環(huán)境儀器分析-hplc

HPLC在環(huán)境分析中的應(yīng)用1HLPC與經(jīng)典液相色譜和氣相的比較氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物幾乎可以分析各種物質(zhì)不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)可以分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長(zhǎng)，柱效不會(huì)很高有很靈敏的檢測(cè)器如ECD和較靈敏的通用檢測(cè)器(FID和TCD)沒(méi)有較高靈敏的通用檢測(cè)器流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒，易于處理流動(dòng)相有毒，費(fèi)用較高運(yùn)行和操作容易運(yùn)行和操作比GC難一些儀器制造難度較小儀器制造難度大2高效液相色譜法20世紀(jì)70年代高效液相色譜法崛起，為難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定和高分子樣品的分析提供了有效手段。3高效液相色譜的發(fā)展史4氣相色譜法與液相色譜法的選擇5高效液相色譜法

HighPerformanceLiquidChromatography

高效液相色譜法是在氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，是色譜技術(shù)的一個(gè)分支。6高壓

以液體作為流動(dòng)相，由于載液流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到阻力較大，為了使載液迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓，壓力一般達(dá)150–350×105Pa；高速由于采用高壓輸液設(shè)備，載液流速快，因而所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液體色譜法少得多，多數(shù)小于1h，一般為1-10ml/min；高效柱效很高，填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離，約可達(dá)3萬(wàn)塔板/米以上。高靈敏度由于采用高靈敏度的檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)量可達(dá)10-9g，熒光可達(dá)10-11g，所需試樣量較少。高效液相色譜的特點(diǎn)7色譜分離示意圖8按固定相分類(lèi)按分離機(jī)理分類(lèi)液液色譜法LLC液固色譜法LSC分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學(xué)鍵合色譜法親合色譜法膠束色譜法HPLC高效液相色譜法的分類(lèi)9高效液相色譜法理論基礎(chǔ)基本概念及理論基礎(chǔ)，如保留值、分配系數(shù)、分配比、分離度、塔板理論等與氣相色譜法是一致的；流動(dòng)相為液體，液體的擴(kuò)散系數(shù)與氣體有很大不同，比較如下表:H-曲線與氣相色譜有很大不同，因?yàn)榉肿訑U(kuò)散A相對(duì)H實(shí)際上已不起作用所致。隨著填料顆粒度的不斷減?。?lt;10m）,兩者的曲線形式基本相似。參數(shù)氣體液體擴(kuò)散系數(shù)Dm/cm2·s-1密度ρ/g·cm-3粘度/g·(cm·s)-110-110-310-410-5110-2103145uHPLCGCH2流動(dòng)相流速對(duì)GC與HPLC板高影響的差別柱效與柱填料粒徑關(guān)系12高效液相色譜儀構(gòu)成（五部分）輸液系統(tǒng)

恒流泵和恒壓泵，單元泵和多元比例泵等梯度洗脫進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣器、六通閥等；分離系統(tǒng)：色譜柱和梯度洗脫控制裝置；檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器、信號(hào)放大器裝置等；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：記錄儀或數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理軟硬件。13He儲(chǔ)液瓶分布器過(guò)濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過(guò)濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱到檢測(cè)器HPLC儀器詳解HPLC儀器結(jié)構(gòu)示意14進(jìn)樣器高壓泵混合室溶劑預(yù)柱接頭色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)系統(tǒng)

HPLC儀器簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)15可優(yōu)化的HPLC條件輸液系統(tǒng)液相運(yùn)行程序梯度方法等度方法流速進(jìn)樣量色譜柱及柱溫檢測(cè)器16輸液系統(tǒng)

保證流動(dòng)相能正常工作，有流動(dòng)相儲(chǔ)瓶、脫氣裝置、高壓泵和梯度程序控制器組成。在HPLC中，流動(dòng)相的選擇性比較強(qiáng)，選擇范圍也比較大。貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。17高壓輸液泵種類(lèi)：

機(jī)械注射泵：?jiǎn)卧?，溶劑更換不便多元比例泵：可根據(jù)需要進(jìn)行流動(dòng)相比例的調(diào)整恒壓型和恒流型：

恒壓泵(類(lèi)似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。

恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。高壓輸液系統(tǒng)18輸液泵進(jìn)樣閥19六通閥進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣（平頭針）標(biāo)準(zhǔn)注射針針頭可換式注射器

20自動(dòng)進(jìn)樣裝置21進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣定量管柱分離系統(tǒng)

色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱和梯度控制兩大部分。欲得到滿(mǎn)意的分離效果，關(guān)鍵是選用合適的色譜柱。色譜柱分為填充柱和毛細(xì)柱兩大類(lèi)。

填充柱：不銹鋼，內(nèi)壁拋光（8）。柱長(zhǎng)度：5~25cm

柱內(nèi)徑：1~6mm

進(jìn)樣量：

1~100l（可分流調(diào)節(jié)）22原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相Normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相Reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上，如C-18柱。23分離原理色譜柱類(lèi)型25色譜柱改進(jìn)——保護(hù)柱作用26典型的柱流速設(shè)定2728

化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N液相色譜固定相29各種不同的混合基質(zhì)制作方式30毛細(xì)管離子色譜法測(cè)定酒和飲料中陽(yáng)離子31高效液相色譜柱的柱效評(píng)價(jià)色譜柱名稱(chēng)樣品流動(dòng)相(V/V)測(cè)死時(shí)間柱效指標(biāo)烷基鍵合相柱苯萘聯(lián)苯菲甲醇/水(83/17)反相色譜柱用苯磺酸水溶液正相色譜柱用四氯乙烯dp/μm345710n＞個(gè)/m

8000060000500004000025000苯基鍵合相柱甲醇/水(57/43)硅膠柱正己烷(無(wú)水)氨基鍵合相柱正庚烷/異丙醇(93/7)氰基鍵合相柱三苯甲醇苯甲醇苯乙醇液相色譜分離類(lèi)型選擇參考相對(duì)分子質(zhì)量＞2000

相對(duì)分子質(zhì)量＜2000

排阻色譜，水為流動(dòng)相排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物——分配色譜異構(gòu)體——吸附色譜分子大小差異—排阻色譜反相液一液色譜排阻色譜，水為流動(dòng)相堿——陽(yáng)離子交換色譜酸——陰離子交換色譜反相離子對(duì)色譜

溶于水不溶于水溶于水不離解可離解不溶于水離子與非離子樣品色譜柱選擇與樣品性質(zhì)的關(guān)系

34流動(dòng)相選擇采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。。35溶劑選擇分離因素：互溶性、極性等檢測(cè)因素:依據(jù)檢測(cè)器36溶劑名稱(chēng)紫外截止波長(zhǎng)/nm正己烷190二硫化碳380四氯化碳265苯210氯仿245二氯甲烷233四氫呋喃212丙酮330乙腈190甲醇205水187光電二極管陣列檢測(cè)器示意時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。38系統(tǒng)壓力與流動(dòng)相粘度關(guān)系25oC20oC混合流動(dòng)相粘度曲線39

梯度洗脫控制

梯度洗脫的確定以等度梯度洗脫結(jié)果為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)分離最佳優(yōu)化的主要調(diào)節(jié)性參數(shù)為：①溶劑種類(lèi)及其組成；S%②梯度洗脫曲線；③梯度速度和梯度時(shí)間S%S%S%40LC梯度洗脫與GC程序升溫的比較LCGC弱溶劑低溫強(qiáng)溶劑高溫中強(qiáng)溶劑中溫梯度洗脫程序升溫溫度恒定

溶劑配比恒定41MeOHvs.ACN3.003.504.004.505.00-100250600Absorbance[mAU]RetentionTime[min]13.003.504.004.505.00-50250550Absorbance[mAU]RetentionTime[min]22MPB：MeOHMPB：ACN壓力：MeOH-132bar；ACN-76bar；ACN洗脫能力更強(qiáng)；ACN選擇性更好峰1---鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)峰2---鄰苯二甲酸丁酯(DBP)42梯度洗脫示意4350%ACN1212通過(guò)有機(jī)溶劑含量調(diào)節(jié)選擇性Column: Acclaim?Mixed-ModeWAX-1,5μmDimension: 150x4.6mmMobilePhase:Acetonitrile/20mMphosphatebuffer,pH6Temperature: 30°CFlowRate: 1mL/minInj.Volume: 2μLDetection: UV(210nm)Peaks: 1. 丁苯

(0.1mg/mL) 2. 對(duì)羥基苯甲酸

(0.5mg/mL)01020MinutesAU45%ACN44流動(dòng)相比例14.06.08.010.012.014.016.018.020.0-10501002Absorbance[mAU]RetentionTime[min]2WVL:210n531+265437ACN：H2O=30：70ACN：H2O=40：60有機(jī)相比例增加，出峰更快、壓力不同、選擇性不同45流速對(duì)分析結(jié)果的影響01503004500150300450015030045001503004500123401503004503mL/min2.5mL/min2mL/min1.5mL/minTime[min]1mL/minC5C4C1C2C3Uracil01234012340123401234流速增加，出峰更早，一般選擇性不變46051015202530oC123+456+7051015202540oCt[min]2461357051015202521oC1723456柱溫增加，出峰更早，選擇性變化柱溫對(duì)出峰時(shí)間的影響47檢測(cè)器

在氣相色譜法中，載氣與待測(cè)組分的物理性質(zhì)差別較大，檢測(cè)器比較容易。而在液相色譜中，流動(dòng)相（溶劑、水）與待測(cè)組分（溶質(zhì)）的物理性質(zhì)往往很相似，檢測(cè)相對(duì)困難。

在環(huán)境分析中，常使用的檢測(cè)器為：

紫外檢測(cè)器：測(cè)定對(duì)紫外光有吸收的物質(zhì)；

熒光檢測(cè)器：測(cè)定發(fā)射熒光的有機(jī)物，或通過(guò)衍生后可發(fā)射熒光的有機(jī)物；

電導(dǎo)檢測(cè)器：測(cè)定離子型有機(jī)物或無(wú)機(jī)物。差示折光檢測(cè)器：進(jìn)行高分子量物質(zhì)及其分子量分布的測(cè)定。前兩者可采用梯度洗脫程序，后兩者則不可采用梯度洗脫。48主要檢測(cè)器及其特點(diǎn)

檢測(cè)器主要特點(diǎn)紫外－可見(jiàn)光對(duì)流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很?。粚?duì)溶質(zhì)的響應(yīng)變化大熒光選擇性和靈敏度高；易受背景熒光、消光、溫度、pH和溶劑的影響化學(xué)發(fā)光靈敏度高；發(fā)光試劑受限制；易受流動(dòng)相組成和脈動(dòng)的影響電導(dǎo)離子性物質(zhì)的通用檢測(cè)器；受溫度和流速影響；不能用于有機(jī)溶劑體系電化學(xué)選擇性高；易受流動(dòng)相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差蒸發(fā)光散射可檢測(cè)所有物質(zhì)示差折光可檢測(cè)所有物質(zhì)；不適合微量分析；對(duì)溫度變化敏感質(zhì)譜主要用于定性和半定量原子吸收光譜選擇性高等離子體發(fā)射光譜可進(jìn)行多元素同時(shí)檢測(cè)火焰離子化柱外峰展寬491.紫外檢測(cè)器

紫外檢測(cè)器的工作原理是以朗伯－比爾定律為基礎(chǔ)，利用測(cè)定流動(dòng)池內(nèi)被測(cè)物質(zhì)的吸光度進(jìn)行定量。屬于濃度型檢測(cè)器，只能用于檢測(cè)能吸收紫外光的物質(zhì)，要求用無(wú)紫外吸收特性的溶劑作為流動(dòng)相。特點(diǎn)：紫外檢測(cè)器主要包括固定波長(zhǎng)檢測(cè)器、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器等。50傳統(tǒng)分光系統(tǒng)二極管陣列分光系統(tǒng)51光電二極管矩陣（PhotoDiodeArray）52光電二極管陣列檢測(cè)器電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，對(duì)檢測(cè)特定波譜或波長(zhǎng)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)快速處理，可得到二維、三維譜圖。紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展53光電二極管陣列檢測(cè)器三維色譜圖峰1峰2響應(yīng)值時(shí)間波長(zhǎng)54光電二極管陣列檢測(cè)器3D譜圖

55沉積物樣品中16

PHAs

PDA色譜圖

56多環(huán)芳烴混標(biāo)(A)和沉積物樣品(B)254nm57AB沉積物樣品在不同波長(zhǎng)下色譜圖沉積物樣品在不同波長(zhǎng)下的色譜圖片斷

58592.熒光檢測(cè)器

熒光檢測(cè)器是一種高靈敏度的選擇性檢測(cè)器，可檢測(cè)發(fā)熒光的有機(jī)物。1575年Monards通過(guò)實(shí)驗(yàn)首先觀察到熒光現(xiàn)象，1852年Stocks判明這種現(xiàn)象是由于物質(zhì)吸收了光線并重新發(fā)射出不同波長(zhǎng)的光，后被稱(chēng)之為Stocks熒光。利用被測(cè)物質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，發(fā)生電子躍遷并返回基態(tài)發(fā)出熒光的性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的，熒光強(qiáng)度與待測(cè)物的濃度成正比。波長(zhǎng)較短的紫外光稱(chēng)為激發(fā)光；輻射出的熒光（Stocks熒光）波長(zhǎng)較長(zhǎng)，在可見(jiàn)光范圍，常稱(chēng)為發(fā)射光。

60熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）特點(diǎn)：高靈敏度、高選擇性適用范圍：對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)紫外光源熒光61熒光檢測(cè)器的應(yīng)用

環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等

食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸

生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素626316種多環(huán)芳烴物質(zhì)的熒光–HPLC分離色譜圖

1—萘；2—二氫苊；3—芴；4—菲；5—蒽；6—熒蒽；7—芘；

8—苯并[a]蒽；9—屈；10—苯并[e]芘；11—苯并[b]螢蒽；

12—苯并[k]螢蒽；13—苯并[a]芘；14—二苯并[a,h]蒽；

15—苯并[g,h,i]苝；16—茚并[1，2，3-c,d]芘色譜柱：PEHC-ODS,0.2625cm,10m,C18柱流動(dòng)相：乙腈水溶液，50%,15min，50%~100%梯度洗脫8min，100%27min；檢測(cè)器：PE650-10LC熒光檢測(cè)器。643.電導(dǎo)檢測(cè)器（離子色譜法）

電導(dǎo)檢測(cè)器通過(guò)在外加電場(chǎng)作用下使待測(cè)物質(zhì)發(fā)生電離，離子通過(guò)流通池引起電導(dǎo)率的變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。通常，呈離子態(tài)的物質(zhì)都可以用電導(dǎo)法測(cè)定，但溶液的電導(dǎo)率是其各種離子的加和，供離子分離用的溶劑本身的高電導(dǎo)率會(huì)掩蓋待測(cè)介質(zhì)中離子的電導(dǎo)，所以只有在一種離子電導(dǎo)率占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的情況下方可檢測(cè)。65毛細(xì)管離子色譜分析實(shí)例664.差示折光檢測(cè)器（RefractiveIndex）示差折光檢測(cè)器（RI）是第一個(gè)商品化的液相色譜檢測(cè)器（上世紀(jì)60-70年）通常被認(rèn)為是一種通用檢測(cè)器檢測(cè)溶液中所有被溶解的溶質(zhì)－非特異性原理：每一種物質(zhì)都有一定的折光指數(shù)，只要其折光指數(shù)與溶劑的折光指數(shù)有足夠的差別，就可以通過(guò)連續(xù)地測(cè)定流出液的折射率變化來(lái)測(cè)定樣品中組分的濃度。該檢測(cè)器的靈敏度與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)均有關(guān)系，其響應(yīng)信號(hào)與溶質(zhì)的濃度成正比。67任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值68特點(diǎn)：屬于濃度型檢測(cè)器，又屬于準(zhǔn)通用型檢測(cè)器。應(yīng)用：(1)對(duì)沒(méi)有紫外吸收的物質(zhì)，如高分子化合物、糖類(lèi)、脂肪烷烴等都能夠檢測(cè)。常用來(lái)進(jìn)行高分子量物質(zhì)及其分子量分布的測(cè)定。(2)折光指數(shù)檢測(cè)器不能用梯度洗脫操作。(3)由于檢測(cè)器靈敏度較低，僅適用于例行分析，不能用于痕量分析。示差折光檢測(cè)器檢測(cè)圖譜

69幾種檢測(cè)器的主要性能對(duì)比

主要性能UV熒光安培質(zhì)譜信號(hào)吸光度熒光強(qiáng)度電流離子流強(qiáng)度噪音10-510-310-9線性范圍105104105寬選擇性是是是否流速影響無(wú)無(wú)有無(wú)溫度影響小小大檢測(cè)限（g/mL）10-1010-1310-13＜10-9g/s池體積（ul）2~10~7＜1－梯度洗脫適宜適宜不宜適宜細(xì)管徑柱難難適宜適宜樣品破壞無(wú)無(wú)無(wú)有70有機(jī)物液相色譜分析部分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

序號(hào)項(xiàng)目分析方法最低檢出限（mg/L）方法來(lái)源1微囊藻毒素-LR高壓液相色譜法0.00006GB/T5750.8-2006微囊藻毒素-RR高壓液相色譜法0.00006GB/T5750.8-20062苯并(a)芘液相色譜法0.000001GB3198-91高壓液相色譜法0.0000014GB/T5750.8-20063溴氰菊酯高壓液相色譜法0.002GB/T5750.9-20064甲萘威高壓液相色譜法0.01GB/T5750.9-20065鄰苯二甲酸酯（二丁酯，二辛酯）液相色譜法0.0001HJ／T72-20016苯胺類(lèi)液相色譜法0.0003《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》9呋喃丹高壓液相色譜法0.000125GB/T5750.9-200610莠去津高壓液相色譜法0.0005GB/T5750.9-200611草甘膦高壓液相色譜法0.025GB/T5750.9-200612氨甲基膦酸高壓液相色譜法0.025GB/T5750.9-200613阿特拉津液相色譜法0.00002《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》14六種特定多環(huán)芳烴高效液相色譜法ng/L級(jí)《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》71HPLC分析方法的建立程序

72超高效液相色譜

（UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC）

UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。超高效液相色譜是一個(gè)新興的領(lǐng)域，作為世界第一個(gè)商品化UPLC產(chǎn)品的WatersACQUITYUPLCTM超高效液相色譜系統(tǒng)在1996年問(wèn)世