生物大分子課件：bio-coures-6

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾用化學(xué)修飾的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能已經(jīng)成為一種重要的基礎(chǔ)手段，蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的修飾是通過選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的，這是蛋白質(zhì)化學(xué)基礎(chǔ)研究的一個(gè)方向。廣義上，凡涉及共價(jià)或部分共價(jià)鍵的形成或破壞的轉(zhuǎn)變都可看作是蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，其內(nèi)容也應(yīng)當(dāng)包括質(zhì)子轉(zhuǎn)移、氫同位素交換、金屬螯合、酶－底物結(jié)合以及氫鍵合等。狹義上，特指選擇性化學(xué)修飾。即在較溫和的條件下，以可控制的方式使一種蛋白質(zhì)同某些化學(xué)試劑起特異反應(yīng)，以引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基發(fā)生共價(jià)的化學(xué)變化。優(yōu)點(diǎn)在于：單個(gè)修飾的實(shí)驗(yàn)條件遠(yuǎn)較多個(gè)修飾易于控制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也容易解釋。側(cè)鏈基團(tuán)化學(xué)修飾的一個(gè)非常重要的作用是用來探測活性部位的結(jié)構(gòu)。反應(yīng)試劑與蛋白質(zhì)分子接觸并發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈氨基酸殘基共價(jià)連接形成某些可探測的報(bào)告基團(tuán)。理想情況下，修飾試劑只是有選擇地與某一特定的殘基反應(yīng)，很少或幾乎不引起蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化。在此基礎(chǔ)上，從該基團(tuán)的修飾對蛋白質(zhì)分子的生物活性所造成的影響，就可以推測出被修飾的殘基在該蛋白質(zhì)分子中的功能。在20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見氨基酸中，只有具有極性的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)才能夠進(jìn)行化學(xué)修飾，這些基團(tuán)的反應(yīng)性取決于它們的親核性。很多因素都可以影響親核性的大小，這些因素對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾反應(yīng)會造成較大的影響?；瘜W(xué)修飾的主要作用(1)探測酶和蛋白質(zhì)的必需氨基酸殘基的性質(zhì)和數(shù)目。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾可以很快地揭示蛋白質(zhì)分子中哪些側(cè)鏈基團(tuán)是表現(xiàn)酶活性所必需的。這對于目前空間結(jié)構(gòu)尚未搞清楚的蛋白質(zhì)分子尤為重要。它可以幫助人們初步認(rèn)識該蛋白質(zhì)分子中哪些殘基能處于活性部位并為其表現(xiàn)功能所必需。這將為空間結(jié)構(gòu)的解析提供重要的信息。(2)用于蛋白質(zhì)純度分析與鑒定。(3)用于蛋白質(zhì)一級序列的測定。如在蛋白質(zhì)序列分析時(shí)，首先必須了解N-末端的殘基。多肽鏈N-末端殘基的分析常用的修飾試劑有二硝基氟苯、丹氟酰氯，即二甲基氨基萘磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯(PITC)。PITC也是測定蛋白質(zhì)序列的Edman降解法的關(guān)鍵試劑。此外，在氨基酸組成分析中的半胱氨酸殘基的測定、二硫鍵的斷裂、側(cè)鏈基團(tuán)的保護(hù)等均采用各種方法的化學(xué)修飾。(4)探測蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化和運(yùn)動(dòng)性。利用化學(xué)修飾試劑的反應(yīng)，探測某些基因的暴露程度，以分析蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化，如利用5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)測定不同去折疊狀態(tài)的反應(yīng)巰基數(shù)目，可以探測其去折疊的程度，還可以通過監(jiān)測A412隨時(shí)間的變化探測去折疊的動(dòng)力學(xué)。(5)利用親和標(biāo)記探測活性部位局部區(qū)域的構(gòu)象狀態(tài)。有些化學(xué)試劑可專一性地修飾酶的活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)，從而在活性部位引入探測基團(tuán)(如具有熒光性或順磁性基團(tuán))，以探明活性部位的構(gòu)象狀態(tài)及構(gòu)象變化。(6)探索蛋白質(zhì)和酶作用的化學(xué)機(jī)理。通過化學(xué)修飾可以探明哪些側(cè)鏈基團(tuán)參與了酶的催化作用，為探明其作用的化學(xué)機(jī)理和催化歷程起了重要的作用，也為藥物設(shè)計(jì)提供了分子基礎(chǔ)。(7)利用共價(jià)交聯(lián)技術(shù)研究蛋白質(zhì)分子的拓?fù)鋵W(xué)、構(gòu)象的運(yùn)動(dòng)性以及寡聚蛋白質(zhì)的亞基結(jié)合狀態(tài)。(8)利用蛋白質(zhì)晶體的重金屬衍生物(也屬于一種化學(xué)修飾)，進(jìn)行X衍射晶體結(jié)構(gòu)分析。(9)用于蛋白質(zhì)和酶分子的固定化。在蛋白質(zhì)和酶分子的固定化技術(shù)中，除部分用物理方法固定外，主要的還是采用化學(xué)方法的固定化。其本質(zhì)是蛋白質(zhì)和酶的化學(xué)修飾，其中包括載體偶聯(lián)法和共價(jià)交聯(lián)法。這類化學(xué)修飾希望只修飾非必需基團(tuán)，設(shè)法避免必需基團(tuán)的破壞，以保持蛋白質(zhì)和酶的活性。(10)定向改造蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，改變蛋白質(zhì)主鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)中刪去、替換或增加某些氨基酸殘基，以研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并可定向地進(jìn)行蛋白質(zhì)的改造。此外，還可以通過側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾，改造蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)，如使其激活、失活，或使其穩(wěn)定性提高等?？傊鞍踪|(zhì)化學(xué)修飾仍然作為一種有效的研究手段廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)性研究和應(yīng)用研究?；瘜W(xué)修飾中的問題化學(xué)修飾具有復(fù)雜性，其結(jié)果解釋不易對一定類型的功能基很少有絕對的特異修飾劑。換言之，被同一種試劑修飾的氨基酸殘基，會因其存在的狀態(tài)不同而出現(xiàn)反應(yīng)差異。能修飾同類氨基酸的試劑，其本身的反應(yīng)性也有不同，修飾的結(jié)果往往要受不同類型實(shí)驗(yàn)的影響。設(shè)計(jì)能對酶的催化部位、底物的結(jié)合部位起作用的修飾劑常常是非常困難的，有時(shí)是不可能的。在了解修飾劑與酶失活的關(guān)系上，除應(yīng)注意其活性部位殘基的直接修飾外，還必須考慮修飾過程中引起的酶蛋白位阻的間接影響，分析是否有同酶活性無關(guān)的殘基起非特異性反應(yīng)等等。但無論如何，應(yīng)該記住一個(gè)基團(tuán)的修飾反應(yīng)所需的特定反應(yīng)條件暗示了蛋白質(zhì)分子內(nèi)的特定的環(huán)境。關(guān)鍵問題設(shè)計(jì)和篩選出某些使單獨(dú)一類氨基酸殘基或功能基發(fā)生有效修飾的特異性試劑，即選擇性化學(xué)修飾劑（基團(tuán)選擇性試劑）選擇性修飾試劑首先必須要能夠與某一特定的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并形成緊密的共價(jià)連接。人們已經(jīng)找到許多不同氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的特定的修飾試劑并應(yīng)用到蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾的研究中。然而目前這類反應(yīng)試劑的專一性不夠，即使試劑對某一基團(tuán)的反應(yīng)是專一性的，也仍然有多個(gè)同類殘基與之進(jìn)行反應(yīng)，使得對某個(gè)特定殘基的選擇性修飾非常困難。解決方法為了克服這一缺陷，人們開始使用親和性標(biāo)記試劑，這些化合物是具有化學(xué)反應(yīng)性的蛋白質(zhì)分子的底物或配體的類似物。由于結(jié)構(gòu)的相似性，它們對底物或配體的結(jié)合部位具有一定的親和性，因而能夠選擇性地結(jié)合在蛋白質(zhì)分子的特定部位。另外，由于它們的化學(xué)反應(yīng)性，能夠與蛋白質(zhì)分子共價(jià)地結(jié)合。這類反應(yīng)試劑具有飽和性，與底物或天然配體競爭蛋白質(zhì)分子的結(jié)合位點(diǎn)。由于這些試劑對結(jié)合部位的親和性，即高度的位點(diǎn)專一性，因此能否與某一特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)已經(jīng)不是主要問題。親和性標(biāo)記試劑中最重要的是光親和標(biāo)記和自殺性抑制劑兩種類型。光親和標(biāo)記試劑的反應(yīng)可以用光照來引發(fā)，因此它們的反應(yīng)性可以被很好地控制，其參與反應(yīng)的成分為自由基，可以與它們附近幾乎所有的基團(tuán)反應(yīng)，這些標(biāo)記試劑也可以與非極性的側(cè)鏈基團(tuán)相結(jié)合。自殺性抑制劑作為底物是沒有反應(yīng)活性的，一旦它們轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，就會產(chǎn)生1個(gè)可反應(yīng)基團(tuán)，因此它們標(biāo)記的是活性部位附近的側(cè)鏈基團(tuán)。由于它們的這種特性，自殺性抑制劑可以被用來作為治療某些疾病的有效藥物。?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)這類化學(xué)修飾試劑如乙酰咪唑、二異丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基異脲等，它們在室溫(20℃～25℃)，pH4.5～9.0的條件下可與蛋白質(zhì)的某些側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生?；磻?yīng)。被作用的蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈基團(tuán)有氨基、羥基、巰基以及酚基等。烷基化反應(yīng)這類試劑的特點(diǎn)常常是帶有活潑的鹵素原子，由于鹵素原子的電負(fù)性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的親核基因(例如-NH2，-SH等)發(fā)生烷基化。屬于這類修飾試劑的有：2,4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰鹵代物和碘甲烷等。被作用的蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈基團(tuán)有氨基、巰基、羧基、硫醚基和咪唑基等。氧化和還原反應(yīng)這類試劑具有氧化性，能將側(cè)鏈基團(tuán)氧化，屬于這類試劑的有H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺等，有些試劑具有很強(qiáng)的氧化性，往往容易使肽鏈斷裂，因此在修飾反應(yīng)中要控制好氧化條件。光敏劑存在下的光氧化是一種比較溫和的氧化作用。易受氧化作用的側(cè)鏈基團(tuán)有巰基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及酚基等。另外還有一類主要作用于二硫鍵的還原劑。這類修飾試劑有2－硫基乙醇、硫基乙酸和二硫蘇糖醇(DTT)等。值得提出的是連四硫酸鈉或連四硫酸鉀(Tetrathionate)是一種溫和的氧化劑，因此在化學(xué)修飾反應(yīng)中常用來作為-SH的可逆保護(hù)劑。芳香環(huán)取代反應(yīng)蛋白質(zhì)氨基酸殘基的酚羥基在3和5位上很容易發(fā)生親電取代的碘化和硝化反應(yīng)。這類修飾反應(yīng)的一個(gè)典型的例子是四硝基甲烷(TNM，Tetranitro-methane)，它可以作用于酪氨酸的酚羥基，形成3-硝基酪氨酸的衍生物。這種產(chǎn)物有特殊的光譜，可用于直接的定量測定。蛋白質(zhì)肽鏈的裂解另外還有一些蛋白質(zhì)與化學(xué)試劑的重要反應(yīng)，如溴化氰裂解，在自發(fā)和誘導(dǎo)重排的條件下主要導(dǎo)致肽鍵的斷裂。溴化氰(CNBr)裂解甲硫氨酸殘基的羧基側(cè)鏈肽鍵的反應(yīng)機(jī)理如下圖所示：巰基的化學(xué)修飾由于巰基具有很強(qiáng)的親核性，成為蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)，因此人們最先研究它的特異性修飾試劑并研究了巰基在酶催化過程中的重要作用以及在一些蛋白質(zhì)中對維持亞基間相互作用所做的貢獻(xiàn)。烷基化試劑是一種重要的巰基修飾試劑，特別是碘乙酸和碘乙酰胺。在蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析和測序前，通常要用碘乙酸來使巰基基團(tuán)羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解，而且羧甲基化的半胱氨酸很容易被氨基酸分析儀所識別。其它一些鹵代酸和鹵代酰胺如溴代乙酸也被應(yīng)用來修飾巰基，但反應(yīng)比碘乙酸和碘乙酰胺要慢。然而，在鹵代酸與巰基反應(yīng)的同時(shí)，盡管反應(yīng)能力比較弱，咪唑基團(tuán)也會與鹵代酸結(jié)合，核糖核酸酶中咪唑基團(tuán)的反應(yīng)就是一個(gè)明顯的例子。N-乙基馬來酰亞胺是一種有效的巰基修飾試劑。該反應(yīng)具有較強(qiáng)的專一性并伴隨光吸收的變化，可以很容易通過光吸收的變化確定反應(yīng)的程度。另外，N-取代馬來酰亞胺自旋標(biāo)記物可以作為自旋探針來研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的情況，如曾經(jīng)用來有效地研究了丙酮酸脫氫酶復(fù)合體系臂的運(yùn)動(dòng)性。5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又稱為Ellman試劑，目前已成為最常用的巰基修飾試劑。DTNB可以與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記1個(gè)2-硝基-5-硫苯甲酸(TNB)，同時(shí)釋放1個(gè)有顏色的TNB陰離子。該陰離子在412nm具有很強(qiáng)的吸收(=1.36×104(mol／L)-1cm-1，pH=8.0)，可以很容易通過光吸收的變化來監(jiān)測反應(yīng)的程度。DTNB也可以用來定量檢測溶液中硫化氫的含量，只是lmol硫化氫與1molDTNB反應(yīng)將產(chǎn)生2molTNB和1mol硫。由于定點(diǎn)誘變的迅速發(fā)展，在目前蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的研究中，特別是半胱氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾有被定點(diǎn)誘變的方法取代的趨勢。但Ellman試劑仍然是目前最常用的定量測定蛋白質(zhì)分子巰基數(shù)目試劑，用以研究巰基改變程度和巰基所處環(huán)境的探測。Ellman試劑還被用于探測蛋白質(zhì)分子去折疊與再折疊時(shí)的構(gòu)象變化狀態(tài)以及跟蹤構(gòu)象變化的過程。由于TNB的pKa為4.4，在pH8.0附近時(shí)帶負(fù)電荷，與處于堿性環(huán)境中的巰基很難反應(yīng)，而在pH較低的情況下，不能再用412nm處的光吸收定量，使得DTNB不適于作為酸性介質(zhì)條件下的滴定劑或反應(yīng)探針。為此，使用含有2-二硫砒啶和4-二硫砒啶的試劑來克服，如對稱結(jié)構(gòu)的2,2’-二硫二砒啶，4,4’-二硫二砒啶，6,6’-二硫二尼克酸和2,2’-二硫?qū)?5-硝基砒啶)。這些巰基試劑作為“雙質(zhì)子狀態(tài)”親電子試劑，很容易與由于環(huán)境中其它基團(tuán)造成的高pH條件下解離的巰基或硫醇陰離子反應(yīng)，與硫蛋白共價(jià)聯(lián)結(jié)，并產(chǎn)生光譜效應(yīng)。上述替代DTNB的試劑中，2,2’-二硫二砒啶(2-PDS)和4,4’-二硫二砒啶(4-PDS)用得較為廣泛。每修飾1分子巰基，同時(shí)釋放1分子砒啶硫酮。對于2-PDS釋放的2-砒啶硫酮(2-TP)在343nm處有光吸收；而4-砒啶硫酮(4-TP)在324nm處有光吸收。用4-PDS滴定人肌肌酸激酶的差吸收光譜由于4,4’-二硫二砒啶在324nm處無吸收，產(chǎn)生的4-砒啶硫酮在280nm也沒有明顯的吸收，而試劑與蛋白質(zhì)側(cè)鏈巰基的反應(yīng)又是定量進(jìn)行的，因此可以不分離未反應(yīng)試劑而直接滴定蛋白質(zhì)溶液，并根據(jù)324nm處光吸收值來確定不同的修飾程度。樣品光路為溶于50mmol/LTris-HCl(pH8.0)中的人肌肌酸激酶，酶濃度為12.5mol/L，參照光路為同樣的緩沖液。圖中的吸收光譜自下而上，其4-PDS與人肌肌酸激酶的分子比分別為0;0.2;0.4;0.8;1.2;1.6;2.4;2.8;3.2;3.6;4.0;5.0巰基的氧化也是一種專一性較高的化學(xué)修飾手段。過氧化氫一般用來氧化巰基形成二巰鍵或在較大量時(shí)形成磺酸。在一定的條件下，過氧化氫與蛋白質(zhì)巰基反應(yīng)也可以生成次磺酸。有機(jī)汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑之一，其中最常用的是對氯汞苯甲酸，該化合物溶于水中形成羧基衍生物，與巰基相互作用時(shí)在255nm處光吸收具有較大的增強(qiáng)效應(yīng)。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)與蛋白質(zhì)分子中的側(cè)鏈巰基反應(yīng)很快，并在395nm處產(chǎn)生一負(fù)差吸收峰。另外，人們還利用溴代乙胺或氮丙啶將半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)變成可水解的胰蛋白酶敏感的S-(2-氨基乙基)半胱氨酸殘基。氨基的化學(xué)修飾非質(zhì)子化的賴氨酸的-氨基是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)。-氨基的pKa值一般為10，由于微環(huán)境的影響，蛋白質(zhì)分子中也可能存在低pKa值的賴氨酸殘基，這些殘基具有更強(qiáng)的可反應(yīng)性，因而可以被選擇性地修飾。在草酰乙酸脫羧酶中就存在一個(gè)pKa值為5.6的可反應(yīng)賴氨酸殘基。有許多化合物都可用來修飾賴氨酸殘基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一種。TNBS與賴氨酸殘基反應(yīng)，在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。有人用TNBS標(biāo)記了GSH轉(zhuǎn)移酶的1個(gè)反應(yīng)活性很高的賴氨酸殘基，證實(shí)了在酶的活性部位GSH結(jié)合區(qū)域存在一個(gè)賴氨酸殘基，即Lys—44。目前，氨基的烷基化已經(jīng)成為一種重要的賴氨酸修飾方法，這些試劑包括有鹵代乙酸、芳基鹵和芳族磺酸，或者在氫的供體(如硼氫化鈉，硼氫化氰或硼氨)存在的條件下使蛋白質(zhì)分子與醛或酮反應(yīng)，稱為還原性烷基化。賴氨酸殘基的還原性烷基化所使用的羰基化合物取代基的大小對修飾的結(jié)果具有很大的影響。在硼氫化鈉的存在下，用不同的羰基試劑使卵類粘蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的賴氨酸殘基烷基化，修飾程度為40％～100％。其中丙酮、環(huán)戊酮、環(huán)己酮和苯甲醛為單取代，而丁醛有20％～50％的雙取代，甲醛則幾乎為100％的雙取代。這3種蛋白的甲基化和異丙基化的衍生物仍是可溶性的，并且仍然具有幾乎全部的生物活性。近來的研究表明硼氨及其衍生物可以作為還原性烷基化的各種還原劑，其中比較成功的兩種結(jié)構(gòu)為二甲硼氨和三甲硼氨。利用氰酸鹽使氨基甲氨?；彩且环N常用的修飾賴氨酸殘基的手段，這種方法的一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是氰酸根離子很小，比較容易接近所要修飾的基團(tuán)。氰酸鹽也能夠與半胱氨酸和組氨酸殘基反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的甲氨酰衍生物，也有報(bào)道說胰凝乳蛋白酶活性部位的絲氨酸也可被甲氨?；＞S生素B6的天然衍生物磷酸砒哆醛(PLP)是一種非常專一的賴氨酸修飾試劑，可逆反應(yīng)生成的席夫堿可通過硼氫化鈉還原來固定，反應(yīng)可通過光吸收(還原的磷酸砒哆衍生物的最大吸收位在325nm處)或3H-H2B還原來定量。一個(gè)典型的例子是用PLP確定磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的必需賴氨酸殘基，并發(fā)現(xiàn)該酶的每一個(gè)亞基只能特定地結(jié)合一個(gè)分子的PLP。兔肌磷酸葡萄糖異構(gòu)酶經(jīng)5’-磷酸砒哆醛和硼氫化鈉處理后的吸收光譜氨基的化學(xué)修飾在蛋白質(zhì)序列分析中占了極其重要的地位。在蛋白質(zhì)序列分析中，首先必須測定整個(gè)肽鏈的N-末端和C-末端殘基。用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化學(xué)修飾方法最常用的有：(1)2,4-二硝基氟苯(DNFB)法DNFB與氨基的反應(yīng)被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子的N-末端氨基酸殘基的測定。多肽鏈N-末端的游離NH2與DNFB(Sanger試劑)反應(yīng)后，生成DNP-多肽，由于DNFB與氨基酸形成的鍵對酸水解的穩(wěn)定性遠(yuǎn)比肽鍵高，因此DNP-多肽經(jīng)水解后，只有N-末端氨基酸為黃色的DNP-氨基酸衍生物，其余都是游離氨基酸，只要鑒別所生成的DNP-氨基酸，便可確定多肽鏈N-末端的氨基酸殘基。雖然側(cè)鏈的-NH2和酚基等也能與DNFB反應(yīng)，但生成的側(cè)鏈取代衍生物如：-DNP氨基酸當(dāng)用有機(jī)溶劑(如乙酸乙酯)抽提時(shí)將與游離氨基酸一起留在水相中，因而容易和有機(jī)相中的-DNP氨基酸區(qū)分開來。待分析的DNP-氨基酸可用紙層析、薄層層析或高效液相色譜進(jìn)行分離鑒定和定量測定。(2)丹磺酰氯(DNS)法DNS是二甲氨基萘磺酰氯，簡稱丹磺酰氯(Dansylchloride)。其方法和原理同DNFB法，只是用DNS代替DNFB。由于丹磺酰氯具有強(qiáng)烈的熒光，靈敏度比DNFB高100倍，并且水解后的DNS-氨基酸不必提取，可直接用于紙電泳和薄層層析加以鑒定。(3)苯異硫氰酸酯(PITC)法：PITC能與多肽鏈的N-末端游離氨基反應(yīng)，可鑒定N-末端殘基。更重要的是它可以用于序列測定。此法首先是由.Edman于1950年提出的，因此此法后人稱之為Edman降解法。PITC與多肽鏈的游離末端氨基作用時(shí)，反應(yīng)可分為以下3步：第一步是偶聯(lián)(coupling)反應(yīng),反應(yīng)在弱堿性介質(zhì)中進(jìn)行，因?yàn)镻ITC只能與末質(zhì)子化的基團(tuán)反應(yīng)：第二步是環(huán)化斷裂反應(yīng)：第一步反應(yīng)中形成的PTC-肽在無水強(qiáng)酸介質(zhì)如三氟乙酸中，最靠近PTC基的肽鍵將發(fā)生斷裂，同時(shí)，PTC-氨基酸殘基環(huán)化成噻唑啉酮苯胺衍生物。反應(yīng)必須在無水條件下進(jìn)行，否則，其它肽鍵也將被水解。第三步是轉(zhuǎn)化反應(yīng)：第二步中生成的ATZ不穩(wěn)定，難于用來鑒定該氨基酸，因此，在酸性水溶液中將它轉(zhuǎn)變?yōu)镻TH-氨基酸。轉(zhuǎn)化過程中實(shí)際又分兩步進(jìn)行，首先水解生成PTC-氨基酸，然后環(huán)化成PTH-氨基酸，這是一個(gè)非常穩(wěn)定的化合物。所有PTH-氨基酸在紫外區(qū)有強(qiáng)吸收，最大吸收值在268nm處。PTH-氨基酸可利用各種層析技術(shù)分離。由于PITC與肽鏈的游離末端氨基結(jié)合后，只是減弱緊挨PTC基的末端殘基羧基側(cè)的肽鍵，因此在無水強(qiáng)酸作用下，只切下與PITC反應(yīng)的那個(gè)氨基酸殘基，這時(shí)，剩下的減少了一個(gè)殘基的肽鏈便在它的N端暴露出一個(gè)新的游離末端氨基，又可參加第二輪反應(yīng)，然后再切下第二殘基，如此循環(huán)。這樣，如果進(jìn)行n輪反應(yīng)，就能測出n個(gè)殘基的順序。Edman降解法測定序列的操作現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，一次能連續(xù)測出60～70個(gè)殘基的肽段順序。此法靈敏度高，可用于微量分析，最低用量可在幾個(gè)pmol水平上。羧基的化學(xué)修飾由于羧基在水溶液中的化學(xué)性質(zhì)使得蛋白質(zhì)分子中谷氨酸和天門冬氨酸的修飾方法很有限，產(chǎn)物一般是酯類或酰胺類。在一些情況下，它們也可與賴氨酸殘基的-氨基通過酰胺鍵相連。水溶性的碳化二亞胺類特定修飾蛋白質(zhì)分子的羧基基團(tuán)，目前已成為一種應(yīng)用最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，它在比較溫和的條件下就可以進(jìn)行。[14C]甘氨酸乙酯酰胺化后在氨基酸分析儀上將會出現(xiàn)1個(gè)新的峰。在一定的條件下，[14C]甘氨酸乙酯也可以與絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸反應(yīng)?？箖鎏请?的末端羧基與1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亞胺反應(yīng)結(jié)合上乙醇胺成為N-(2-羥胺)，仍然具有90％的剩余活力，說明該糖肽上羧基所帶的電荷為非必需的。羧基也可以與硼氟化三甲烊鹽(Trimethyloxonium

fluoroborate)反應(yīng)生成甲酯。胃蛋白酶與[14C]硼氟化三甲烊鹽在pH5.0的條件下反應(yīng)，酶的活力完全喪失，研究結(jié)果表明該酶有兩個(gè)羧基為其必需基團(tuán)。也有報(bào)道硼氟化三甲烊鹽可以與組氨酸和甲硫氨酸反應(yīng)。用甲醇－HCl的酯化反應(yīng)咪唑基的化學(xué)修飾組氨酸殘基的咪唑基可以通過氮原子的烷基化或碳原子的親核取代來進(jìn)行修飾。由于組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，因此有大量關(guān)于組氨酸殘基修飾的報(bào)道。組氨酸殘基的咪唑基的修飾主要有兩種方法，第一種是光氧化。然而，光氧化的特異性很低，不但與組氨酸殘基反應(yīng)，而且與甲硫氨酸、色氨酸以及少量的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基進(jìn)行反應(yīng)。堿性亞甲藍(lán)和玫瑰紅是該方法常用的兩種試劑。焦碳酸二乙酯(DPC，Diethylpyrocarbonate)是最常用的修飾組氨酸殘基的試劑。該試劑在接近中性的情況下表現(xiàn)出比較好的專一性，與組氨酸殘基反應(yīng)使咪唑基上的1個(gè)氮羧乙基化，并且使得在240nm處的光吸收增加。該取代反應(yīng)在堿性條件下是可逆的，可以重新生成組氨酸殘基。在水溶液中，特別是在高pH的情況下，該試劑的穩(wěn)定性不夠好。碘化反應(yīng)碘代乙酸酚和脂肪族羥基的化學(xué)修飾酪氨酸殘基的修飾既可以是酚羥基的修飾，也可以是芳香環(huán)上的取代修飾。酚羥基的修飾一般是可逆的，一些甚至只能短暫的存在或者在除去反應(yīng)試劑和純化產(chǎn)品時(shí)就可逆回去了。簡單的酯化反應(yīng)是常用的一種方法，在弱堿性或羥胺溶液中就可以重新生成酚羥基。有人曾用N-乙?；溥?qū)α姿峄竍進(jìn)行化學(xué)修飾，發(fā)現(xiàn)別構(gòu)抑制劑AMP對酶活性有明顯的保護(hù)作用。與酚羥基修飾不同，芳香環(huán)取代則可以生成比較穩(wěn)定的產(chǎn)物，比較早使用的最好的方法是碘化作用。在溫和的條件下，碘也會與蛋白質(zhì)分子的組氫酸和半胱氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)；在劇烈的條件下，色氨酸和甲硫氨酸殘基也會受到影響。四硝基甲烷(TNM)由于反應(yīng)的高度專一性和反應(yīng)條件比較溫和，已經(jīng)成為酪氨酸殘基修飾最常用的修飾試劑，它與酪氨酸殘基反應(yīng)生成離子化的發(fā)色基團(tuán)——3-硝基酪氨酸衍生物。TNM也可以與蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基反應(yīng)，在一定的條件下，還可以與色氨酸、組氨酸和甲硫氨酸殘基反應(yīng)。蘇氨酸和絲氨酸殘基的專一性化學(xué)修飾研究得相對比較少，它們的羥基一般都可被修飾酚羥基的修飾試劑所修飾，只是反應(yīng)的條件要更嚴(yán)格一些，而一旦反應(yīng)，生成的產(chǎn)物要比與酚羥基生成的產(chǎn)物更穩(wěn)定。絲氨酸修飾比較著名的例子是在絲氨酸蛋白酶活性部位的絲氨酸殘基對?；噭┤缍惐姿岜憩F(xiàn)出的較高的反應(yīng)性。用二異丙基氟磷酸修飾胰凝乳蛋白酶時(shí)，如果控制好溫和的反應(yīng)條件，胰凝乳蛋白酶分子中的全部絲氨酸殘基(28個(gè))中，只有1個(gè)Ser195與試劑DFP作用，修飾后，酶活性也就喪失?？梢?，這個(gè)Ser195殘基處于酶的活性部位的特殊結(jié)構(gòu)中。胍基的化學(xué)修飾精氨酸殘基含有1個(gè)強(qiáng)堿性的胍基，在結(jié)合帶有陰離子底物的酶的活性部位中起著重要作用，因此對精氨酸殘基的修飾研究是非常重要的。但是，由于精氨酸殘基的強(qiáng)堿性，因而與大多數(shù)試劑很難發(fā)生修飾反應(yīng)，反應(yīng)所需的高pH值也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，而一些二羰基化合物則能夠在中性或弱堿性的條件下與精氨酸反應(yīng)，所以關(guān)于精氨酸殘基的化學(xué)修飾試劑的研究大多集中在二碳基化合物上。丁二酮和1,2-環(huán)己二酮與胍基反應(yīng)可逆地生成精氨酸—丁二酮復(fù)合物，該產(chǎn)物可以與硼酸結(jié)合而穩(wěn)定下來。上述反應(yīng)要在黑暗中進(jìn)行，因?yàn)槎《梢宰鳛楣饷粜苑磻?yīng)試劑破壞其它殘基，特別是色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基。苯乙二醛也是用來對精氨酸殘基進(jìn)行修飾的，通常是兩個(gè)分子的苯乙二醛與1個(gè)精氨酸殘基不可逆地結(jié)合，該試劑與-氨基也有一定的反應(yīng)性。由于[14C]-苯乙二醛比較容易合成，因此它與蛋白分子的結(jié)合就很容易跟蹤。有人發(fā)現(xiàn)苯乙二醛與精氨酸模型化合物的反應(yīng)在碳酸氫鹽緩沖液中反應(yīng)較快，并且在該條件下與-氨基不發(fā)生反應(yīng)。一般認(rèn)為，與帶負(fù)電荷的底物或輔助因子作用的酶分子在它的結(jié)合位點(diǎn)上通常都含有帶正電的精氨酸殘基。用苯乙二醛、丁二酮和環(huán)己二酮修飾蛋白質(zhì)分子的結(jié)果都證實(shí)了這一假說。用這些試劑修飾卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的精氨酸殘基的結(jié)果表明，在每一個(gè)鐵原子的結(jié)合位點(diǎn)都有1個(gè)必需的精氨酸殘基。吲哚基的化學(xué)修飾由于色氨酸的反應(yīng)性要比一些親核基團(tuán)如巰基和氨基差，而且色氨酸殘基一般是位于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，所以色氨酸殘基不與通常使用的一些試劑反應(yīng)。但色氨酸吲哚基可以與一些試劑發(fā)生取代反應(yīng)或者被氧化裂解。光氧化反應(yīng)一種常用的修飾色氨酸殘基的試劑是N—溴代琥珀酰亞胺(NBS)，可以使吲哚基團(tuán)氧化成羥吲哚衍生物，反應(yīng)可以通過280nm處光吸收的減少而進(jìn)行監(jiān)測。但是酪氨酸殘基也可與該修飾試劑發(fā)生反應(yīng)，并且干擾光吸收的測定。Koshland試劑：2-羥基-5-硝基芐溴(HNBB)作為色氨酸殘基的修飾試劑。該試劑可以與色氨酸殘基反應(yīng)生成具有光吸收性的羥基硝基苯衍生物，并且光吸收對微環(huán)境的變化很敏感。但值得注意的是Koshland試劑不僅可以與色氨酸殘基作用，而且也很容易與半胱氨酸巰基作用，而且兩者的吸收光譜相似，因此在修飾色氨酸殘基時(shí)應(yīng)對巰基進(jìn)行可逆保護(hù)。HNBB的水溶性較差，有時(shí)使修飾反應(yīng)較難進(jìn)行。最近發(fā)展起來一種溶解性較好的試劑是二甲基(-2-羥基-5-硝基芐基)溴化锍(dimethyl-(2-hydroxy-5-nitrobenzyl)sulfoniumbromide)。這個(gè)試劑與2-羥基-5-硝基芐溴的作用相同，在蛋白質(zhì)色氨酸殘基上引入1個(gè)HNB基團(tuán)，因此也稱為Koshland試劑II。不同之處它是一種锍鹽，易溶于水，有利于試劑與蛋白質(zhì)分子的作用。當(dāng)肌酸激酶用連四硫酸鈉將巰基氧化保護(hù)起來，然后用二甲基(-2-羥基-5-硝基芐基)溴化锍處理保護(hù)后的肌酸激酶，在色氨酸殘基被修飾后，分離掉過量的未反應(yīng)試劑，再用DTT將SH重新還原出來。4-硝基苯基硫氯也可用來修飾吲哚基。近來，4-硝基苯基硫氯的類似物異雙功能反應(yīng)試劑2-硝基-4-疊氮苯基硫氯被用來修飾色氨酸殘基，可以在胰高血糖素的單個(gè)色氨酸殘基上附加一個(gè)光反應(yīng)性的疊氮硝基苯基團(tuán)。胰高血糖素不含半胱氨酸殘基，只有色氨酸殘基被修飾。硫醚基的化學(xué)修飾蛋氨酸殘基的化學(xué)修飾主要是由于硫醚的硫原子的親核性所引起的，盡管該殘基的極性較弱。在溫和的條件下，很難選擇性地修飾蛋氨酸殘基，但可以用幾種試劑氧化使蛋氨酸成為蛋氨酸亞砜，更多劇烈的氧化劑使它氧化成砜。由于在氨基酸分析中亞砜在酸水解過程中通常會生成甲硫氨酸，因此很容易被忽略掉。在中性和弱堿性的條件下，N-氯琥珀酰亞胺(NCS)和N-氯-p-甲苯磺酰胺(氯胺-T)可以使蛋白質(zhì)和肽段中的甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亞砜。氯胺-T的選擇性要比NCS好，NCS與色氨酸殘基反應(yīng)，而氯胺-T則不與色氨酸殘基發(fā)生作用，但是兩者都與半胱氨酸殘基反應(yīng)。甲硫氨酸殘基修飾的另外一種辦法是通過鹵化烷基酰胺使甲硫氨酸殘基烷基化，如用碘乙酰胺進(jìn)行修飾。由于硫原子在一定強(qiáng)度的酸性溶液中(如pH約為2)處于非質(zhì)子狀態(tài)，因此甲硫氨酸殘基可以在pH小于4的情況下被選擇性地烷基化。二硫鍵的化學(xué)修飾同巰基基團(tuán)類似，二硫鍵具有其特性可以用來進(jìn)行特異的修飾，通常是通過還原的方法。這些方法通常與某些巰基修飾方法相結(jié)合以阻止再氧化成二硫鍵或計(jì)算斷裂開的二硫鍵的數(shù)目。用巰基乙醇將二硫鍵還原成游離巰基是一種很常用的方法，具有高度的選擇性和長的半衰期。為使二硫鍵充分還原，反應(yīng)應(yīng)該在有變性劑的存在下進(jìn)行，并且由于反應(yīng)的平衡常數(shù)接近于1，必須使用大大過量的巰基乙醇。應(yīng)用二硫蘇糖醇(DTT)和它的差向異構(gòu)體二硫赤蘚糖醇(DTE)，也稱作C1eland試劑，一定程度上緩解了大過量的還原試劑使用的問題。由于第二步反應(yīng)是分子內(nèi)反應(yīng)以及還原試劑形成一個(gè)空間上有利的環(huán)狀二硫鍵，因此反應(yīng)平衡向還原蛋白質(zhì)分子二硫鍵的方向移動(dòng)。羥基使得C1eland試劑的水溶性增強(qiáng)，溶液因巰基的原因具有少許的臭味。二硫鍵經(jīng)還原劑處理后，被還原為琉基，一般情況下很容易自動(dòng)氧化回去，因而需要經(jīng)過羧甲基處理，以防止重新氧化成二硫鍵。過甲酸對二硫鍵的氧化化學(xué)修飾反應(yīng)條件的影響蛋白質(zhì)分子的特性反映了它的氨基酸組成的變化，功能基團(tuán)的解離狀態(tài)的改變使得整個(gè)復(fù)雜的維持其整體構(gòu)象的吸引和排斥力的網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變，進(jìn)而影響到蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活性。由于許多化學(xué)修飾反應(yīng)主要是由蛋白質(zhì)分子的整體結(jié)構(gòu)所控制，但也為所要修飾的單個(gè)或一類基團(tuán)的情況所影響，因此這些化學(xué)反應(yīng)對于所處的反應(yīng)條件特別敏感。在設(shè)計(jì)化學(xué)修飾反應(yīng)時(shí)，仔細(xì)的選擇反應(yīng)條件是很關(guān)鍵的一步。上述修飾氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)與大多數(shù)有機(jī)反應(yīng)不同的一個(gè)重要的特征是反應(yīng)試劑要溫和得多。溫和的反應(yīng)條件是防止蛋白質(zhì)分子變性的一個(gè)必要條件。除非在實(shí)驗(yàn)中或應(yīng)用時(shí)不必考慮蛋白質(zhì)生物學(xué)活性，才會采取比較劇烈的反應(yīng)條件。例如，蛋白質(zhì)作為某些商業(yè)粘合劑的粗原料時(shí)，其化學(xué)處理可以采用比較劇烈的條件。在所有影響蛋白質(zhì)分子的化學(xué)修飾反應(yīng)的條件中，pH值是最重要的一個(gè)條件，因?yàn)樗鼪Q定了具有潛在反應(yīng)能力的基團(tuán)所處的可反應(yīng)和不可反應(yīng)的離子狀態(tài)。溫度也是一個(gè)必須要注意的條件，因?yàn)闇囟瓤梢杂绊懙交钚詭€基的微環(huán)境。仔細(xì)選擇溫度可以減小或防止一些競爭的基團(tuán)反應(yīng)。在低溫(約-10℃)情況下用甲酸氧化蛋白質(zhì)可以使反應(yīng)限制在半