環(huán)境污染的生物學效應檢測

關于環(huán)境污染的生物學效應檢測第一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第一節(jié)污染物的生物效應檢測生物測試及方式一般毒性試驗生物的分子和細胞水平檢測生物致突變、致畸和致癌效應檢測微宇宙法第二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.生物測試（Bioassay）：指系統(tǒng)地利用生物的反應測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時所導致的影響或危害。注釋1：所利用的生物反應包括分子、細胞、組織、器官、個體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各級水平上的反應。例：通過水污染的生物測試可知，污染物對受測生物的毒性；各種水生生物對污染物的相對敏感性；廢水所應處理的程度；允許的污染物排放指標等。第三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.生物測試的方式時間長短短期中期長期給予方式靜止式流動式水污染大氣污染重復循環(huán)式更新式室內動態(tài)熏氣開頂室熏氣田間全開放式熏氣第四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日田間全開放式熏氣系統(tǒng)，即把極低濃度的污染氣體用密布于田間的管道通到植物周圍。第五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.1短期生物測試（ShortTermBioassays）主要用于測定LC50、IC50、EC50，用來快速估計污染物的毒性，評定幾種不同毒物或廢物對某種生物的相對毒性或評定不同生物對不同條件如溫度、pH的相對敏感性等。多數(shù)采用靜止式。LC50lethalconcentration半致死濃度IC50Inhibitoryconcentration

半抑制濃度EC50effectconcentration半效應濃度根據(jù)測試生物，其測試時間也不同（一般不超過8d）。藻類﹤72h；水藻類﹤48h；魚類﹤96h第六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.2中期生物測試（IntermediateTermBioassays）時間為8d到90d，多數(shù)情況下為流動式。2.3長期生物測試（LongTermBioassays）

包括全部生活史的生物測試（CompleteLife－cycleBioassays）和部分生活史的生物測試（PartialLife－cycleBioassays）目的是要測定出在持續(xù)情況下不造成有害效應的毒物最大濃度或最大允許毒物濃度（MATC）只能采用流動式，要保證試驗的環(huán)境條件和自然界的季節(jié)變化相符合。第七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.4受試生物的選擇A對試驗毒物或因子要有敏感性B具有廣泛的地理分布和足夠的數(shù)量，并在全年的某一實際區(qū)域范圍內可獲得。C受試生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有重要的生態(tài)學價值。D在實驗室易于培養(yǎng)和繁殖F具有豐富的生物學背景資料，人們較清楚的了解受試生物的生活史、生長、發(fā)育、生殖代謝等。G對毒物或因子的反應能夠被測定，并具有一套標準的測定方法或技術。H具有重要的經(jīng)濟價值和旅游價值，應考慮與人類食物鏈的重要關系第八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.5影響生物測試結果的因素受試生物：年齡、生活階段、尺寸大小、季節(jié)、脫皮階段、食物等試驗條件：溫度、水質的溫度和鹽分、水流速度、溶解氧、pH等。實驗室差異：人員操作水平、儀器設備、統(tǒng)計分析方法等。第九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.生物測試的標準化由于生物測試結果受眾多因素影響，固，必須把測試方法標準化。在標準化的生物測試中，對一些重要的影響因子做了規(guī)定，例如：光周期、生物大小、生物量、溶解氧、pH值等。例子：水質物質對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法（GB／T13267—91）試驗魚種應是斑馬擔尼魚(真骨魚總目，鯉科）。試驗魚體長30±5mm，體重0.3±0.1g。新配制的標準稀釋水pH為7.8±0.2，硬度為250mg／L左右(以CaCO3計)，用蒸餾水或去離子水由下面4種溶液制備……第十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日生物測試標準化的優(yōu)點：實驗準確度高、結果可重復、方便實驗的進行和數(shù)據(jù)的比較、可為環(huán)境管理何環(huán)境立法等提供靠的數(shù)據(jù)或者結果。生物測試標準化的缺點：一般只能解答普遍關注的問題。對于而非常見的污染物、易分解污染物和混合污染物，標準化方法很難進行。第十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第一節(jié)污染物的生物效應檢測生物測試及方式一般毒性試驗生物的分子和細胞水平檢測生物致突變、致畸和致癌效應檢測微宇宙法第十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.基本概念1.1毒物（Toxicant）在一定條件下，以較小劑量給予機體時，能與生物相互作用，引起生物體功能或者器質性損傷的化學物質；或者劑量雖微，但累計到一定的量，就能煩擾或者破壞機體的正常生理功能，引起暫時或者持久性的病理變化，甚至威脅生命的化合物。注釋：毒物與非毒物之間不存在絕對的界限，通常一種物質只有達到中毒劑量時才是毒物。例：下頁表人體內幾種元素含量標準第十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日元素人體含量（g）所占體重%元素人體含量（g）所占體重的%錳Mn0.0203.0×10-5金Au<0.001<1.4×10-6鋇Ba0.0162.3×10-5銀Ag<0.0011.4×10-6鋁Al0.1001.4×10-4鉻Cr<0.006<8.6×10-5鉛Pb0.0801.1×10-4鉬Mo<0.005<7.0×10-6鎘Cd0.0304.3×10-5鈷Co<0.003<4.3×10-6砷As<0.100<4.3×10－4鈹Be<0.002<3.0×10-6第十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.2中毒（Intoxication）生物體受到毒物作用引起的功能或者器質性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)。中毒是各種毒性作用的綜合表現(xiàn)，包括急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒。水俁病骨痛病第十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.3毒性（Toxicity）有毒物質接觸或進入機體后，引起生物體易感部位產(chǎn)生有害作用的能力。毒性作用或毒效應（ToxicEffect）：化學物引起生物體損害的總稱。如，苯可抑制造血功能導致貧血。無損害作用（Non-adverseEffect）：不引起機體形態(tài)、生長發(fā)育和壽命的改變，不引起機體功能容量的降低和對額外應激狀態(tài)代償能力的損害，所引起的生物化學變化一般是可逆的。如，利福平口服吸收良好，服藥后1.5～4小時血藥濃度達峰值。成人一次口服600mg后血藥峰濃度為7～9mg/L，血藥峰濃度為11mg/L。該藥的血消除半衰期為3～5小時，多次給藥后有所縮短，為2～3小時。第十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日損害作用（AdverseEffect）：生物體接觸外化學物期間或者停止接觸后，機體維持體內穩(wěn)態(tài)能力下降時不可逆的。如，鼻咽癌患者放療后，5%～10%的患者出現(xiàn)張口困難，影響進食和講話。8%的病人有明顯的聽力受損，3%的病人表現(xiàn)為雙側耳聾，放療數(shù)年后，部分病人可出現(xiàn)頸部肌肉、皮膚纖維化，血管脆弱，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等。危害性：有毒物質和機體接觸和使用過程中，有引起中毒的可能性。如，揮發(fā)性小且易溶于水或者血液的，危害性就大。危險性：某種化學物質在正常使用的條件下，引起機體發(fā)生中毒的可能性。如，“氯丹”是最危險性、持久性的污染物之一。第十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日效應（Effect）：接觸一定劑量的化學物質引起機體個體發(fā)生生物學變化。效應是對個體而言的，這種改變可用一定的計量單位表示。如，有機磷農(nóng)藥引起乙酰膽堿酯酶活力的降低（活力單位）。劑量-效應關系（Dose-effectRelationship）：不同劑量在個體或者群體中表現(xiàn)出來的量大小之間的關系。反應（Response）：接觸一定劑量的化學物質后，表現(xiàn)一定程度的某種效應的個體在一個群體中所占的比例。反應是對群體而言的，用百分率或比值來表示，如發(fā)病率、死亡率等。劑量-反應關系（Dose-responseRelationship):不同劑量與質效應發(fā)生率之間的關系，是評價化學物質毒性與確定安全接觸水平的基本依據(jù)。第十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日劑量10050反應強度（％）圖1劑量－反應曲線（直線型）劑量10050死亡率（％）圖2劑量－反應曲線（拋物線型）對數(shù)劑量10050死亡率（％）圖3劑量－反應曲線（S形線型）死亡率（概率單位）對數(shù)劑量10050圖4劑量－反應曲線第十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.4毒性試驗常用參數(shù)致死劑量或致死濃度（LethalDose，LethalConcentration）：一次染毒后引起受試動物死亡的劑量或者濃度。絕對致死劑量或致死濃度（LD100、LC100）：引起一群動物全部死亡的最低劑量或者濃度。半數(shù)致死劑量或濃度（LD50、LC50）：引起一群動物50%死亡的最低劑量或者濃度。最小致死劑量或濃度（MLD、MLC）：引起一群動物中僅有個別死亡的最低劑量或者濃度。最大耐受劑量或濃度（LD0、LC0）：使一群動物中雖然發(fā)生嚴重中毒，但全部存活無一死亡的最高劑量或者濃度。第二十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日最大無作用劑量（MaximumNo－effectLevel）：是指在一定時間內，一種外源化學物按一定方式或途徑與機體接觸，根據(jù)目前認識水平，用最靈敏的實驗方法和觀察指標，未能觀察到任何對機體的損害作用的最高劑量，也稱為未觀察到損害作用的劑量。最小有作用劑量（MinimaleffectLevel）：即在一定時間內，一種外來化合物按一定方式或途徑與機體接觸，能使某項觀察指標開始出現(xiàn)異常變化或使機體開始出現(xiàn)損害作用所需的最低劑量，也可稱為中毒閾劑量，或中毒閾值。第二十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日理論上講，最大無作用劑量與最小有作用劑量應該相差極微，但實際中由于受到對損害作用觀察指標和檢測方法靈敏度的限制，兩者之間存在有一定的劑量差距。最大無作用劑量是根據(jù)亞慢性試驗的結果確定的，是評定毒物對機體損害作用的主要依據(jù)。當外來化合物與機體接觸的時間、方式或途徑和觀察指標發(fā)生改變時，最大無作用劑量和最小有作用劑量也將隨之改變。所以表示一種外來化合物的最大無作用劑量和最小有作用劑量時，必須說明試驗動物的物種品系、接觸方式或途徑、接觸持續(xù)時間和觀察指標。例如某種有機磷化合物在大鼠（wistar品系）經(jīng)給口服予3個月，全血膽堿酯酶活力降低50%的最大無作用劑量為10mg/kg體重。

第二十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日每日容許攝入量（AcceptableDailyIntake）：是以體重表達的每日容許攝入量，以此量終生攝入無可測量的健康危險性（mg·kg,以60kg計）。最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration）：環(huán)境中有害物質以此濃度經(jīng)生態(tài)系統(tǒng)直接或間接作用于人，不會引起任何損害的濃度。對車間空氣、地面水、飲用水、食品及土壤中有害物質一般只制訂最高容許濃度。對大氣中有害物質則制訂了兩種最高容許濃度，即一次最高容許濃度（指任何一次測定結果的最大容許值）和日平均最高容許濃度（指任何一日的平均濃度的最大容許值），前者為防止急性有害作用的瞬間接觸容許濃度，后者則為防止慢性毒作用的容許濃度。第二十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日毒作用帶（ToxicEffectZone）：表示化學毒物毒性和毒作用特點的重要參數(shù)。急性毒作用帶（Acute－toxicEffectZone）：半數(shù)致死劑量與急性閾劑量（急性毒性最小有作用劑量）的比值（大于1）。急性毒作用帶值小，引起死亡的危險性大。慢性毒作用帶（Chronic－toxicEffectZone）：急性閾劑量與慢性閾劑量（慢性毒性最小有作用劑量）的比值（大于1）。慢性毒作用帶值大，發(fā)生慢性中毒的危險性大。第二十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日半數(shù)效應濃度（EC50）：引起受試對象50%個體產(chǎn)生一種特定效應的藥物劑量。通常指非死亡效應。半數(shù)抑制濃度（IC50）：能引起受試生物某種效應被抑制50%所需的濃度。如果將Inhibition看成是Effect，兩者其實是一回事。如果此效應是治療效應，應該是EC50值越小越好。

如果此效應是抑制生長的效應，那就是IC50了，那是越小越好。

第二十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.毒物單位與分級毒物單位空氣濃度：mg/m3，mg/L

哺乳動物：mg/kg，ml/kg

水環(huán)境：mg/L，ｕg/L毒物分級：P102-P1036個表

第二十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）研究化學物質大劑量一次染毒或24小時內多次染毒動物所引起的毒性的試驗。其目的是短期內了解該物質的毒性大小和特點，并為進一步開展其他毒性試驗提供設計依據(jù)。急性毒性試驗類型哺乳動物急性毒性試驗水生生物急性毒性試驗（魚類、水蚤類、藻類）蚯蚓急性毒性試驗第二十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日動物急性毒性試驗方法如下：按試驗要求選擇受試生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄動物同時試驗，對試驗動物預先觀察幾天后標記編號并隨機分組。預備試驗和確定劑量組選用少量動物進行預備試驗，找出引起動物90％（或全部）死亡的劑量（即最高劑量組劑量）和引起動物10％死亡（或不死亡）的劑量（即最低劑量組劑量）。在最高劑量組劑量和最低劑量組劑量的范圍內，按等比級數(shù)插入若干個中間劑量（一般4～6組），從而確定正式試驗的劑量組。第二十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日染毒方式和受試物的配制一般用灌胃法和人工熏氣法。受試物的配制：配制試驗所需的最高劑量濃度溶液，然后依次稀釋到所需濃度。觀察指標中毒癥狀：一般觀察24～48小時，最好觀察到絕大多數(shù)動物出現(xiàn)典型中毒癥狀。動物死亡數(shù)目和死亡時間病理檢查：對于試驗時立即死亡的動物，可解剖，分析死亡原因，看是技術事故還是中毒引起的死亡。第二十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日確定半數(shù)致死量（LD50）試驗結果LD50值越小，毒性越大。急性毒性試驗結果只能粗略地表示某化學物質的毒性，而不能全面反映其毒性。為了得到更接近實際情況的毒作用資料，通常還需要進行亞慢性、慢性毒物和蓄積毒性試驗。由于動物種屬、性別、染毒方式的不同，所表現(xiàn)的毒性也不一致，故表示LD50應注釋明動物種類和染毒方式。第三十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.亞慢性毒性試驗亞慢性毒性是指實驗動物連續(xù)多日接觸較大劑量（＜急性LD50）的外來化合物所出現(xiàn)的中毒效應。亞慢性毒性試驗最敏感的指標是最大無作用劑量（以mg/kg體重計）：小于或等于人的可能攝入量的100倍者，表示毒性較強，應予以放棄；大于100倍而小于300倍者，可進行慢性毒性試驗；大于300倍者，則不必進行慢性試驗，可進行評價。第三十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日亞慢性試驗期限環(huán)境毒理學與食品毒理學中所要求的連續(xù)接觸為3～6個月，而在工業(yè)毒理學中認為1～3月即可?，F(xiàn)有學者主張進行實驗動物90天喂飼試驗為亞慢性毒性試驗，即將受試物混合物飼料或飲水中，動物自然攝取連續(xù)90天。這是由于有研究報道認為動物連續(xù)接觸外來化合物3個月，其毒性效應往往與再延長接觸時間所表現(xiàn)的毒性效應基本相同，故不必再延長接觸期限。相應地主張呼吸道接觸可進行30天或90天試驗，每天6小時，每周5天。經(jīng)皮膚試驗進行30天。第三十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日實驗動物的選擇亞慢性毒性作用研究一般要求選拔兩種實驗動物，一種為嚙（niè）齒類，另一種為非嚙齒類，如大鼠和狗，以便全面了解受試物的毒性特征。受試動物的體重(年齡)應較小，如小鼠應為15g左右，大鼠100g左右。染毒途徑亞慢性毒性試驗接觸外來化合物途徑的選擇，應考慮兩點：一是盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式，二是應與預期進行慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。具體接觸途徑主要有經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種。第三十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日劑量選擇與劑量分組劑量一般設在LD50的1/80~1/50。亞慢性試驗的上限劑量，需控制在實驗動物接觸受試化合物的整個過程中，不發(fā)生死亡或僅有個別動物死亡，但有明顯的中毒效應，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷?？蓞⒖即嘶衔風D50的1/20~1/5為最高劑量。亞慢性試驗至少應設計三個染毒劑量組及一個正常動物對照組。組內動物個體體重相差應不超過平均體重的10%，組間平均體重相差不超過5%。小動物每組不應少于20只，大動物不少于6~8只。第三十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日觀察指標一般綜合性觀察指標:體重變化、食物利用率、中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間均、臟器系數(shù)或稱臟/體比值等。一般化驗指標主要指血象和肝、腎功能等檢測。病理學檢查：凡是在染毒過程中死亡的動物均應及時解剖，肉眼檢查后再進行病理組織學檢查。必要時作組織化學或電鏡鏡檢。試驗評價可對受試物的主要作用、靶器官、最大無作用水平和中毒閾值做出初步估計，為進一步開展慢性毒性試驗提供依據(jù)。第三十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日5.慢性毒性試驗慢性毒性是指以低劑量外來化合物長期給予實驗動物接觸，觀察其對實驗動物所產(chǎn)生的毒性效應。

試驗目的

慢性毒性試驗是確定外來化合物的毒性下限，即長期接觸該化合物可以引起機體危害的閾劑量和無作用劑量。為進行該化合物的危險性評價與制定人接觸該化合物的安全限量標準提供毒理學依據(jù)，如最高容許濃度和每日容許攝入量等。

第三十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日試驗期限

工業(yè)毒理學慢性試驗動物染毒6個月或更長時間；環(huán)境毒理學與食品毒理學則要求實驗動物染毒1年以上或2年。也有學者主張動物終生接觸外來化合物才能全面反映外來化合物的慢性毒性效應，以及求出閾劑量或無作用劑量。

接觸途徑

慢性毒性試驗多為經(jīng)口與經(jīng)呼吸道接觸。經(jīng)呼吸道接觸，每日接觸時間，依試驗要求而定。工業(yè)毒物的試驗通常每日吸入4～6小時。環(huán)境污染物一般要求每日吸入8小時或更長。

第三十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日劑量的選擇與分組

受試動物要求年齡低于亞慢性試驗。設置3~4劑量組和1對照組，其他要求同亞慢性試驗。

染毒組劑量的選擇可參考以下兩種數(shù)據(jù)：

A.以亞慢性閾劑量或其1/5~1/2劑量為慢性毒性試驗的最高劑量，以這一閾劑量的1/50~1/10為慢性毒性試驗的預計閾劑量組，并以其1/100為預計的慢性無作用劑量組。

B.以LD50的1/10劑量為慢性試驗的最高劑量。以LD50的1/100為預計慢性閾劑量，以LD50

的1/1000為預計的無作用劑量組。組間劑量差一般以5~10倍為宜，最低不小于兩倍。第三十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日

觀察指標

觀察指標同亞慢性毒性試驗。應重視病理組織學的檢查，凡試驗期間死亡的動物，都應做病理組織學檢查。

試驗評價對受試物在低劑量長時間接觸機體時所引起的毒性作用有更深入的了解。根據(jù)敏感觀察指標找出最小閾劑量和最大無作用劑量。第三十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日6.蓄積毒性試驗蓄積毒性作用（CumulativeToxicityAction）：低于中毒域劑量的外來化合物，反復多次與機體持續(xù)接觸，經(jīng)過一定時間后使機體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)。產(chǎn)生原因：V進入﹥V消除物質蓄積：吸收量﹥排出量，量逐漸積累增多。功能蓄積：污染物反復作用機體，引起機體一定結構和功能的變化，并逐漸累積加重，最后導致?lián)p害出現(xiàn)。第四十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日A.蓄積系數(shù)法（CumulativeCoefficientMethod）：分次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)某種毒效應的總劑量，與一次給受試物后引起50%受試動物出現(xiàn)該種毒效應的比值。蓄積系數(shù)K＝K值愈小，蓄積作用愈強。分級：<1高度；1～明顯；3～中等；5～輕度蓄積。試驗方法第四十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日①固定計量每天染毒法受試動物以1/10~1/20LD50的固定劑量，每天染毒一次，觀察動物死亡的情況。當然度劑量累計達到5個LD50以上時，表明K大于5，該污染物蓄積作用不明顯。如果在染毒過程中動物相繼陸續(xù)死亡，記下受試動物出現(xiàn)50%死亡時累計的的染毒總劑量，計算K值。第四十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日②劑量遞增蓄積系數(shù)法以4天為一期，第一期每只動物每天給藥劑量為0.1×LD50，以后各期順次遞增50%（第二期為每只每天0.15×LD50

，第三期為每只每天0.225×LD50,依次類推……），直至該動物死亡一半，或繼續(xù)給藥至累計劑量5.0×LD50以上（20d）為止。計算蓄積系數(shù)K。第四十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日B.20天蓄積試驗法成年大鼠隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。各組劑量分別為LD50的1/20、1/10、1/5、1/2，另設溶劑對照組。每天灌胃一次，連續(xù)20天。然后觀察7天。結果評價：如1/2LD50組已出現(xiàn)死亡，且各劑量組動物死亡呈劑量-反應關系，則受試動物有強蓄積毒性。如1/20LD50組有死亡，但各劑量組死亡呈劑量-反應關系，表明有中等蓄積毒性。如1/20LD50組無死亡，各劑量組死亡也劑量-反應關系，可認為無明顯蓄積毒性。第四十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日C.受試生物半減期測定法生物半減期（T1/2）指一種外來化合物在體內消除到原有濃度或劑量的一半，所需要的時間。T1/2越長，蓄積作用可能性越大。T1/2直接測定很難，通常間接測定其在血液、尿液或器官組織中原有濃度降低一半所需要的時間。生物半減期T1/2＝y(tǒng)1和y2分別為給受試物后t1和t2時間測得該物質的濃度或者量。第四十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第一節(jié)污染物的生物效應檢測生物測試及方式一般毒性試驗生物的分子和細胞水平檢測生物致突變、致畸和致癌效應檢測微宇宙法第四十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.加合物的測定A.DNA－加合物的測定

DNA分子與化學誘變劑間反應形成的一種共價結合的產(chǎn)物。這種結合激活了DNA的修復過程。如果這種修復不是發(fā)生在DNA復制前，會導致核苷酸的替代、缺失和染色體的重排。

第四十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日DNA構成分子的活性位點第四十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日a.放射免疫法（RIA）用放射性同位素標記抗原，制備特異性抗體。原理：

*Ag+Ag+Ab→*Ag—Ab十Ag—Ab+*Ag(剩余)+Ag(剩余)抗體數(shù)量已知，*Ag—Ab和*Ag(剩余)可被檢測到，則可計算出樣品中的Ag數(shù)量。第四十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日b.酶聯(lián)免疫法（ELISA）（1）將特異性抗體（制備某種DNA-加合物的特異抗體）（2）加受檢標本（3）加檢測抗體（4）加酶標抗體（5）加底物，顯色第五十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日c.熒光法某些化合物的DNA-加合物具有熒光特性，故而可被檢測到。熒光法不破壞DNA鏈，并可區(qū)分加合物的不同立體異構體及DNA鏈上的不同位點上的加合物。第五十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日d.32P-后標記法(1)采用DNA水解酶將DNA降解為3′-磷酸單核苷酸;(2)采用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP對單核苷酸的5′端進行放射性標記,形成可放射顯影的5′-32PNp3′(正常單核酸)或5′-32PXNp3′(含加合物的單核酸)(3)采用多維薄層色譜或者高效液相色譜將正常和含加合物的單核苷酸進行分離;(4)對分離的核苷酸加合物通過放射自顯影制成指紋圖,液閃計數(shù)測定加合物的含量。第五十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日B.蛋白加合物的測定最常見的為Hb（血紅蛋白）—加合物。因為Hb-加合物的生存期為120d左右，因而它可作為中長期暴漏的指標。最常用的方法為（GC-MS法）和免疫法檢測。（原理同DNA－加合物的測定法）第五十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.一般代謝酶的活性測定A乙酰膽堿酯酶埃爾曼比色法異羥扝酸鐵比色法乙酰膽堿硫醇同類物硫醇DNTP深黃色412nmAChE乙酰膽堿底物異羥扝酸鐵540nmAChE第五十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日同位素標記法乙酰-1-C14膽堿AChE乙酸-1-C14離子交換法除去計數(shù)器計數(shù)測量第五十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日B腺三磷酶（ATPase）鉬藍法測ATPase活性實驗原理：

在酸性條件下,無機磷可與鉬酸銨作用生成磷鉬酸銨,并被氯化亞錫還原成藍色的磷鉬藍，由藍色的深淺即可測定磷的含量。

ATP—ATPase—〉ADP+H3PO4

H3PO4+12(NH4)MoO4+21HCl——〉(NH4)3PO4·12MoO3（磷鉬酸銨）+21NH4Cl+12H2O

(NH4)3PO4·12MoO3+SnCl2.H2O——〉(MoO2·4MoO3)2·H3PO4·4H2O（磷鉬藍）+SnCl4磷鉬藍的最大吸收波長為660nm.

測ATPase活性時氯化亞錫可以用三氯乙酸+Vc替代第五十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.解毒系統(tǒng)酶類誘導作用的檢測A混合功能氧化酶（MFO）的誘導作用直接法：測細胞色素P-450的含量間接法：測底物消耗量和產(chǎn)物生成量B谷胱甘肽硫轉移酶（GST）活性測定還原型谷胱甘肽（GSH）1氯－2，4－二硝基苯（CDNB）GS-CDNBGST

340nm處被檢測第五十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日4.抗氧化防御系統(tǒng)檢測A過氧化氫酶（Ct）方法：測量釋放氧氣量；或者用色譜法（240nm）、電化學方法和容量法滴定剩余H2O2的含量。H2O2H2OO2Ct第五十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日B谷胱甘肽過氧化酶（GPx）：清除脂類過氧化物，在Ct很少的組織，可以替代Ct的作用直接法：提純GPx，GPx在255nm處呈最大吸收峰。此法靈敏度差。間接法：還原型谷胱甘肽（GSH）二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）GS-DTNBH2O2H2OGSSGGPx412nm處被檢測第五十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第一節(jié)污染物的生物效應檢測生物測試及方式一般毒性試驗生物的分子和細胞水平檢測生物致突變、致畸和致癌效應檢測微宇宙法第六十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.致突變試驗1.1基本概念突變（Mutation）:指細胞中的遺遺傳基因發(fā)生永久的、可遺傳的改變?；蛲蛔儯℅eneMutation）：只涉及染色體某一部分的改變，不能用光學顯微鏡直接觀察。染色體畸變（ChromosomeMutation）：涉及染色體數(shù)目或結構的改變，可用光學顯微鏡直接觀察。致突變作用（Mutagenesis）：某些物質引起生物體遺傳物質發(fā)生結構改變的作用。致突變物（Mutagen）：第六十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日突變的有利一面，產(chǎn)生新的物種。突變不利的一面，對健康存在威脅。致突變物作用于生殖細胞出現(xiàn)的結果：顯性致死突變遺傳性疾?。ㄉ?，隨著X染色體向后代傳遞的；蹼趾，隨著Y染色體向后代傳遞的）第六十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日1.2試驗方法致突變試驗的目的致突變試驗的目的是為了檢查受試物對機體是否有致突變作用。致突變試驗方法體外基因突變試驗，例如Ames試驗，哺乳動物體細胞株突變試驗。細胞遺傳學試驗，例如，染色體畸變試驗，微核試驗。體內基因突變試驗，例如，顯性致死突變試驗，果蠅伴性隱性致死試驗。DNA損傷試驗，例如，姐妹染色單體交換試驗，DNA修復合成試驗。第六十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日A.Ames試驗Ames試驗原理同一種微生物的營養(yǎng)缺陷型突變型菌株與受試物接觸，若此化學物質具有致突變性，可使突變型微生物再發(fā)生一次突變，重新成為野生型微生物。這種突變叫做回復突變。注釋1：營養(yǎng)缺陷型突變型菌株注釋2：野生型微生物第六十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗法原理：在動物體外將待測物經(jīng)肝微粒體酶系活化后，檢測其所誘發(fā)的沙門氏菌回變菌落數(shù)，即由不能自行合成組氨酸的營養(yǎng)缺陷型突變菌株（his－），回復為能自行合成組氨酸的（his＋）菌落數(shù)。突變率＝誘發(fā)回復突變菌落數(shù)/自發(fā)回復突變的菌落數(shù)（對照）當突變率大于2.0時，為陽性結果。第六十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日B微核試驗原理：微核是指存在于細胞中主核之外的一種顆粒，其染色與細胞核一致，大小相當于細胞直徑的l／20～l／5，呈圓形或杏仁狀，在間期細胞中可以出現(xiàn)一個或多個。一般認為微核是細胞內染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細胞有絲分裂后期滯留在細胞核外的遺傳物質(染色體斷片或遲滯的染色體)。所以，微核試驗能檢測化學毒物或物理因素誘導產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學終點，用于檢測斷裂劑及非整倍體誘發(fā)劑。第六十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日微核可以出現(xiàn)在多種細胞中，但在有核細胞中較難與正常核的分開及與核突出物相區(qū)別，故常計數(shù)多染紅細胞（PCE）中的微核，因為當原成紅細胞發(fā)展為紅細胞時，主核排出，成為PCE，這些細胞保持其嗜堿性約24小時，然后成為正染紅細胞（NCE），并進入外周血。在主核排出時，但微核仍保留于PCE細胞中。第六十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第六十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第六十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日動物選擇：首選物種是小鼠和大鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18～20g，7～12周齡。每組小鼠數(shù)量10只，雌雄各半。染毒途徑：根據(jù)研究目的或受試化學毒物性質的不同，可分別選用經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應盡可能采用與人體接觸化學毒物相同的途徑。染毒次數(shù)及取樣時間：不同化學毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時間也不盡相同。波動范圍可以達到24～72h。這就要求在接觸化學毒物后設立不同的采樣時間點。建議采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比較方便合理。即每天染毒一次，連續(xù)4d，第5天取樣。第七十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日劑量選擇：受試物的最大劑量除因溶解度所限外，應達最大耐受量，或參考毒物的LD50，以80％LD50為最高劑量。在一般情況下，應設4～5或更多試驗組，劑量水平跨3個以上數(shù)量級。另設陽性和陰性對照組。陽性對照組可用環(huán)磷酰胺(50～100mg/Kg)或絲裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射一次或二次。陰性對照組使用等體積的溶劑。第七十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日骨髓液的制備、涂片、固定、觀察計數(shù)。PCE呈灰（淡）藍色，NCE呈淡紅色。計數(shù)200個紅細胞中PCE數(shù)和PCE百分比正常的PCE/NCE比值約為l(正常范圍為0.6～1.2)。如比值＜0.1，則表示PCE形成受到嚴重抑制；如比值＜0.05，則表示受試化學毒物的劑量過大，試驗結果不可靠。第七十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日C.果蠅伴性隱性致死試驗原理：根據(jù)隱性基因在性遺傳中的交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅。又通過F1代傳給F2代雄蠅。位于X染色體上的隱性基因能在半合子雄蠅中表現(xiàn)出來。據(jù)此推斷致死突變的存在。

第七十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日CIB法果蠅有一個品系稱ＣlＢ系：Ｘ染色體上有一個大的倒位Ｃ；隱性致死突變ｌ；顯性棒眼基因Ｂ。由于ｌ基因而使雄果蠅不能存活，Ｂ基因可作為標記，凡帶有ＣlＢX染色體的雌果蠅可以從棒眼性狀上加以辯認，大的倒位Ｃ可以抑制ＣlＢX染色體與另一同源染色體交換。檢測的方法是讓受檢的雄果蠅與ＣlＢ雌果蠅雜交，所生子代應為２♀：１♂。在雌蠅中有半數(shù)帶ＣlＢ，可以從棒眼上加以辯認，在這些棒眼雌蠅中的兩條Ｘ染色體，一條是ＣlＢ，另一條是受檢雄蠅來的Ｘ染色。將這一棒眼雌性與正常雄性單對交配，觀察子二代的性狀。

第七十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第七十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日Muller-5法（P120）Muller-5品系，是人工創(chuàng)造的一個果蠅品系。它的X染色體上帶一個棒眼基因B，一個杏色眼w和一個倒位區(qū)段。倒位區(qū)段的存在可以抑制雜合體的交換重組。用經(jīng)誘變處理的雄蠅，與Muller-5品系雄蠅雜交，得到子一代后再做單對交配，看F2代的分離情況。如有致死突變，子二代中沒有野生型雄蠅，如有隱性的形態(tài)突變，則除Muller-5雄蠅外，還可出現(xiàn)具有突變性狀的雄蠅。第七十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第七十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第七十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日D.姐妹染色單體交換試驗姊妹染色單體交換（Sisterchromatialexchange,SCE）是染色體同源座位上復制產(chǎn)物間的相互交換，是同一染色體的兩條單體之間發(fā)生的一類特殊的同源重組，主要在DNA合成期形成，可能與DNA雙鏈的斷裂與復制有關，SCE的發(fā)生的頻率可反映細胞在S期的受損程度。如果一個個體的SCE率明顯增高，可表明染色體受到環(huán)境中的一定因素的影響，或是受到遺傳缺陷的內在制約因素所致。

第七十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日在細胞分裂時，每條染色體均有兩條染色單體組成，每條染色單體有一條雙鏈DNA組成。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy-uridine，BrdU）是脫氧胸腺嘧啶核苷的類似物，在DNA鏈的復制過程中，可替代胸腺嘧啶。當細胞生存環(huán)境中存在BrdU時，BrdU取代脫氧胸苷摻入到復制的DNA中。經(jīng)兩個復制周期后，兩條姊妹染色單體中一條DNA的雙鏈均有BrdU摻入，而另一條DNA雙鏈中僅有一條鏈有BrdU摻入。第八十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日利用特殊的分化染色技術對染色體標本進行處理，可使雙鏈均含有BrdU摻入的單體淺染，而只有一條鏈摻入BrdU的單體深染。當姊妹染色體間存在同源片段交換時，可根據(jù)每條單體夾雜著深淺不一的著色片段加以區(qū)分。由于姐妹染色單體的DNA序列相同，SCE并不改變遺傳物質組成，但SCE是由于染色體發(fā)生斷裂和重接而產(chǎn)生的，因此，SCE顯示方法通常用來檢測染色體斷裂頻率，用來研究藥物和環(huán)境因素的致畸效應。第八十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日第八十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日試驗步驟：1）按半微量法采取外周靜脈血，細胞培養(yǎng)24h后于培養(yǎng)液中加入Brdu和待測產(chǎn)物，最終濃度10μg/ml，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)。（2）待細胞經(jīng)歷兩個細胞周期（48h），培養(yǎng)終止前4h加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02μg/ml培養(yǎng)液；（3）常規(guī)制片，染色體制片在37℃恒溫箱內老化24h；（4）紫外燈照射：取標本玻片置于大號培養(yǎng)皿內，正面朝上，上覆蓋鏡頭紙，從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸濕，移入60℃水浴鍋內，紫外線燈距離5cm，照射30min；（5）染色：取出照射后標本，蒸餾水沖洗，置pH6.8的2%Giemsa染色10min。第八十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2致畸效應2.1概念畸形（Malformation）:由于受到某些因素的影響，使胚胎的細胞分化和器官形成不能正常進行，造成器官組織上的缺陷，并出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)結構異常者。畸胎（Terate）:畸形的胚胎。致畸作用（Teratogenesis）:通過母體作用于胚胎而引起胎兒畸形的現(xiàn)象。致畸物（Teratogen）:引起胚胎發(fā)育障礙而導致胎兒發(fā)生畸形的物質。第八十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.2致畸作用的毒理學特點胚胎與致畸物接觸時因胚胎處于不同的發(fā)育階段而呈現(xiàn)不同的敏感性。一般器官形成期比較敏感。種屬差異較為明顯。代謝不同、胎盤構造不同、遺傳機理不同。致畸作用的劑量-反應曲線較為陡峭最大無作用劑量與100%致畸劑量之間距離較小，一般相差1倍，曲線斜率也較大，亦即致畸帶較為狹小。第八十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日本圖所示安全范圍為95%的藥效劑量與5%毒效劑量第八十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.3化學致畸作用機理突變引起胚胎發(fā)育異常；甲醛、克菌丹。對細胞的生長分化較為重要的酶類受到抑制；核糖核苷酸還原酶、DNA聚合酶、二葉酸還原酶、碳酸酐酶。母體正常代謝過程被破壞，使子代細胞在生物合成過程中缺乏必需的物質，影響正常發(fā)育，出現(xiàn)生長遲緩或畸形。細胞分裂過程的障礙，致畸物可干擾細胞的分裂過程，引起生殖細胞減數(shù)分裂中的不分離或細胞有絲分裂過程的障礙。第八十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.4致畸試驗致畸試驗的目的檢測環(huán)境污染物能否通過妊娠母體引起胚胎畸形。受試動物：一般試驗動物要求其對化學物質的代謝過程與人相似，胎盤結構也相似，還要求孕期短，產(chǎn)仔多，經(jīng)濟實用，如家兔、大鼠、小鼠等。第八十八頁，共一百零九頁，2022年，8月28日步驟簡述：分組：常用大鼠或小鼠，性成熟的試驗動物進行交配，以雌鼠陰道發(fā)現(xiàn)陰栓或涂片發(fā)現(xiàn)精子為受孕0天，將孕鼠隨機分組。通常設3個劑量組和1個對照組，每組20只孕鼠。劑量設置：高劑量組應使母鼠產(chǎn)生明顯的毒性反應，但母體死亡率不應超過10%；低劑量組應無明顯的毒性反應。于胚胎發(fā)育的器官形成期（大鼠為受孕第6-15日，小鼠為受孕第5-14日）給以受試物。檢測：于自然分娩前1-2日，剖腹取出子宮內胎仔，記錄活胎、死胎及吸收數(shù)，檢查活胎仔的外觀、骨骼及內臟畸形。第八十九頁，共一百零九頁，2022年，8月28日結果評價：致畸指數(shù)=雌鼠LD50/最小致畸劑量致畸指數(shù)10以下為不致畸，10~100為致畸，100以上為強致畸。為表示有害物對人體危害的大小，可計算致畸危害指數(shù)，如指數(shù)大于300說明受試物對人危害小，100~300為中等，小于100為危害大。致畸危害系數(shù)=最大不能致畸劑量/最大可能攝入量。第九十頁，共一百零九頁，2022年，8月28日2.5致畸作用的評價注意與自然變異區(qū)分；注意種屬差異；注意試驗的閾劑量與人類實際可能攝入量之間的差別。（維生素A）第九十一頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3致癌效應癌，一種惡性腫瘤。發(fā)生于人與動物體組織，器官的細胞無限制增生，導致對附近正常組織的壓擠，侵犯和毀壞。增生的癌細胞可由血液和淋巴帶至身體其他部位進行增殖與破壞。據(jù)估計，人類腫瘤有80~90%與環(huán)境因素有關系，其中化學因素占80~85%。六個致癌習慣第九十二頁，共一百零九頁，2022年，8月28日A、衛(wèi)生紙：引發(fā)白血病衛(wèi)生紙?zhí)砑恿巳玖?，包括熒光增白劑或滑石粉，添加劑多含有化合物苯；有些質量欠佳的衛(wèi)生紙，還含有甲醛、大腸桿菌、肝炎病毒等。這些物質長期與皮膚接觸可能引發(fā)白血病和癌癥。B、清香劑：誘發(fā)白血病清香劑的香味也是化學合成物，也可能誘發(fā)癌變。多數(shù)家庭都使用消毒水等清潔用品，它們蒸發(fā)后，往往會積聚大量有害氣體。某些消毒水還含二氯苯，會刺激呼吸道，使細胞變異而誘發(fā)白血病、肺癌等。C、塑料紙簍廁所里放紙簍會大大增加細菌繁殖的速度，使衛(wèi)生間變成病毒繁殖場和傳染源。第九十三頁，共一百零九頁，2022年，8月28日D、洗發(fā)水洗發(fā)水一旦被長期打開儲存的話，其中的甲醛就會與洗發(fā)水中使用的乳化成分一起產(chǎn)生化學反應，形成一種叫做“N-亞硝基二乙醇胺”的致癌物質。E、泡泡浴泡泡浴中使用的泡沫劑，很香，但這香味劑可能會導致皮膚發(fā)炎、頭暈；長時間躺在浴缸中令身體接觸泡沫劑，其含有的有害化學成分“泡沫穩(wěn)定劑”會滲透到皮膚和呼吸到肺中。Ｆ、牙膏：牙膏過多使用或致口腔癌，牙齦疾病會誘發(fā)心臟病牙膏中廣泛使用的化學物質“月桂醇硫酸鈉”被認為可能會導致腸胃病和肝中毒；會令口腔更容易潰爛，患口腔癌。牙膏中的研磨劑也被認為會傷害牙齦，令牙齦更易受到侵害。第九十四頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.1概念化學致癌作用（ChemicalCarcinogenesis）：化學物質引起腫瘤的過程?；瘜W致癌物（ChemicalCarcinogen）：能誘發(fā)腫瘤的物質?；瘜W致癌物的特點：生物學上的持久性和遲發(fā)性；多次給予受試物比一次效應大；從機理上看，一般都和宿主細胞的遺傳物質或其他大分子的相互作用有關系。第九十五頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.2細胞癌變學說體細胞突變學說：致癌因素作用于體細胞的遺傳物質DNA，使其發(fā)生突變，使細胞的功能發(fā)生障礙而致癌。

分化障礙學說：細胞癌變不一定要體細胞遺傳物質發(fā)生突變，細胞分化過程中有關的基因調控過程受到致癌因素的干擾，使細胞分化和增殖發(fā)生紊亂而癌變。癌基因學說：所有細胞DNA分子中都存在著癌基因的遺傳信息，在正常狀態(tài)下，這種癌基因處于阻礙狀態(tài)，只有細胞內的有關調節(jié)因子遭到破壞的情況下，癌基因才能表達，從而導致細胞發(fā)生癌變，形成腫瘤。第九十六頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3.3癌變過程引發(fā)階段：體細胞突變，避免機體的正常修復和免疫監(jiān)視。促進階段：臨床上可被檢測出腫塊浸潤和轉移階段：侵害周圍的正常組織或者擴散到體內其他部位。第九十七頁，共一百零九頁，2022年，8月28日3