1)

(Real-timePCR)HBVHCVHIV預(yù)測性遺傳篩查在個(gè)體的不同時(shí)期，針對不同對象進(jìn)行新生兒篩查

以便早診斷、治療和預(yù)防育齡(婚前)對象篩查對發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重疾病基因攜帶者進(jìn)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)，防止遺傳病發(fā)生在后代。產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷提供終止患病胎兒繼續(xù)發(fā)育的選擇。預(yù)植入基因診斷(PGD)

又稱受精卵子宮著床前診斷，是針對體外授精、試管嬰兒等輔助生殖技術(shù)的基因診斷。腫瘤的早期基因診斷疾病癥狀前篩查檢查對象：晚發(fā)型、高易感性、高風(fēng)險(xiǎn)性疾病或惡性腫瘤。

類型疾病名稱易感、或致病基因可選擇的預(yù)防、治療措施晚發(fā)型遺甲狀腺髓質(zhì)瘤RET預(yù)防性手術(shù)切除傳病成人型多囊腎多囊腎基因預(yù)防性手術(shù)切除、其他治療遺傳病易肝血色素病HFE預(yù)防性換血治療感基因攜靜脈血栓性梗凝血因子Ⅴ避免吸煙、口服避孕藥帶者塞基因(R506Q)

遺傳性癌遺傳性乳腺癌BRCA1、BRCA2監(jiān)測、預(yù)防性手術(shù)切除

癥易感基遺傳性非息肉MLH1、MSH2

因腸癌(HNPCC)第四節(jié)展望1.分子診斷的發(fā)展方向技術(shù)上:聯(lián)合、定量；無創(chuàng)診斷范圍：常見、多發(fā)、復(fù)雜性疾病診斷目的：治療→預(yù)防診斷時(shí)機(jī)：早期掌握！2、分子診斷的發(fā)展趨勢：利用現(xiàn)有基因功能研究的成果，不斷擴(kuò)大可進(jìn)行分子診斷的疾病種類和分子標(biāo)志。在DNA水平上以及在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平闡明疾病的分子機(jī)制。3、安全、有效、合法地進(jìn)行分子診斷，規(guī)范化管理、嚴(yán)格的質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)化操作程序是分子診斷學(xué)當(dāng)今面臨的首要任務(wù)。

學(xué)習(xí)內(nèi)容1.基礎(chǔ)篇（5）基因組概論1

原核基因組1

真核基因組1

病毒基因組