生物化學蛋白質(zhì)的共價結構

生物化學

第四章

蛋白質(zhì)的共價結構

一、蛋白質(zhì)(protein)通論

蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程蛋白質(zhì)存在于所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質(zhì)和功能物質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的化學組成和分類1、蛋白質(zhì)的元素組成與糖和脂類不同，除含有C、H、O外，還有N和少量的S、P。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是Fe、Cu、Co、Mn、Zn等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50％氫7％氧23％氮16%

硫0-3％其他微量2、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量：蛋白質(zhì)含量=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.25蛋白中的氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定再以標準酸堿滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。Degradation:Protein+H2SO4→(NH4)2SO4+CO2+SO2+H2OLiberationofammonia:(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2OTitration:(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

二、蛋白質(zhì)的分類—按照組成分類單純蛋白質(zhì)：蛋白僅由氨基酸組成，單純蛋白可根據(jù)其物理性質(zhì)如溶解度分類：清蛋白、球蛋白、組蛋白等；綴合蛋白質(zhì)：除了氨基酸以外，蛋白質(zhì)上還存在其他化學成分作為其結構的一部分。其中非蛋白部分稱為輔基。綴合蛋白可根據(jù)其輔基進行分類：糖蛋白、脂蛋白、血紅素蛋白；

氨基酸殘基數(shù)=蛋白分子量/110對不含輔基的簡單蛋白而言：纖維狀蛋白球狀蛋白膜蛋白蛋白質(zhì)的分類—按蛋白形狀和溶解度分類：蛋白質(zhì)的分類—按功能分類：酶、轉運蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、貯存蛋白、受體蛋白、結構蛋白、運動蛋白等。肌紅蛋白（一條多肽鏈+血紅素輔基）單體蛋白質(zhì)血紅蛋白（4條多肽鏈+鐵原子的環(huán)狀血紅素輔基）寡聚/多聚蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的分類——按肽鏈組成（二）蛋白質(zhì)的構象和蛋白質(zhì)結構的組織層次蛋白質(zhì)是相對分子量很大的生物分子，

每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結構或稱三維結構，這種三維結構通常被稱為蛋白質(zhì)的構象。為了表示蛋白質(zhì)結構的不同組織層次，一般采用下列術語：

Protein的一級結構（primarystructure)Protein的二級結構（secondarystructure)Protein的三級結構（tertiarystructure)Protein的四級結構（quarternarystructure)一級結構：多肽鏈氨基酸序列二級結構：α-螺旋和β-折疊三級結構：具有特定走向的三維結構四級結構：各亞基在空間上的組合蛋白結構的組織層次氫鍵、離子鍵、范德華力、疏水作用肽鍵(peptidebond)——Aminoacid的連接方式，

實驗根據(jù)：p163Aminoacid通過肽鍵連接起來的化合物稱為肽(peptide)除了共價肽鍵，還存在二硫鍵。二、多肽（一）肽&肽鍵肽的分類：二肽、寡肽和多肽，組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基；具有一個游離的氨基末段（-NH2）和羧基末端（-COOH），有時可成環(huán)為環(huán)狀肽。肽鏈具有方向性（N-C），命名：“某氨基酰某氨基酰??????某氨基酸”例如下圖所示的絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺氨基酸二硫鍵:鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵Ser-Val-Tyr-Asp-GlnGln-Asp-Tyr-Val-SerX肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鍵中游離末端α-NH2、游離α-COOH以及側鏈R基上的可解離功能團。肽的游離末端α-NH2也可以與茚三酮發(fā)生定量反應生成紫色；雙縮脲反應為肽和蛋白質(zhì)所特有，游離氨基酸沒有該反應。反應原理：在堿性溶液中蛋白質(zhì)（2個以上肽鍵）與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關，因此被廣泛地應用。（二）肽的物理化學性質(zhì)雙縮脲雙縮脲絡合物多肽雙縮脲似絡合物借助分光光度計，可測定蛋白質(zhì)含量（三）天然存在的重要多肽—腦啡肽多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。除了蛋白水解可產(chǎn)生多肽外，生物體內(nèi)有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在，這類多肽通常都具有特殊的生理功能，稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。腦啡肽腦啡肽（enkephalin），神經(jīng)遞質(zhì)的一種。又被稱為“腦內(nèi)嗎啡”，對腦細胞具有獨特的作用，能夠激活處于抑制沉睡狀態(tài)的腦細胞，對因腦損傷導致的后遺癥有很好的恢復作用。Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

短桿菌肽S(環(huán)十肽)1944年從短芽孢桿菌培養(yǎng)液中分離，含有L-氨基酸、D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine,縮寫為Orn）。主要抗革蘭氏陽性菌，對耐青霉素G的金葡菌亦有作用。臨床上局部用于治療及預防化膿性病癥。天然存在的重要多肽-短桿菌肽S谷胱甘肽是屬于含有巰基的、小分子肽類物質(zhì)，具有重要的抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽有還原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）兩種形式，在生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù)。谷胱甘肽還原酶催化兩型間的互變。半胱氨酸上的巰基為其活性基團（故谷胱甘肽常簡寫為G-SH），易與碘乙酸、芥子氣、鉛、汞、砷等重金屬鹽絡合，而具有了整合解毒作用。參與細胞內(nèi)氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔因子，清除內(nèi)源性過氧化物和自由基，防止過氧化物積累，維護巰基酶活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。天然存在的重要多肽-谷胱甘肽三、蛋白質(zhì)的一級結構測定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)有100,000多個不同蛋白質(zhì)的一級結構被測定，其中相當多蛋白應用了Sanger測序原理測定的。定義：Protein的一級結構是指構成蛋白質(zhì)的各種氨基酸的種類、數(shù)量、連接方式和排列順序，由遺傳信息（遺傳密碼）所決定。涉及的化學鍵是肽鍵和少量的二硫鍵。蛋白質(zhì)一級結構的內(nèi)容：組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目多肽鏈的氨基酸順序多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置1.蛋白質(zhì)的一級結構測定策略獲得高純度目標蛋白測定多肽數(shù)目拆分多肽鏈斷開二硫鍵鑒定N端和C端每條多肽鏈的氨基酸組成裂解多肽成小片段測定小肽段氨基酸序列拼接肽鏈的一級結構確定S-S位置1.蛋白質(zhì)的一級結構測定步驟測定蛋白質(zhì)分子中多肽數(shù)目測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)的相對分子量比較多肽鏈的拆分8mol/L尿素或者6mol/L鹽酸胍或者高鹽處理二硫鍵的斷裂8mol/L尿素或者6mol/L鹽酸胍存在下，過量的β-巰基乙醇還原二硫鍵為巰基測定每條多肽鏈的氨基酸組成及分子比酸水解及堿水解、層析及質(zhì)譜等確定肽鏈中各種氨基酸出現(xiàn)種類及頻率N-端和C-端氨基酸的鑒定N-端：二硝基氟苯法丹磺酰氯法苯異硫氰酸酯法氨肽酶法C-端：肼解法還原法羧肽酶法二硝基氟苯法層析、色譜、質(zhì)譜鑒定（1）二硝基氟苯(DNFB/FDNB)：α-NH2上的烴基化反應黃色（2）丹磺酰氯(DNS)法——α-NH2的?；磻獙游觥⑸V、質(zhì)譜鑒定熒光

更靈敏(3)苯異硫氰酸酯（PITC）法苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物剩下的完整肽段，可繼續(xù)此反應進行多肽測序?qū)游?、色譜、質(zhì)譜鑒定PTC多肽(4)氨肽酶法概念：氨肽酶是一類肽鏈外切酶，能夠從多肽鏈的N-末端逐個向里切，釋放出氨基酸。原理：根據(jù)不同反應時間所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，對反應時間做動力學曲線，推斷蛋白質(zhì)N-端殘基。不足：不同氨肽酶對肽鍵敏感程度不一樣，有時難以判斷哪個殘基在前面。優(yōu)點：當肽段的N端氨基酸被封閉，例如環(huán)化的短桿菌肽S，就無法利用游離-NH2與二硝基氟苯、丹磺酰氯、PITC的反應。焦谷氨酸氨肽酶C-末端氨基酸鑒定——肼解法FDNB、DNS法、層析、色譜、質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解，反應中除了C端氨基酸以游離形式存在外，其他的氨基酸都轉變成相應的氨基酸酰肼化物。肼解法是測定C末端殘基最重要的化學方法。肼解過程中，Asn、Gln和Cys等被破壞，C末端Arg變成鳥氨酸與苯甲醛作用成水不溶性沉淀氨基酸酰肼游離氨基酸C-末端氨基酸鑒定——還原法肽鏈C末端AAα-氨基醇+氨基酸層析、HPLC、質(zhì)譜等鑒定水解C-末端氨基酸鑒定——羧肽酶法概念：一類肽鏈外切酶，專一地從肽鏈的羧基端開始逐個降解，釋放出游離氨基酸，被釋放氨基酸量對反應時間做動力學曲線，判斷C端氨基酸序列。方法：常用4種羧肽酶對多肽進行處理。例如，羧肽酶A能釋放除Pro、Arg、Lys之外的C末端殘基；羧肽酶B則只水解Arg、Lys為C末端的肽鍵。A+B則可以釋放除Pro之外的任意C端aa殘基；羧肽酶Y則可以作用于任何一個C末端殘基。二硫鍵斷裂當幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起時，用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍使蛋白變性，暴露出分子內(nèi)部的S-S鍵；過甲酸氧化法和巰基化合物還原法打開二硫鍵；用烷基化試劑，如碘乙酸，保護生成的巰基，以防止它重新被氧化；氨基酸組成分析酸水解堿水解1.酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時；此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基被水解成了羧基。2、堿水解一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時；由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高；部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化；該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受破壞。水解后的氨基酸組成分析多肽鏈的部分裂解化學裂解法溴化氰：Met-X羥胺NH2OH：Asn-GlyEdman測序可以連續(xù)降解幾十個氨基酸，但是天然蛋白長度多在100個氨基酸殘基以上，因此必須把蛋白分子用蛋白酶水解或者化學裂解成小的肽段。A.溴化氰斷裂：Met-Xp129斷裂由甲硫氨酸殘基（Met）的羧基參加形成的肽鍵。蛋白中甲硫氨酸含量少，所以可以產(chǎn)生不多的肽鏈。B.羥胺斷裂：Asn-GlyNH2OH在pH9時能夠?qū)Ｒ恍詳嗔袮sn-Gly之間的肽鍵，Asn-Leu和Asn-Ala之間的鍵也能斷開。2.蛋白酶裂解法概念：用于肽鏈裂解的蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶等。這些蛋白酶都是從肽鏈內(nèi)部進行裂解，又稱內(nèi)肽酶。每種酶有不同的專一性酶切位點：多肽鏈的分離純化肽段序列的測定N-端分析法（Edman降解）能夠不斷重復循環(huán)，將N端氨基酸逐個標記和解離，已有機械化的蛋白質(zhì)測序儀B.氨肽酶或羧肽酶法從肽鏈的N-末端或者C-末端逐個向里切，繪制水解時間與釋放氨基酸的量來確定肽鏈的氨基酸組成。但是局限性大，只適合檢測末端幾個氨基酸C.質(zhì)譜用樣品量少，靈敏度高，速度快，是主流肽段序列的測定-Edmandegradation苯異硫氰酸酯法已自動化-氨基酸測序儀水解、分離氨基酸二硝基氟苯二硝基苯基谷氨酸還原二硫鍵E（Glu）是氨基酸的N末端用胰蛋白酶酶解、分離片段、Edman測序用溴化氰裂解、分離片段、Edman測序拼接序列N端C端含有38個氨基酸殘基；如果用Trysin酶解，可產(chǎn)生4個肽段；用溴化氰裂解產(chǎn)生3個肽段。T-2是N末端，因為其末端為Glu(E);T-3是C末端，因為其不以Arg(R)、Lys(K)結尾C-3與T-1和T-4都重疊肽段序列的測定-質(zhì)譜肽段序列的測定-推定法用特異性低的蛋白酶，例如胃蛋白酶，

水解蛋白質(zhì)成小片段的肽段對角線電泳——樣品點在濾紙中央一向電泳用過甲酸蒸氣斷裂二硫鍵旋轉90度，進行第二向電泳茚三酮顯色常規(guī)肽段在對角線上含硫磺基丙氨酸肽段偏離對角線對含有硫磺基丙氨酸肽段進行序列分析二硫鍵位置的確定四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物學功能（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化（1）同源蛋白質(zhì)：在不同生物中行使相同或相似生物學功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)，例如血紅蛋白。其氨基酸序列具有明顯的相似性，即同源性。同源蛋白具有一個進化祖先。（2）同源蛋白質(zhì)的某些位置的氨基酸殘基在已研究過的物種中都是相同的，這些氨基酸殘基成為不變殘基；其他在不同物種中變化大的則稱為可變殘基。含有血紅素的細胞色素cN端C端1Gly6Gly10Phe17Cys18His29Gly30Pro32Leu4145Gly48Tyr38Arg34Gly52Asn68Leu59Trp7080Met8284Gly91Arg100Gly細胞色素c及其系統(tǒng)進化樹：對40多種物種中的細胞色素C氨基酸序列分析，其多肽鏈中28個氨基酸殘基在所有分析過的樣品中都是保守的。第70-80間的保守氨基酸是成串存在?？勺儦埢赡苁翘畛浠蛘唛g隔的區(qū)域，其變化不會影響蛋白質(zhì)的功能；任兩個物種間細胞色素c的氨基酸差異數(shù)目越多，進化上相距越遠。四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物學功能>CproteininSalmonellaentericaMSKLVQAYDLAEYEDFINQEQFAGRPLAEYVAEVQRIYCADKRPWVIGYSGGKDSSAVITLVYLALLGLPPEMRSKDVFIVSSDTLVETPVVVDLIKKTMLQIEAGAKRNGLPITQHAVTPKTNETFWVNLLGKGYPAPTRSFRWCTERMKINPVSDFIKDKVSQFDEVIVVLGSRSSESASRAQVIAKHKIDGSRLARHTTLANAFIYTPIDTWDVEDVWKLLRGAFRYAPEDIDEWESPWGGNNRPLWTLYMDSSAQGECPLVIDESTPSCGNSRFGCWTCTVVTKDKAMESLIKNGEEWMSPLLKYRDLLAFTTDPANKDTYRNYKRRTGKVSYQYAKDGED