探索基因表達的空間信息 - 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial Transcriptomics）

探索基因表達的空間信息——空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(SpatialTranscriptomics) 01、空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展近年來單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用大大拓寬了人們的視野，使人們能夠深入了解組織中細胞的構(gòu)成的多樣性和基因表達狀態(tài)。眾所周知，基因表達具有時間和空間的特異性，通過對不同時間點的樣本取材，使用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠解析時間維度上細胞類型和基因表達的變化過程。圖1.早期胚胎發(fā)育中基因表達的時間特異性【1】然而單細胞測序?qū)嶒灥那疤崾墙M織必須通過機械分離或酶解消化成單細胞懸液，此過程不可避免的丟失了組織中細胞所處的原始位置信息，也導(dǎo)致了細胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)被打破，這使我們難以獲得組織中不同區(qū)域的細胞構(gòu)成和基因表達狀態(tài)，以及不同功能區(qū)之間的基因差異表達等信息。圖2.單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)【2】單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以說是融合了高通量組學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)的單細胞研究手段，即解決了通量和分辨率的問題?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)(spatialtranscriptomics)則需要利用常規(guī)的原位技術(shù)和組學(xué)技術(shù)兩方面的優(yōu)勢。圖3.單細胞測序技術(shù)解決了通量和分辨率的問題現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)主要分為兩類：一類是基于雜交和成像的方法，例如smFISH，BranchedFISH；另一類是基于測序的方法，包括TIVA，ISS，F(xiàn)ISSEQ等。smFISH，BranchedFISH等靶向方法在分析的細胞數(shù)量和檢測靶點的數(shù)量上都受到限制。而上述基于測序的方法雖然是可作為非靶向的篩選手段，但能夠分析的細胞數(shù)量仍處在較低水平。圖4.空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的比較【3】今年一項大受關(guān)注的研究成果，來自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，該研究利用一種稱為Geo-seq的技術(shù)，整合激光顯微切割技術(shù)和微量RNA-seq技術(shù)，重建了小鼠不同發(fā)育時期的三維空間轉(zhuǎn)錄組圖譜【4】。其實該技術(shù)的第一篇文章發(fā)表于2016年，繪制了小鼠早期胚胎原腸運動中期(E7.0latemid-streakstage)精細的三維分子圖譜，揭示了小鼠細胞譜系建立過程中的空間轉(zhuǎn)錄組特征、轉(zhuǎn)錄因子和信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)【5】。然而該技術(shù)的工作量十分巨大，首先需要將胚胎進行連續(xù)切片，之后再利用LCM將每一個切片分成4~6個區(qū)域，每個區(qū)域的微量組織再分別進行RNA抽提，微量RNA擴增、建庫和測序的流程【6】。圖5.Geo-seq技術(shù)的原理2016年，另一項發(fā)表在Science上的工作，則利用基因芯片技術(shù)將位置信息保留在芯片上，再利用二代測序技術(shù)對組織中的RNA進行測序，從而生成了組織切片上完整的基因表達圖像【7】。圖6.空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的原理該論文的通訊作者JoakimLundeberg也是瑞典SpatialTranscriptomics公司的聯(lián)合創(chuàng)始人之一，2018年底10XGenomics宣布收購SpatialTranscriptomics，并于2019年發(fā)布Visium空間基因表達解決方案(VisiumSpatialGeneExpressionSolution)。02、10XGenomicsVisium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)1、技術(shù)原理將冰凍組織切片放置在10XGenomicsVisium芯片的的捕獲區(qū)域內(nèi)，進行HE染色和成像后，對組織切片進行透化處理，細胞內(nèi)的mRNA釋放，從而被芯片上帶有oligo-dT的探針捕獲，并且每個探針都帶有特異的地址序列，然后以mRNA為模版進行cDNA合成，構(gòu)建文庫后再通過測序，獲得基因表達信息的同時，每一條測序reads因帶有地址序列，從而能夠獲得基因表達的位置信息。圖7.10XGenomicsVisium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的原理10XGenomicsVisium芯片包含兩種芯片，分別為組織優(yōu)化芯片和基因表達芯片，組織優(yōu)化芯片用來摸索組織透化的條件，基因表達芯片用來進行正式樣本的空間轉(zhuǎn)錄組實驗。其中基因表達芯片上有4個捕獲區(qū)域，每個區(qū)域大小為6.5mm*6.5mm，每個捕獲區(qū)域中有5000個帶有特異地址序列的探針簇，稱為barcodedspots，每個spot直徑為55um，包含數(shù)百萬個用于捕獲的oligo探針序列，相鄰兩個spot點的中心距離為100um。探針序列的結(jié)構(gòu)為：測序引物結(jié)合序列，16nt的地址序列，12nt的UMI序列以及30nt的oligo-dT序列。圖8.10XGenomicsVisium空間轉(zhuǎn)錄組芯片的結(jié)構(gòu)2、實驗流程 (1)新鮮組織樣本進行異戊烷固定、液氮速凍和OCT包埋； (2)用冷凍切片機進行切片；圖9.樣本準備和切片 (3)準備5~10張切片提取RNA并進行質(zhì)量評估(要求RIN值>7.0)； (4)透化條件優(yōu)化。組織優(yōu)化玻片包含8個捕獲區(qū)域，其中6個區(qū)域分別設(shè)置6個不同的透化時間，另外兩個區(qū)域1個為不加透化劑的陰性對照，另1個為陽性對照，不放組織切片，而是直接加入RNA。其實驗流程為：固定→染色→明場拍照→組織透化→熒光cDNA合成→組織移除→熒光掃描，根據(jù)熒光強度判斷最優(yōu)的透化時間。 (5)正式實驗。正式實驗用的基因表達芯片上有4個捕獲區(qū)域，其實驗流程為：染色以及明場拍照→組織透化(用上述優(yōu)化好的透化時間進行)及cDNA合成→文庫構(gòu)建→高通量測序。圖10.10XGenomicsVisium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的流程3、應(yīng)用方向空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用方向包含了腫瘤學(xué)，免疫學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)及病理學(xué)等各個方向。圖11.空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的應(yīng)用方向4、數(shù)據(jù)分析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的核心是根據(jù)每個芯片上每個spot的基因表達信息進行聚類，然后將spot根據(jù)地址序列放回到組織的圖像上，同時可以對每個gene在組織上表達的空間位置進行定位。圖12.Spot聚類和圖像整合圖13.基因表達的空間熱圖【8】5、空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合10XGenomicsVisium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)目前還達不到單細胞分辨率，而單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)則能夠起到一定的補充作用，將兩者的數(shù)據(jù)進行錨定和整合，使我們能夠獲得目標組織的三維空間轉(zhuǎn)錄組圖14.空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合參考文獻：[1]YanL,YangM,GuoH,etal.Single-cellRNA-Seqprofilingofhumanpreimplantationembryosandembryonicstemcells.NatStructMolBiol2013,20(9):1131-9.[2]XiC,TeichmannSA,MeyerKB.FromTissuestoCellTypesandBack:Single-CellGeneExpressionAnalysisofTissueArchitecture2018,1:29-51.[3]CrosettoN,BienkoM,vanOudenaardenA.Spatiallyresolvedtranscriptomicsandbeyond.NatRevGenet2015,16(1):57-66.[4]PengG,SuoS,CuiG,etal.Moleculararchitectureoflineageallocationandtissueorganizationinearlymouseembryo.Nature2019,572(7770):528-532.[5]PengG,SuoS,ChenJ,etal.SpatialTranscriptomefortheMolecularAnnotationofLineageFatesandCellIdentityinMid-gastrulaMouseEmbryo.DevCell2016,36(6):681-697.[6]ChenJ,SuoS,TamPP,etal.SpatialtranscriptomicanalysisofcryosectionedtissuesampleswithGeo-seq.NatProtoc2017,12(3):566-580.[7]St?hlPL,SalménF,VickovicS,etal.Visualizationandanalysisofgeneexpressionintissuesectionsbyspatialtranscriptomics.Science2016,353(6294):78-82.[8]Thrane