第二章基因工程制藥新版4課件

第三節(jié)基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程一、工具酶的分離純化二、載體的分離純化三、外源DNA和目的基因的分離和獲得四、外源DNA與載體DNA的切割與連接五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮髁?、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點七、基因工程菌中試八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù)十、變性蛋白的復(fù)性十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制十二、基因工程藥物的制造實例第三節(jié)基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程一、工具酶的分離純化五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮?/p>

體外重組的DNA分子，如果不引入到宿主細(xì)胞，則無法顯示其生命力，而只是表現(xiàn)出純粹的試劑性質(zhì)。隨著時間的推移而逐漸失活。

（一）宿主細(xì)胞的選擇（二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù)（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)（四）酵母菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)（五）動物細(xì)胞中的基因?qū)牒捅磉_(dá)五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮黧w外重組的DNA分子，如（一）宿主細(xì)胞的選擇1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件2、宿主細(xì)胞的類型（一）宿主細(xì)胞的選擇1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞。（2）能夠利用廉價原料進(jìn)行生產(chǎn)。（3）不致病。（4）不產(chǎn)生內(nèi)毒素。（5）發(fā)熱量低。（6）需氧低。（7）具有一定的細(xì)胞形態(tài)。（8）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度。（9）容易進(jìn)行代謝調(diào)控。（10）容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作。（11）產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定、產(chǎn)率高。（12）產(chǎn)物容易提取和純化。1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞。2、宿主細(xì)胞的類型

原核細(xì)胞類：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。

真核細(xì)胞類：酵母菌、絲狀真菌、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和植物細(xì)胞。（1）大腸桿菌（2）枯草芽孢桿菌（3）鏈霉菌（4）酵母菌（5）絲狀真菌（6）動物細(xì)胞2、宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈（1）大腸桿菌優(yōu)點：

（1）生長迅速、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)。

（2）分子遺傳結(jié)構(gòu)清楚、操作簡單。

（3）基因工程研究中采用最多的表達(dá)體系。（1）大腸桿菌優(yōu)點：

（1）生長迅速、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)。

（2缺點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時需破碎細(xì)胞。

（2）細(xì)胞破碎時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)也會釋放出來，形成雜質(zhì)。給提取帶來困難。

（3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常形成包含體，在提取后必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理才能恢復(fù)生物活性。

（4）大腸桿菌中不存在翻譯后修飾系統(tǒng)，不能對蛋白產(chǎn)物進(jìn)行糖基化及磷酸化等修飾。

（5）大腸桿菌內(nèi)的蛋白酶會對目的蛋白造成破壞。

（6）大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素，難去除。缺點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時需破碎細(xì)胞。

（2

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物18種：

重組人甲狀旁腺激素、胰島素、生物激素、白介素、干擾素等主要為細(xì)胞因子類藥物。至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物（2）枯草芽孢桿菌優(yōu)點：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中。

（2）不會形成包含體。缺點：

（1）不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化。

（2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的胞外蛋白酶分泌系統(tǒng)，常常對蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成破壞。（2）枯草芽孢桿菌優(yōu)點：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)（3）鏈霉菌優(yōu)點：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分泌能力強(qiáng)，

（4）可將培養(yǎng)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，

（5）具有糖基化能力近年來，作為外源基因表達(dá)體系，正日益受到人們的重視。（3）鏈霉菌優(yōu)點：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）（4）酵母菌

釀酒酵母研究最為透徹。干擾素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中進(jìn)行克隆和表達(dá)。優(yōu)點：

（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核生物，

（2）其基因組小、繁殖迅速、可以利用廉價材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，

（3）無毒性，

（4）基因工程操作簡單，

（5）表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接分泌出細(xì)胞外，

（6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化，

（7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。（4）酵母菌釀酒酵母研究最為透徹。干擾素和乙肝表面抗原基

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物8種：

胰高血糖素、巨細(xì)胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰島素（Novolin）、水蛭素等。雖然酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)有糖基化修飾，但是糖鏈結(jié)構(gòu)和組成與天然糖蛋白相差甚遠(yuǎn)，對于那些糖鏈極大影響生物活性的蛋白質(zhì)，如EPO、治療性抗體等，仍不能用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)（5）絲狀真菌

曲霉被認(rèn)為一種安全菌株、并且已經(jīng)對它形成了成熟的發(fā)酵和后處理工藝。優(yōu)點：

（1）有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，

（2）能正確地進(jìn)行翻譯后的加工，如進(jìn)行糖基化、肽剪切。（5）絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株、并且已經(jīng)對它形成了（6）動物細(xì)胞優(yōu)點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（2）培養(yǎng)液成份完全由人所控制，

（3）所分泌的基因產(chǎn)物接近于天然產(chǎn)物，

（4）產(chǎn)物容易得到提純。缺點：

（1）生產(chǎn)慢、

（2）生產(chǎn)率低、

（3）培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用高，

（4）培養(yǎng)液濃度較稀。（6）動物細(xì)胞優(yōu)點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物53種，其中激素類5種，酶7種，細(xì)胞因子7種，凝血因子5種，治療性抗體17種。

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的基因重組表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式（二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化作用2、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化作用1、轉(zhuǎn)化作用（1）基本概念（2）轉(zhuǎn)化作用的特性（3）感受態(tài)細(xì)胞（4）人工感受態(tài)細(xì)胞（5）轉(zhuǎn)化程序（6）影響轉(zhuǎn)化的因素1、轉(zhuǎn)化作用（1）基本概念（1）基本概念

轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程.（1）基本概念轉(zhuǎn)化(transformation)：（2）轉(zhuǎn)化作用的特性（1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。（2）轉(zhuǎn)化作用的前提條件是宿主細(xì)胞必須轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞。（3）轉(zhuǎn)化作用的先決條件是要獲得攜帶目的基因的重組DNA分子。（2）轉(zhuǎn)化作用的特性（1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。（3）感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)(competent):指細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)可攝取外源性遺傳物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)重組成為染色體中的一部分,導(dǎo)致受體細(xì)胞某些遺傳性狀的改變。（3）感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)(competent):指細(xì)胞在一定（4）人工感受態(tài)細(xì)胞

在基因工程中，宿主細(xì)胞經(jīng)過人工處理，最后成為感受態(tài)細(xì)胞，稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。所有生物細(xì)胞均可處理成人工感受態(tài)細(xì)胞。制備人工感受態(tài)細(xì)胞的方法：

（1）將對數(shù)生長期細(xì)胞于低溫、低滲的CaCl2溶液中處理，就可成為感受態(tài)細(xì)胞。

（2）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多價陽離子DETE-Sephadex處理，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，也能成為感受態(tài)細(xì)胞。（4）人工感受態(tài)細(xì)胞在基因工程中，宿主細(xì)胞經(jīng)過人工處理，[5]轉(zhuǎn)化程序

大腸桿菌E.coli培養(yǎng)至對數(shù)生長期

↓

取20ml，懸浮于0.1MCaCl2

↓

離心，收集沉淀的原生質(zhì)球。

↓

再懸浮于0.1MCaCl2

↓

加入2-3ug重組的DNA，混勻↓

0℃放置30min

↓

42℃，90s

↓

冰浴5min

↓

離心，收集沉淀的細(xì)胞

↓

將細(xì)胞涂于選擇性培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)

↓

根據(jù)菌落特性，篩選出基因工程菌[5]轉(zhuǎn)化程序大腸桿菌E.coli培養(yǎng)至對數(shù)生長期

（6）影響轉(zhuǎn)化的因素

重組DNA轉(zhuǎn)化率很低，在0.1%左右。影響因素：

（1）宿主的限制酶對外源性重組DNA的限制作用，會大大降低轉(zhuǎn)化率，

（2）宿主細(xì)胞的人工感受態(tài)形成率，會影響轉(zhuǎn)化率，

（3）重組DNA的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化率有一定的關(guān)系，環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)化率要比線性DNA高出10-100倍，

（4）外源基因與宿主DNA和同源性越高，其轉(zhuǎn)化率也越高。

（5）重組DNA的濃度越高、其轉(zhuǎn)化率也越高，DNA的純度越高、其轉(zhuǎn)化率也越高。（6）影響轉(zhuǎn)化的因素重組DNA轉(zhuǎn)化率很低，在0.1%左右轉(zhuǎn)化過程總結(jié)示意圖轉(zhuǎn)化過程總結(jié)示意圖2、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（1）基本概念（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類2、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（1）基本概念（1）基本概念

自然界中，通過噬菌體或者病毒的感染作用，將一個細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。感受態(tài)細(xì)胞吸收以噬菌體、病毒為載體的重組DNA的過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。也屬于轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。自然界許多溫和噬菌體都具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。（1）基本概念自然界中，通過噬菌體或者病毒的感染作用，將（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件

體外重組的DNA，要通過轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，必須經(jīng)過蛋白質(zhì)包裝的環(huán)節(jié)，

DNA+噬菌體頭部蛋白+噬菌體尾部蛋白→形成完整的噬菌體顆粒，才具有感染能力。

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件體外重組的DNA，要通過轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入宿主細(xì)（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序[B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序蛋白質(zhì)的體外包裝是通過互補(bǔ)作用實現(xiàn)的。λ噬菌體的D基因、E基因是表達(dá)蛋白質(zhì)的主要基因。（1）D基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占20%、D基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭部蛋白。（2）E基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占78%、E基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭尾蛋白。[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序蛋白質(zhì)的體外包裝是通過互補(bǔ)作用實現(xiàn)[B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序

用于制備包裝蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞------cI857大腸桿菌E.coli、BHB2690、BHB2688。

↓

D基因突變型宿主BHB2690培養(yǎng)、并且進(jìn)行溶菌處理，提取DNA-d

++

外源性目的基因DNA

++

E基因突變型宿主BHB2688培養(yǎng)、并且進(jìn)行溶菌處理，提取DNA-e

↓

溫育,包裝成完整的外源基因-λ噬菌體重組顆粒。（具有再感染能力）

↓

去感染大腸桿菌E.coli

↓

完成轉(zhuǎn)導(dǎo)[B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序用于制備包裝蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞------（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類

（1）限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用----由溫和的噬菌體或者病毒DNA為載體所構(gòu)成的重組DNA，經(jīng)過體外包裝，形成完整的噬菌體或者病毒顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)。（2）廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用----任意DNA片段，或者重組的DNA，經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)。（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類（1）限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用----由溫和的噬菌3、脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用（1）定義（2）脂質(zhì)體的特性（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用3、脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用（1）定義（1）定義

將重組的DNA分子包埋于脂質(zhì)體微囊之中，通過脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞的融合作用，而將外源性目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的過程稱為脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用。（1）定義將重組的DNA分子包埋于脂質(zhì)體微囊之中，通過脂（2）脂質(zhì)體的特性脂質(zhì)體：人工構(gòu)建的由磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)。原理：受體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力作用，把DNA、mRNA及單鏈RNA等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)主要適用于真核細(xì)胞,可對基因進(jìn)行瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。（2）脂質(zhì)體的特性脂質(zhì)體：人工構(gòu)建的由磷脂雙分子層組成的膜狀（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟分為2步：（A）人工脂質(zhì)體的制備（B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟分為2步：（A）人工脂質(zhì)體的制備在含有重組DNA分子的水溶液中+磷脂

+吐溫80（乳化劑）↓通過激烈攪拌或者超聲波處理，將磷脂分散到水溶液之中↓再經(jīng)過靜置，磷脂分子群聚形成液晶態(tài)脂質(zhì)雙層薄膜↓將DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂質(zhì)體。（A）人工脂質(zhì)體的制備在含有重組DNA分子的水溶液中+磷（B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合

將脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞混合，在PEG、或者在其它促融劑的作用下，經(jīng)過一定條件就會產(chǎn)生融合作用，最終將重組DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞之中。（B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合將脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞混合，（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用

對于一些微生物如放線菌細(xì)胞，由于無法形成感受態(tài)，也就不能通過轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入外源性DNA。但是，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，就能實現(xiàn)脂質(zhì)體與放線菌細(xì)胞之間的融合，來獲得基因工程放線菌。（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用對于一些微生物如放線菌細(xì)胞，由于無脂質(zhì)體2000:Invitrogen

,規(guī)格0.75ml/1.5ml

報價1700元/2900元

脂質(zhì)體2000:Invitrogen

,規(guī)格0.75m4、顯微鏡注射技術(shù)

在特定的顯微鏡下，用特制的玻璃微管，將重組的DNA直接注射到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法。顯微鏡注射技術(shù)是一種直接、簡單、而又準(zhǔn)確、可靠的DNA機(jī)械轉(zhuǎn)移技術(shù)。主要用于真核生物4、顯微鏡注射技術(shù)在特定的顯微鏡下，用特制的玻璃微管，將

是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù)，它把DNA包被在金或鎢的微粒中，然后由基因槍將此包被顆粒轉(zhuǎn)移到原位組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中，是目前國際上最先進(jìn)的基因?qū)爰夹g(shù)。

基因槍適用于動植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、細(xì)菌及小型動物的轉(zhuǎn)基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點。5、基因槍注射技術(shù)是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù)，它把DNA包被在金或鎢的微粒中基因槍注射技術(shù)基因槍注射技術(shù)利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡單、效率較高，幾乎所有細(xì)胞都可用此技術(shù)，此方法轉(zhuǎn)染的DNA不僅是線性的，還可是環(huán)狀的。

條件：電壓：300～600V

維持時間：20～100ms

溫度：0℃

6、電穿孔技術(shù)利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中7、磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

此法受二價金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。但轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1%~5%的外源DNA可進(jìn)入受體細(xì)胞核中，約有1%DNA可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。7、磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)此法受二價金屬8、病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒在包裝細(xì)胞內(nèi)可形成完整的病毒顆粒，并被釋放到培養(yǎng)基中，感染哺乳動物細(xì)胞，能有效實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。8、病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體2、真核基因?qū)氪竽c桿菌的具體方式3、影響真核基因?qū)氪竽c桿菌的因素（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體（1）pBV220（2）pET1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體（1）pBV220pBV220

侯云德

分子病毒學(xué)家中國工程院院士1.分離了我國副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型2.研制出包括α1b、α2a、α2b、γ等亞型的基因工程干擾素系列產(chǎn)品3.成功組建原核高效表達(dá)載體pBV220系列及pBV320系列通用型高效表達(dá)載體

pBV220侯云德

分子病毒學(xué)家中國工程院院士（1）pBV220

已經(jīng)成功用于表達(dá)IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多種細(xì)胞因子。

[A]、結(jié)構(gòu)

[B]、優(yōu)點（1）pBV220已經(jīng)成功用于表達(dá)IL-2、IL-3、I[A]、結(jié)構(gòu)

pBV220共3665bp。共由6個部份組成：（1）pUC8的MCS（2）核糖體rrnB終止信號（3）pBR322的第4252-3735位（4）pUC-18的第2066-680位（5）λ噬菌體cIts抑制基因+PR啟動子（6）pRC-23的PL啟動子+SD序列。[A]、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個部份組成：質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框

ori-------復(fù)制起始點

clts857-------抑制子基因，在31℃時，其基因產(chǎn)物具有阻抑PL活性，當(dāng)溫度升高時，這種阻抑活性就喪失，PL開始指導(dǎo)合成mRNA。

PR----啟動子1

PL-----啟動子2

BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、HindIII、PstI---限制酶切位點形成多克隆區(qū)域，在此插入外源性目的基因。

RrnB----核糖體終止基因（終止子）

PvuI-----青霉素抗性基因Ampr。質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框ori-------復(fù)[B]、優(yōu)點（1）可轉(zhuǎn)化任何菌株（2）能防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象（3）質(zhì)粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量（4）能插入大片段的外源基因[B]、優(yōu)點（1）可轉(zhuǎn)化任何菌株（2）pET

pET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌體。[A]、克隆宿主可用大腸桿菌K12的HB101、JM103等細(xì)胞。pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會造成宿主的細(xì)胞損傷。[B]、表達(dá)受宿主細(xì)胞的T7RNA聚合酶控制。表達(dá)宿主為BL21、λDE30。表達(dá)菌在LB培養(yǎng)基、或在M9培養(yǎng)基中生長良好。[C]、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。（2）pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌MCSpET32a(+)以T7lac作為啟動子；pET32a(+)還帶有T7.Tag和His-Tag融合標(biāo)簽，此類標(biāo)簽可用于檢測和純化相關(guān)目的蛋白；pET32a(+)上與目的基因共表達(dá)的硫氧還蛋白可以促進(jìn)二硫鍵形成，增加目的蛋白可溶性，便于分離純化。MCSpET32a(+)以T7lac作為啟動子；2、真核基因?qū)氪竽c桿菌具體方式共有3種方式（1）融合蛋白（2）非融合蛋白（3）分泌型表達(dá)蛋白2、真核基因?qū)氪竽c桿菌具體方式共有3種方式（1）融合蛋白[A]、定義[B]、優(yōu)缺點[C]、改進(jìn)措施[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式（1）融合蛋白[A]、定義第二章基因工程制藥新版4課件[A]、定義

是指產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同時含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白。融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而羧基端則由真核基因編碼。最終表達(dá)出來的蛋白質(zhì)=1條原核多肽+1條真核多肽，稱為融合蛋白。

[A]、定義是指產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同時含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點：

（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌的酶類所降解，

（2）容易實現(xiàn)高效表達(dá)，

（3）基因操作簡便。缺點：

由于蛋白質(zhì)中含有細(xì)菌蛋白，會影響真核蛋白的免疫原性，只能用作抗原,不能作為人體注射用藥。[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點：

（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被[C]、改進(jìn)措施（1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Ile-Glu-Gly-Arg，可被人體內(nèi)的凝血因子Xa識別而切開。在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子X、膠原酶、腸激肽酶）對融合蛋白進(jìn)行降解。（2）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Met，CNBr可專一性識別Met并切開，形成原核多肽+真核蛋白質(zhì)分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。[C]、改進(jìn)措施（1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Ile-Gl[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式

融合基因----融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—原核結(jié)構(gòu)基因片段—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建（D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)）（D3）融合蛋白的切除方法[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式融合基因----融合蛋白

關(guān)鍵：融合蛋白與外源蛋白的閱讀框要對齊兩個蛋白的結(jié)合位點的設(shè)計很重要，應(yīng)便于下一步切除融合蛋白的操作。（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建關(guān)鍵：（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建（D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)）（D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)）（D3）受體蛋白的切除方法化學(xué)斷裂法：溴化氰（CNBr）--Met-（切點）-AA酶促斷裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，識別序列:Ile－Glu－Gly－Arg-（切點）-AA（D3）受體蛋白的切除方法化學(xué)斷裂法：溴化氰（CNBr）--（2）非融合蛋白[A]、定義[B]、優(yōu)缺點[C]、具體表達(dá)方式（2）非融合蛋白[A]、定義[A]、定義

非融合蛋白表達(dá)方式是指工程菌大腸桿菌進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯時，是以真核生物的mRNA的AUG為翻譯起始點，最后表達(dá)出的蛋白質(zhì)中不含細(xì)菌蛋白。非融合蛋白表達(dá)方式也稱為包涵體型外源蛋白的表達(dá)。[A]、定義非融合蛋白表達(dá)方式是指工程菌大腸桿菌進(jìn)行蛋白[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點----非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)的生物活性。缺點：

（1）容易被細(xì)菌體內(nèi)的蛋白酶所破壞，

（2）非融合蛋白的氨基端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時常常引起人體的免疫反應(yīng)。[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點----非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)[C]、非融合蛋白的具體表達(dá)方式非融合蛋白表達(dá)方式可分為2種：

（C1）非融合基因—非融合蛋白（C2）融合基因—非融合蛋白[C]、非融合蛋白的具體表達(dá)方式非融合蛋白表達(dá)方式可分為2種（C1）非融合基因—非融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—ATG—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”

要求1：SD序列和ATG之間的距離要合適，相差2-3個堿基，其表達(dá)效率就大受影響。

要求2：

ATG和真核結(jié)構(gòu)基因序列之間必須加接人工接頭，以保證ATG之后的真核基因不發(fā)生通讀框架的改變。（C1）非融合基因—非融合蛋白基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子（C2）融合基因—非融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—原核ATG—TGATG（真核基因起始結(jié)構(gòu)）—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”

這一方式能夠提高表達(dá)效率。（C2）融合基因—非融合蛋白基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原（3）分泌型表達(dá)蛋白[A]、定義[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示[C]、常用的大腸桿菌信號肽[D]、優(yōu)缺點（3）分泌型表達(dá)蛋白[A]、定義[A]、定義

分泌型表達(dá)蛋白是利用大腸桿菌的信號肽基因來構(gòu)建分泌型表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因接在信號肽基因后，當(dāng)表達(dá)的目的蛋白跟隨著信號肽來到細(xì)胞周質(zhì)，被細(xì)胞周質(zhì)中的信號肽酶識別而切除,從而釋放有生物活性的蛋白質(zhì)?；蚪Y(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—原核結(jié)構(gòu)基因片段—細(xì)菌信號肽基因—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”。[A]、定義分泌型表達(dá)蛋白是利用大腸桿菌的信號肽基因來構(gòu)[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示[C]、常用的大腸桿菌信號肽堿性磷酸酶信號肽（phoA）膜外周質(zhì)蛋白質(zhì)信號肽（OmpA）霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）

[C]、常用的大腸桿菌信號肽堿性磷酸酶信號肽（phoA）[D]、優(yōu)缺點優(yōu)點：

（1）表達(dá)時沒有活性的蛋白質(zhì)，通過信號肽切割，能產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)，

（2）分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由于經(jīng)過切割，不含起始密碼ATG所編碼的甲硫氨酸，不會引起人體的免疫反應(yīng)。缺點：

（1）產(chǎn)量不高，

（2）信號肽不進(jìn)行切割或不能定點切割。[D]、優(yōu)缺點優(yōu)點：

（1）表達(dá)時沒有活性的蛋白質(zhì)，通過信號3、影響真核基因在大腸桿菌表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)量（2）影響轉(zhuǎn)錄水平的因素在目的基因上游，必須安裝一個適當(dāng)?shù)膯幼印３Ｒ姷膯幼佑衛(wèi)ac、trp、tac、bla等。

3、影響真核基因在大腸桿菌表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)量（3）影響翻譯水平的因素①核糖體結(jié)合位點的有效性直接影響基因產(chǎn)物的表達(dá)。②SD序列和真核基因起始密碼ATG間的間距，會影響基因產(chǎn)物的表達(dá)。③mRNA的二級結(jié)構(gòu)，特別是5’端的二級結(jié)構(gòu)。④mRNA的穩(wěn)定性，通常它的半衰期為幾秒-25min.⑤密碼子偏愛性是影響翻譯效率的重要因素。（3）影響翻譯水平的因素(4)影響蛋白質(zhì)水平的因素①表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

蛋白酶降解表達(dá)的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)分子量越小，表達(dá)產(chǎn)物越不穩(wěn)定解決方案：

A構(gòu)建融合蛋白

B利用信號肽

C位點特異突變(p77為例)D蛋白酶缺陷型大腸桿菌(4)影響蛋白質(zhì)水平的因素②細(xì)胞代謝負(fù)荷減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷：A細(xì)胞生長和外源基因表達(dá)分開B細(xì)胞生長與重組質(zhì)粒復(fù)制分開②細(xì)胞代謝負(fù)荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件

溫度誘導(dǎo)劑濃度誘導(dǎo)時間（5）工程菌的培養(yǎng)條件（四）酵母菌中基因?qū)牒捅磉_(dá)

酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)包括----載體，啟動子等控制序列，宿主細(xì)胞。

1、載體2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素（四）酵母菌中基因?qū)牒捅磉_(dá)酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)包括----1、載體（1）定義（2）類別（3）克隆載體（4）表達(dá)載體1、載體（1）定義（1）定義

酵母載體是可以攜帶外源性目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)、并且能在酵母細(xì)胞內(nèi)保存、復(fù)制、隨著酵母細(xì)胞的分裂而傳遞到子代細(xì)胞的DNA或者RNA單位。（1）定義酵母載體是可以攜帶外源性目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)（2）類別（A）YEp----稱作酵母附加體質(zhì)粒，這類載體相對比較穩(wěn)定，并且具有較高的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化率，因此得到了廣泛的應(yīng)用。（B）YRp----稱作酵母復(fù)制型質(zhì)粒，這類載體穩(wěn)定性差、拷貝數(shù)量小。（C）YCp----稱作酵母著絲粒質(zhì)粒，這類載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有1個。（D）YIp----稱作酵母整合型質(zhì)粒，這類載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有1個。（2）類別（A）YEp----稱作酵母附加體質(zhì)粒，這類載體相（3）克隆載體

從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備多數(shù)是在大腸桿菌中進(jìn)行的，只在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母。那些既能夠在大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，又能夠在酵母菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇的載體，稱作克隆載體。在酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori、Ampr、Tetr部分，構(gòu)成的載體同時帶有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點和選擇標(biāo)記位點。（3）克隆載體從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易，因此（4）表達(dá)載體

表達(dá)載體=酵母菌啟動子

+載體+外源性目的DNA+酵母菌終止子。表達(dá)載體分為2類：

（1）普通表達(dá)載體----只要能方便地引入外源基因并表達(dá)，對于表達(dá)產(chǎn)物的組成、氨基酸序列無特定的嚴(yán)格要求。

（2）精確表達(dá)載體----此類載體要求外源基因有特定的插入位點，以便基因表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相同。既無多余的也無缺失的氨基酸。（4）表達(dá)載體表達(dá)載體=酵母菌啟動子+載體+2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)量（2）啟動子的類型（3）分泌信號的表達(dá)效率（4）終止序列對表達(dá)效率也有影響（5）外源蛋白質(zhì)的糖基化（6）宿主酵母菌株性能2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)量（1）外源基因的拷貝數(shù)量

外源基因的拷貝數(shù)量及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性對于基因表達(dá)起決定作用。（1）外源基因的拷貝數(shù)量外源基因的拷貝數(shù)量及其在宿主細(xì)胞（2）啟動子的類型

酵母菌啟動子

=上游激活序列

+近端啟動子（內(nèi)含一個起始密碼子和轉(zhuǎn)錄所必需的TATA序列）。酵母菌啟動子類型分2類：

（1）組成型啟動子----它在酵母生長的各時期都能發(fā)揮作用。具體的啟動子基因有PGK、ENOL、GAPDH、CYCl、TRI、MF、ADH1，2。

（2）誘導(dǎo)型啟動子----啟動子基因有PH05、GALI、GAL10，其基因表達(dá)受誘導(dǎo)物的影響.（2）啟動子的類型酵母菌啟動子=上游激活序列+近（3）分泌信號的表達(dá)效率分泌信號的表達(dá)效率對于目的基因表達(dá)有影響。分泌信號

=信號肽+前導(dǎo)肽的編碼序列分泌信號幫助目的蛋白質(zhì)分泌出酵母細(xì)胞，而且會對蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化加工和修飾。（3）分泌信號的表達(dá)效率分泌信號的表達(dá)效率對于目的基因表達(dá)有（4）終止序列對表達(dá)效率也有影響常用終止序列：ADH1CYC1MfalPGK（4）終止序列對表達(dá)效率也有影響常用終止序列：（5）外源蛋白質(zhì)的糖基化

應(yīng)用酵母菌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的糖基化能夠增強(qiáng)所表達(dá)出蛋白質(zhì)的生理活性。外源蛋白經(jīng)過釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊和糖基化，可以更有效地以活性形態(tài)分泌到培養(yǎng)基中，便于精制和分離。（5）外源蛋白質(zhì)的糖基化應(yīng)用酵母菌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的糖基化（6）宿主酵母菌株性能

宿主酵母的生理狀況等因素對外源基因的表達(dá)有明顯的影響。作為表達(dá)用的酵母菌株應(yīng)該具備下列條件：

（1）菌體生長能力要強(qiáng)大。

（2）菌體內(nèi)源蛋白酶要弱。

（3）菌株的性能要穩(wěn)定。

（4）菌株的分泌能力要強(qiáng)。（6）宿主酵母菌株性能宿主酵母的生理狀況等因素對外源基因第二章基因工程制藥新版4課件（五）動物細(xì)胞中基因?qū)牒捅磉_(dá)1、轉(zhuǎn)基因動物的歷史2、反轉(zhuǎn)錄病毒法構(gòu)建3、顯微注射法構(gòu)建4、優(yōu)點5、缺點（五）動物細(xì)胞中基因?qū)牒捅磉_(dá)1、轉(zhuǎn)基因動物的歷史1、轉(zhuǎn)基因動物的歷史轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal）:通過基因工程技術(shù)將外源DNA導(dǎo)入動物生殖細(xì)胞，干細(xì)胞，早期胚胎，并在染色體上整合，穩(wěn)定傳給子代的技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)基因組改變的動物稱轉(zhuǎn)基因動物。1、轉(zhuǎn)基因動物的歷史轉(zhuǎn)基因動物(transgenicani1982，Palmiter將大鼠的生長激素基因用微注射方法導(dǎo)入小鼠的受精卵中獲得巨型小鼠（supermouse），從而在理論上和實踐意義上都將轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高一步，引起生物學(xué)界極大的關(guān)注，為基因工程育種提供誘人的前景。1982，Palmiter將大鼠的生長激素基因用微注射方法導(dǎo)外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系外源目的基因的制備

2、反轉(zhuǎn)錄病毒法構(gòu)建利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（≤10kb） 2、反轉(zhuǎn)錄病毒法構(gòu)建利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（3、顯微注射法構(gòu)建

在光學(xué)顯微鏡下，利用顯微操作儀，直接把DNA注射到動物早期胚胎、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞或卵母細(xì)胞中，然后生產(chǎn)動物個體的技術(shù)。3、顯微注射法構(gòu)建在光學(xué)顯微鏡下，利用顯微操作儀，5、優(yōu)點（1）基因的表達(dá)產(chǎn)物可以迅速通過細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液之中，（2）培養(yǎng)液成人完全能夠進(jìn)行人工控制，（3）基因產(chǎn)物在動物細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了糖基化，更加接近于天然產(chǎn)物。5、優(yōu)點（1）基因的表達(dá)產(chǎn)物可以迅速通過細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液之中6、缺點（1）動物細(xì)胞生長慢。（2）單位體積的生產(chǎn)率低。（3）培養(yǎng)條件要求苛刻、費(fèi)用高。（4）由于用于基因表達(dá)的細(xì)胞均為傳代細(xì)胞，而一般認(rèn)為傳代細(xì)胞都是惡化性細(xì)胞，因此，由它所生產(chǎn)出的基因表達(dá)產(chǎn)物有可能存在致癌的疑問。6、缺點（1）動物細(xì)胞生長慢。1、每一個成功者都有一個開始。勇于開始，才能找到成功的路。1月-231月-23Friday,January6,20232、成功源于不懈的努力，人生最大的敵人是自己怯懦。22:09:1422:09:1422:091/6/202310:09:14PM3、每天只看目標(biāo)，別老想障礙。1月-2322:09:1422:09Jan-2306-Jan-234、寧愿辛苦一陣子，不要辛苦一輩子。22:09:1422:09:1422:09Friday,January6,20235、積極向上的心態(tài)，是成功者的最基本要素。1月-231月-2322:09:1422:09:14January6,20236、生活總會給你另一個機(jī)會，這個機(jī)會叫明天。06一月202310:09:14下午22:09:141月-237、人生就像騎單車，想保持平衡就得往前走。一月2310:09下午1月-2322:09January6,20238、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/1/622:09:1422:09:1406January20239、我們必須在失敗中尋找勝利，在絕望中尋求希望。10:09:14下午10:09下午22:09:141月-2310、一個人的夢想也許不值錢，但一個人的努力很值錢。1/6/202310:09:14PM22:09:1406-1月-2311、在真實的生命里，每樁偉業(yè)都由信心開始，并由信心跨出第一步。1/6/202310:09PM1/6/202310:09PM1月-231月-23謝謝大家1、每一個成功者都有一個開始。勇于開始，才能找到成功的路。1104第三節(jié)基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程一、工具酶的分離純化二、載體的分離純化三、外源DNA和目的基因的分離和獲得四、外源DNA與載體DNA的切割與連接五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮髁?、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點七、基因工程菌中試八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù)十、變性蛋白的復(fù)性十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制十二、基因工程藥物的制造實例第三節(jié)基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程一、工具酶的分離純化五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮?/p>

體外重組的DNA分子，如果不引入到宿主細(xì)胞，則無法顯示其生命力，而只是表現(xiàn)出純粹的試劑性質(zhì)。隨著時間的推移而逐漸失活。

（一）宿主細(xì)胞的選擇（二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù)（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)（四）酵母菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)（五）動物細(xì)胞中的基因?qū)牒捅磉_(dá)五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮黧w外重組的DNA分子，如（一）宿主細(xì)胞的選擇1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件2、宿主細(xì)胞的類型（一）宿主細(xì)胞的選擇1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞。（2）能夠利用廉價原料進(jìn)行生產(chǎn)。（3）不致病。（4）不產(chǎn)生內(nèi)毒素。（5）發(fā)熱量低。（6）需氧低。（7）具有一定的細(xì)胞形態(tài)。（8）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度。（9）容易進(jìn)行代謝調(diào)控。（10）容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作。（11）產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定、產(chǎn)率高。（12）產(chǎn)物容易提取和純化。1、宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞。2、宿主細(xì)胞的類型

原核細(xì)胞類：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。

真核細(xì)胞類：酵母菌、絲狀真菌、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和植物細(xì)胞。（1）大腸桿菌（2）枯草芽孢桿菌（3）鏈霉菌（4）酵母菌（5）絲狀真菌（6）動物細(xì)胞2、宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈（1）大腸桿菌優(yōu)點：

（1）生長迅速、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)。

（2）分子遺傳結(jié)構(gòu)清楚、操作簡單。

（3）基因工程研究中采用最多的表達(dá)體系。（1）大腸桿菌優(yōu)點：

（1）生長迅速、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)。

（2缺點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時需破碎細(xì)胞。

（2）細(xì)胞破碎時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)也會釋放出來，形成雜質(zhì)。給提取帶來困難。

（3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常形成包含體，在提取后必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理才能恢復(fù)生物活性。

（4）大腸桿菌中不存在翻譯后修飾系統(tǒng)，不能對蛋白產(chǎn)物進(jìn)行糖基化及磷酸化等修飾。

（5）大腸桿菌內(nèi)的蛋白酶會對目的蛋白造成破壞。

（6）大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素，難去除。缺點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時需破碎細(xì)胞。

（2

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物18種：

重組人甲狀旁腺激素、胰島素、生物激素、白介素、干擾素等主要為細(xì)胞因子類藥物。至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物（2）枯草芽孢桿菌優(yōu)點：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中。

（2）不會形成包含體。缺點：

（1）不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化。

（2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的胞外蛋白酶分泌系統(tǒng)，常常對蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成破壞。（2）枯草芽孢桿菌優(yōu)點：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)（3）鏈霉菌優(yōu)點：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分泌能力強(qiáng)，

（4）可將培養(yǎng)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，

（5）具有糖基化能力近年來，作為外源基因表達(dá)體系，正日益受到人們的重視。（3）鏈霉菌優(yōu)點：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）（4）酵母菌

釀酒酵母研究最為透徹。干擾素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中進(jìn)行克隆和表達(dá)。優(yōu)點：

（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核生物，

（2）其基因組小、繁殖迅速、可以利用廉價材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，

（3）無毒性，

（4）基因工程操作簡單，

（5）表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接分泌出細(xì)胞外，

（6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化，

（7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。（4）酵母菌釀酒酵母研究最為透徹。干擾素和乙肝表面抗原基

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物8種：

胰高血糖素、巨細(xì)胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰島素（Novolin）、水蛭素等。雖然酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)有糖基化修飾，但是糖鏈結(jié)構(gòu)和組成與天然糖蛋白相差甚遠(yuǎn)，對于那些糖鏈極大影響生物活性的蛋白質(zhì)，如EPO、治療性抗體等，仍不能用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)（5）絲狀真菌

曲霉被認(rèn)為一種安全菌株、并且已經(jīng)對它形成了成熟的發(fā)酵和后處理工藝。優(yōu)點：

（1）有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，

（2）能正確地進(jìn)行翻譯后的加工，如進(jìn)行糖基化、肽剪切。（5）絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株、并且已經(jīng)對它形成了（6）動物細(xì)胞優(yōu)點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（2）培養(yǎng)液成份完全由人所控制，

（3）所分泌的基因產(chǎn)物接近于天然產(chǎn)物，

（4）產(chǎn)物容易得到提純。缺點：

（1）生產(chǎn)慢、

（2）生產(chǎn)率低、

（3）培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用高，

（4）培養(yǎng)液濃度較稀。（6）動物細(xì)胞優(yōu)點：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物53種，其中激素類5種，酶7種，細(xì)胞因子7種，凝血因子5種，治療性抗體17種。

至2004年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的基因重組表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式（二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化作用2、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化作用1、轉(zhuǎn)化作用（1）基本概念（2）轉(zhuǎn)化作用的特性（3）感受態(tài)細(xì)胞（4）人工感受態(tài)細(xì)胞（5）轉(zhuǎn)化程序（6）影響轉(zhuǎn)化的因素1、轉(zhuǎn)化作用（1）基本概念（1）基本概念

轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程.（1）基本概念轉(zhuǎn)化(transformation)：（2）轉(zhuǎn)化作用的特性（1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。（2）轉(zhuǎn)化作用的前提條件是宿主細(xì)胞必須轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞。（3）轉(zhuǎn)化作用的先決條件是要獲得攜帶目的基因的重組DNA分子。（2）轉(zhuǎn)化作用的特性（1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。（3）感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)(competent):指細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)可攝取外源性遺傳物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)重組成為染色體中的一部分,導(dǎo)致受體細(xì)胞某些遺傳性狀的改變。（3）感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)(competent):指細(xì)胞在一定（4）人工感受態(tài)細(xì)胞

在基因工程中，宿主細(xì)胞經(jīng)過人工處理，最后成為感受態(tài)細(xì)胞，稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。所有生物細(xì)胞均可處理成人工感受態(tài)細(xì)胞。制備人工感受態(tài)細(xì)胞的方法：

（1）將對數(shù)生長期細(xì)胞于低溫、低滲的CaCl2溶液中處理，就可成為感受態(tài)細(xì)胞。

（2）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多價陽離子DETE-Sephadex處理，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，也能成為感受態(tài)細(xì)胞。（4）人工感受態(tài)細(xì)胞在基因工程中，宿主細(xì)胞經(jīng)過人工處理，[5]轉(zhuǎn)化程序

大腸桿菌E.coli培養(yǎng)至對數(shù)生長期

↓

取20ml，懸浮于0.1MCaCl2

↓

離心，收集沉淀的原生質(zhì)球。

↓

再懸浮于0.1MCaCl2

↓

加入2-3ug重組的DNA，混勻↓

0℃放置30min

↓

42℃，90s

↓

冰浴5min

↓

離心，收集沉淀的細(xì)胞

↓

將細(xì)胞涂于選擇性培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)

↓

根據(jù)菌落特性，篩選出基因工程菌[5]轉(zhuǎn)化程序大腸桿菌E.coli培養(yǎng)至對數(shù)生長期

（6）影響轉(zhuǎn)化的因素

重組DNA轉(zhuǎn)化率很低，在0.1%左右。影響因素：

（1）宿主的限制酶對外源性重組DNA的限制作用，會大大降低轉(zhuǎn)化率，

（2）宿主細(xì)胞的人工感受態(tài)形成率，會影響轉(zhuǎn)化率，

（3）重組DNA的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化率有一定的關(guān)系，環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)化率要比線性DNA高出10-100倍，

（4）外源基因與宿主DNA和同源性越高，其轉(zhuǎn)化率也越高。

（5）重組DNA的濃度越高、其轉(zhuǎn)化率也越高，DNA的純度越高、其轉(zhuǎn)化率也越高。（6）影響轉(zhuǎn)化的因素重組DNA轉(zhuǎn)化率很低，在0.1%左右轉(zhuǎn)化過程總結(jié)示意圖轉(zhuǎn)化過程總結(jié)示意圖2、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（1）基本概念（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類2、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（1）基本概念（1）基本概念

自然界中，通過噬菌體或者病毒的感染作用，將一個細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。感受態(tài)細(xì)胞吸收以噬菌體、病毒為載體的重組DNA的過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。也屬于轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。自然界許多溫和噬菌體都具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。（1）基本概念自然界中，通過噬菌體或者病毒的感染作用，將（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件

體外重組的DNA，要通過轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，必須經(jīng)過蛋白質(zhì)包裝的環(huán)節(jié)，

DNA+噬菌體頭部蛋白+噬菌體尾部蛋白→形成完整的噬菌體顆粒，才具有感染能力。

（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件體外重組的DNA，要通過轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入宿主細(xì)（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序[B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序蛋白質(zhì)的體外包裝是通過互補(bǔ)作用實現(xiàn)的。λ噬菌體的D基因、E基因是表達(dá)蛋白質(zhì)的主要基因。（1）D基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占20%、D基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭部蛋白。（2）E基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占78%、E基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭尾蛋白。[A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序蛋白質(zhì)的體外包裝是通過互補(bǔ)作用實現(xiàn)[B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序

用于制備包裝蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞------cI857大腸桿菌E.coli、BHB2690、BHB2688。

↓

D基因突變型宿主BHB2690培養(yǎng)、并且進(jìn)行溶菌處理，提取DNA-d

++

外源性目的基因DNA

++

E基因突變型宿主BHB2688培養(yǎng)、并且進(jìn)行溶菌處理，提取DNA-e

↓

溫育,包裝成完整的外源基因-λ噬菌體重組顆粒。（具有再感染能力）

↓

去感染大腸桿菌E.coli

↓

完成轉(zhuǎn)導(dǎo)[B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序用于制備包裝蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞------（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類

（1）限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用----由溫和的噬菌體或者病毒DNA為載體所構(gòu)成的重組DNA，經(jīng)過體外包裝，形成完整的噬菌體或者病毒顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)。（2）廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用----任意DNA片段，或者重組的DNA，經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)。（4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類（1）限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用----由溫和的噬菌3、脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用（1）定義（2）脂質(zhì)體的特性（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用3、脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用（1）定義（1）定義

將重組的DNA分子包埋于脂質(zhì)體微囊之中，通過脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞的融合作用，而將外源性目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的過程稱為脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用。（1）定義將重組的DNA分子包埋于脂質(zhì)體微囊之中，通過脂（2）脂質(zhì)體的特性脂質(zhì)體：人工構(gòu)建的由磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)。原理：受體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力作用，把DNA、mRNA及單鏈RNA等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)主要適用于真核細(xì)胞,可對基因進(jìn)行瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。（2）脂質(zhì)體的特性脂質(zhì)體：人工構(gòu)建的由磷脂雙分子層組成的膜狀（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟分為2步：（A）人工脂質(zhì)體的制備（B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合（3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟分為2步：（A）人工脂質(zhì)體的制備在含有重組DNA分子的水溶液中+磷脂

+吐溫80（乳化劑）↓通過激烈攪拌或者超聲波處理，將磷脂分散到水溶液之中↓再經(jīng)過靜置，磷脂分子群聚形成液晶態(tài)脂質(zhì)雙層薄膜↓將DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂質(zhì)體。（A）人工脂質(zhì)體的制備在含有重組DNA分子的水溶液中+磷（B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合

將脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞混合，在PEG、或者在其它促融劑的作用下，經(jīng)過一定條件就會產(chǎn)生融合作用，最終將重組DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞之中。（B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合將脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞混合，（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用

對于一些微生物如放線菌細(xì)胞，由于無法形成感受態(tài)，也就不能通過轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)入外源性DNA。但是，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，就能實現(xiàn)脂質(zhì)體與放線菌細(xì)胞之間的融合，來獲得基因工程放線菌。（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用對于一些微生物如放線菌細(xì)胞，由于無脂質(zhì)體2000:Invitrogen

,規(guī)格0.75ml/1.5ml

報價1700元/2900元

脂質(zhì)體2000:Invitrogen

,規(guī)格0.75m4、顯微鏡注射技術(shù)

在特定的顯微鏡下，用特制的玻璃微管，將重組的DNA直接注射到宿主細(xì)胞內(nèi)的方法。顯微鏡注射技術(shù)是一種直接、簡單、而又準(zhǔn)確、可靠的DNA機(jī)械轉(zhuǎn)移技術(shù)。主要用于真核生物4、顯微鏡注射技術(shù)在特定的顯微鏡下，用特制的玻璃微管，將

是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù)，它把DNA包被在金或鎢的微粒中，然后由基因槍將此包被顆粒轉(zhuǎn)移到原位組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中，是目前國際上最先進(jìn)的基因?qū)爰夹g(shù)。

基因槍適用于動植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、細(xì)菌及小型動物的轉(zhuǎn)基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點。5、基因槍注射技術(shù)是一種全新的基因?qū)爰夹g(shù)，它把DNA包被在金或鎢的微粒中基因槍注射技術(shù)基因槍注射技術(shù)利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡單、效率較高，幾乎所有細(xì)胞都可用此技術(shù)，此方法轉(zhuǎn)染的DNA不僅是線性的，還可是環(huán)狀的。

條件：電壓：300～600V

維持時間：20～100ms

溫度：0℃

6、電穿孔技術(shù)利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中7、磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

此法受二價金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。但轉(zhuǎn)移效率較低，僅有1%~5%的外源DNA可進(jìn)入受體細(xì)胞核中，約有1%DNA可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。7、磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)此法受二價金屬8、病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒在包裝細(xì)胞內(nèi)可形成完整的病毒顆粒，并被釋放到培養(yǎng)基中，感染哺乳動物細(xì)胞，能有效實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。8、病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法帶有外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒或DNA病毒（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體2、真核基因?qū)氪竽c桿菌的具體方式3、影響真核基因?qū)氪竽c桿菌的因素（三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá)1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體（1）pBV220（2）pET1、真核基因?qū)氪竽c桿菌所用的載體（1）pBV220pBV220

侯云德

分子病毒學(xué)家中國工程院院士1.分離了我國副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型2.研制出包括α1b、α2a、α2b、γ等亞型的基因工程干擾素系列產(chǎn)品3.成功組建原核高效表達(dá)載體pBV220系列及pBV320系列通用型高效表達(dá)載體

pBV220侯云德

分子病毒學(xué)家中國工程院院士（1）pBV220

已經(jīng)成功用于表達(dá)IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多種細(xì)胞因子。

[A]、結(jié)構(gòu)

[B]、優(yōu)點（1）pBV220已經(jīng)成功用于表達(dá)IL-2、IL-3、I[A]、結(jié)構(gòu)

pBV220共3665bp。共由6個部份組成：（1）pUC8的MCS（2）核糖體rrnB終止信號（3）pBR322的第4252-3735位（4）pUC-18的第2066-680位（5）λ噬菌體cIts抑制基因+PR啟動子（6）pRC-23的PL啟動子+SD序列。[A]、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個部份組成：質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框

ori-------復(fù)制起始點

clts857-------抑制子基因，在31℃時，其基因產(chǎn)物具有阻抑PL活性，當(dāng)溫度升高時，這種阻抑活性就喪失，PL開始指導(dǎo)合成mRNA。

PR----啟動子1

PL-----啟動子2

BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、HindIII、PstI---限制酶切位點形成多克隆區(qū)域，在此插入外源性目的基因。

RrnB----核糖體終止基因（終止子）

PvuI-----青霉素抗性基因Ampr。質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框ori-------復(fù)[B]、優(yōu)點（1）可轉(zhuǎn)化任何菌株（2）能防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象（3）質(zhì)粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量（4）能插入大片段的外源基因[B]、優(yōu)點（1）可轉(zhuǎn)化任何菌株（2）pET

pET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌體。[A]、克隆宿主可用大腸桿菌K12的HB101、JM103等細(xì)胞。pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會造成宿主的細(xì)胞損傷。[B]、表達(dá)受宿主細(xì)胞的T7RNA聚合酶控制。表達(dá)宿主為BL21、λDE30。表達(dá)菌在LB培養(yǎng)基、或在M9培養(yǎng)基中生長良好。[C]、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。（2）pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌MCSpET32a(+)以T7lac作為啟動子；pET32a(+)還帶有T7.Tag和His-Tag融合標(biāo)簽，此類標(biāo)簽可用于檢測和純化相關(guān)目的蛋白；pET32a(+)上與目的基因共表達(dá)的硫氧還蛋白可以促進(jìn)二硫鍵形成，增加目的蛋白可溶性，便于分離純化。MCSpET32a(+)以T7lac作為啟動子；2、真核基因?qū)氪竽c桿菌具體方式共有3種方式（1）融合蛋白（2）非融合蛋白（3）分泌型表達(dá)蛋白2、真核基因?qū)氪竽c桿菌具體方式共有3種方式（1）融合蛋白[A]、定義[B]、優(yōu)缺點[C]、改進(jìn)措施[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式（1）融合蛋白[A]、定義第二章基因工程制藥新版4課件[A]、定義

是指產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同時含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白。融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而羧基端則由真核基因編碼。最終表達(dá)出來的蛋白質(zhì)=1條原核多肽+1條真核多肽，稱為融合蛋白。

[A]、定義是指產(chǎn)生的蛋白質(zhì)同時含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點：

（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被細(xì)菌的酶類所降解，

（2）容易實現(xiàn)高效表達(dá)，

（3）基因操作簡便。缺點：

由于蛋白質(zhì)中含有細(xì)菌蛋白，會影響真核蛋白的免疫原性，只能用作抗原,不能作為人體注射用藥。[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點：

（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不易被[C]、改進(jìn)措施（1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Ile-Glu-Gly-Arg，可被人體內(nèi)的凝血因子Xa識別而切開。在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子X、膠原酶、腸激肽酶）對融合蛋白進(jìn)行降解。（2）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Met，CNBr可專一性識別Met并切開，形成原核多肽+真核蛋白質(zhì)分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。[C]、改進(jìn)措施（1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入Ile-Gl[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式

融合基因----融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—原核結(jié)構(gòu)基因片段—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建（D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)）（D3）融合蛋白的切除方法[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式融合基因----融合蛋白

關(guān)鍵：融合蛋白與外源蛋白的閱讀框要對齊兩個蛋白的結(jié)合位點的設(shè)計很重要，應(yīng)便于下一步切除融合蛋白的操作。（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建關(guān)鍵：（D1）融合表達(dá)載體的構(gòu)建（D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)）（D2）常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)）（D3）受體蛋白的切除方法化學(xué)斷裂法：溴化氰（CNBr）--Met-（切點）-AA酶促斷裂法：凝血因子Xa，有蛋白酶活性，識別序列:Ile－Glu－Gly－Arg-（切點）-AA（D3）受體蛋白的切除方法化學(xué)斷裂法：溴化氰（CNBr）--（2）非融合蛋白[A]、定義[B]、優(yōu)缺點[C]、具體表達(dá)方式（2）非融合蛋白[A]、定義[A]、定義

非融合蛋白表達(dá)方式是指工程菌大腸桿菌進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯時，是以真核生物的mRNA的AUG為翻譯起始點，最后表達(dá)出的蛋白質(zhì)中不含細(xì)菌蛋白。非融合蛋白表達(dá)方式也稱為包涵體型外源蛋白的表達(dá)。[A]、定義非融合蛋白表達(dá)方式是指工程菌大腸桿菌進(jìn)行蛋白[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點----非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)的生物活性。缺點：

（1）容易被細(xì)菌體內(nèi)的蛋白酶所破壞，

（2）非融合蛋白的氨基端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時常常引起人體的免疫反應(yīng)。[B]、優(yōu)缺點優(yōu)點----非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)[C]、非融合蛋白的具體表達(dá)方式非融合蛋白表達(dá)方式可分為2種：

（C1）非融合基因—非融合蛋白（C2）融合基因—非融合蛋白[C]、非融合蛋白的具體表達(dá)方式非融合蛋白表達(dá)方式可分為2種（C1）非融合基因—非融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—ATG—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”

要求1：SD序列和ATG之間的距離要合適，相差2-3個堿基，其表達(dá)效率就大受影響。

要求2：

ATG和真核結(jié)構(gòu)基因序列之間必須加接人工接頭，以保證ATG之后的真核基因不發(fā)生通讀框架的改變。（C1）非融合基因—非融合蛋白基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子（C2）融合基因—非融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原核SD序列—原核ATG—TGATG（真核基因起始結(jié)構(gòu)）—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”

這一方式能夠提高表達(dá)效率。（C2）融合基因—非融合蛋白基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子—原（3）分泌型表達(dá)蛋白[A]、定義[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示[C]、常用的大腸桿菌信號肽[D]、優(yōu)缺點（3）分泌型表達(dá)蛋白[A]、定義[A]、定義

分泌型表達(dá)蛋白