氟喹諾酮類藥物檢測(cè)（高效液相色譜法）

氟喹諾酮類藥物檢測(cè)方法獸藥殘留檢測(cè)高效液相色譜法原理用磷酸緩沖溶液提取試料中的藥物，C18柱凈化，流動(dòng)相洗脫。以磷酸-乙腈為流動(dòng)相，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定，外標(biāo)法定量。試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純?cè)噭?；水符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。1．達(dá)氟沙星：含達(dá)氟沙星不得少于99.0%。2．恩諾沙星：含恩諾沙星不得少于99.0%。3．環(huán)丙沙星：含環(huán)丙沙星不得少于99.0%。4．沙拉沙星：含沙拉沙星不得少于99.0%。5．磷酸。試劑和材料

6．氫氧化鈉。7．乙腈：色譜純。8．甲醇。9．三乙胺。10．磷酸二氫鉀。11．5.0mol/L氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉飽和液28mL，加水稀釋至100mL。試劑和材料

12．0.03mol/L氫氧化鈉溶液：取5.0mol/L氫氧化鈉溶液0.6mL，加水稀釋至100mL。13．0.05mol/L磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4mL，用水稀釋至1000mL。用三乙胺調(diào)pH至2.4。14．磷酸緩沖溶液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水使溶解并稀釋至500mL，用5.0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。15．磷酸鹽溶液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并稀釋至500mL，pH為4.0-5.0。試劑和材料

16．達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別去達(dá)氟沙星對(duì)照品約10mg，恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星對(duì)照品各約50mg，精密稱定，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解并稀釋成濃度為0.2mg/mL（達(dá)氟沙星）和1mg/mL（恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置2℃-8℃冰箱中保存，有效期為3個(gè)月。17．達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋成適宜濃度的達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液。置2℃-8℃冰箱中保存，有效期為1周。儀器和設(shè)備

1．高效液相色譜儀。2．天平：感量0.01g。3．分析天平：感量0.00001g。4．振蕩器。5．組織勻漿機(jī)。儀器和設(shè)備

6．離心機(jī)。7．勻漿杯：30mL。8．離心管：50mL。9．固相萃取柱：C18柱。10．微孔濾膜（0.45um）。測(cè)定步驟1.試樣的制備（1）取絞碎后的供試樣品，做為供試試料。（2）取絞碎后的空白樣品，做為空白試料。（3）取絞碎后的空白樣品，添加適宜濃度的對(duì)照溶液，作為空白添加試料。測(cè)定步驟2．提取?。?±0.05g）試料，置30mL勻漿杯中，加磷酸緩沖溶液10.0mL，10000r/min勻漿1min。勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，中速振蕩5min，離心（肌肉、脂肪10000r/min5min；肝、腎15000r/min，5min；肝、腎15000r/min10min）。合并兩次上清液，混勻，備用。3．凈化固相萃取柱依次用甲醇、磷酸鹽緩沖溶液各2mL預(yù)洗。取上清液5.0mL過(guò)柱，用水1mL淋洗，擠干。用流動(dòng)相1.0mL洗脫，擠干，收集洗脫液。經(jīng)濾膜過(guò)濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測(cè)定。測(cè)定步驟4．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確量取適量達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL的對(duì)照溶液，供高效液相色譜分析。測(cè)定步驟5．測(cè)定（1）色譜條件a)色譜柱：C18250mm×4.6mm，粒徑5μm，或相當(dāng)者。b)流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸溶液/三乙胺-乙腈（82+18，V/V）,使用前經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾。c)流速：0.8mL/min。d)檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280nm；發(fā)射波長(zhǎng)450nm。e）柱溫：室溫。f）進(jìn)樣量：20μL。測(cè)定步驟（2）測(cè)定法取試樣溶液和相應(yīng)的對(duì)照溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。對(duì)照溶液及試樣溶液由達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，對(duì)照溶液和試樣溶液的高效液相色譜圖。（六）空白試驗(yàn)除不加試料外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。（七）結(jié)果計(jì)算和表述按下式計(jì)算試料中達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星或沙拉沙星的殘留量。測(cè)定步驟式中：

X——試料中達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星或沙拉沙星的殘留量，單位為（ng/g）；

A——試樣溶液中相應(yīng)藥物的峰面積；

AS——對(duì)照溶液中相應(yīng)藥物的峰面積；

CS——對(duì)照溶液中相應(yīng)藥物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

V1——提