痰抗酸桿菌的熒光染色法

關(guān)于痰抗酸桿菌的熒光染色法第一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌的熒光染色檢查法主要內(nèi)容1.原理2.操作程序3.舜宇EX30熒光顯微鏡的操作使用4.質(zhì)量控制第二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色的原理抗酸桿菌是無(wú)色半透明的有陰電荷和很微弱的固有熒光的微生物，而熒光素金胺O是一種含有自由氨基的金黃色堿性染料，它的離子帶有陽(yáng)電荷，因此金胺O能和帶陰電荷的抗酸桿菌結(jié)合而使其著熒光色素，當(dāng)其遇到紫外線或青色線時(shí)，即可激發(fā)出桔黃色熒光。第三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（一）涂片①取經(jīng)95%乙醇擦拭脫脂過(guò)的干燥、清潔、無(wú)油污、無(wú)劃痕的新玻片，于玻片磨砂端用鉛筆在背面左端1/3標(biāo)注實(shí)驗(yàn)編號(hào)和序號(hào)；②在生物安全柜內(nèi)，小心打開(kāi)標(biāo)本容器，用折斷的竹簽（需事先準(zhǔn)備好）茬端挑取痰標(biāo)本的膿樣、干酪樣部分，于玻片右側(cè)2/3處均勻涂抹成10×20mm卵圓形痰膜，待自然干燥。第四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（二）染色1．把痰片放在染色架上，痰片間距應(yīng)大于10mm，火焰固定(5秒鐘火焰在玻片下方通過(guò)4次)；2.滴加0.1%金胺Ｏ染液，蓋滿痰膜，保持染色15分鐘。染色時(shí)應(yīng)始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時(shí)可續(xù)加染色液。第五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（二）染色3．流水自玻片上端輕緩沖洗，洗去染色液后傾斜玻片瀝去殘余水；4．滴加脫色液（3%鹽酸乙醇），脫色3分鐘或至痰膜無(wú)色；5.流水自玻片上端輕洗，如果脫色不徹底，重復(fù)脫色操作；第六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（二）染色6．瀝去殘余水；7．滴加0.5%高錳酸鉀復(fù)染液，保持染色1～4分鐘（根據(jù)試劑說(shuō)明書或經(jīng)驗(yàn)）；流水自玻片上端輕洗，洗去復(fù)染液，瀝去殘余水，待自然干燥。第七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（三）鏡檢和報(bào)告使用汞光源燈或LED光源的熒光顯微鏡，用10×目鏡，20×物鏡觀察，發(fā)現(xiàn)疑似抗酸菌的桿狀物，轉(zhuǎn)用40×物鏡確認(rèn)。在黑暗背景下，抗酸桿菌呈黃色綠熒光，桿狀略彎曲。按下列標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果：1.抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察50個(gè)視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。第八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（三）鏡檢和報(bào)告2.抗酸桿菌（1~9條）：1～9條抗酸桿菌/50個(gè)視野（報(bào)告抗酸桿菌數(shù)）。3.抗酸桿菌陽(yáng)性（1＋）：10～49條抗酸桿菌/50個(gè)視野。4.抗酸桿菌陽(yáng)性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野。第九頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（三）鏡檢和報(bào)告5.抗酸桿菌陽(yáng)性（3＋）：10～99條抗酸桿菌/每視野。6.抗酸桿菌陽(yáng)性（4＋）：≥100條抗酸桿菌/每視野。鏡檢結(jié)果應(yīng)及時(shí)記錄在“結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室登記本”和檢驗(yàn)報(bào)告單上。第十頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查操作程序（四）痰片保存熒光染色的痰涂片，在存放過(guò)程中抗酸桿菌的熒光會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而衰減，因此，熒光染色的標(biāo)本片必須盡快放置到避光環(huán)境、4℃冰箱保存，一般可保存半年。注意:熒光染色的痰涂片必須避光低溫存放，否則陽(yáng)性標(biāo)本因熒光衰退，可導(dǎo)致抽查復(fù)檢時(shí)呈假陰性!第十一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日舜宇EX30顯微鏡熒光鏡操作簡(jiǎn)要程序1.接通電源之前，確認(rèn)熒光器組的調(diào)光手輪是斷開(kāi)（OFF）狀態(tài)；2.把外接電源變壓器輸出接口（直流6V）插入LED熒光照明器組的電源插口，然后把另一端直接插到供電插座上；3.緩緩順時(shí)針?lè)较蜷_(kāi)啟熒光器組件的調(diào)光手輪，不必開(kāi)到最大；4.將熒光濾光塊箭頭切換到指向Flourescence標(biāo)志第十二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日舜宇EX30顯微鏡熒光鏡操作簡(jiǎn)要程序5.把熒光染色并已干燥的痰片裝入載物臺(tái)，目鏡10×配合物鏡20×尋找熒光物，在黑暗背景中尋找到熒光鏡象，發(fā)現(xiàn)形似抗酸桿菌的熒光物時(shí)，轉(zhuǎn)用40×物鏡確認(rèn)。6.鏡檢完畢，逆時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)熒光器組件的調(diào)光手輪至關(guān)斷（OFF）位置，最后關(guān)斷電源插座開(kāi)關(guān)或撥出顯微鏡變壓器供電端的插頭。(鏡檢后的標(biāo)本置于標(biāo)本盒內(nèi)，放4℃冰箱避光保存)第十三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日

萋—尼氏法與熒光法的主要區(qū)別：

項(xiàng)目萋—尼氏染色法熒光染色法初染色堿性復(fù)紅熱染5分鐘（或冷染15分鐘）0.1%金胺Ｏ染液，不加熱染色15分鐘，脫色時(shí)間1分鐘（脫色不徹底可重復(fù)）3分鐘（脫色不徹底可重復(fù)）復(fù)染液亞甲蘭復(fù)染，30秒高錳酸鉀復(fù)染，1～4分鐘鏡檢普通顯微鏡，目鏡10×，油鏡100×熒光顯微鏡，目鏡10×，物鏡40×陰性報(bào)告300個(gè)視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌50個(gè)視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌報(bào)告抗酸桿菌數(shù)1~8條抗酸桿菌/300視野1~9條抗酸桿菌/50個(gè)視野抗酸桿菌陽(yáng)性(1＋)3－9條抗酸桿菌/100視野10~49條抗酸桿菌/50個(gè)視野抗酸桿菌陽(yáng)性(2＋)1－9條抗酸桿菌/10視野1~9條抗酸桿菌/每視野抗酸桿菌陽(yáng)性(3＋)1－9條抗酸桿菌/每視野10~99條抗酸桿菌/每視野抗酸桿菌陽(yáng)性(4＋)≥10條抗酸桿菌/每視野≥100條抗酸桿菌/每視野標(biāo)本片保存拭去鏡油后放玻片盒，室溫保溫玻片盒避光、4℃冰箱保存標(biāo)本片保存期長(zhǎng)期半年內(nèi)第十四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制主要包括：標(biāo)本收集、試劑、涂片、染色操作、顯微鏡維護(hù)、鏡檢和結(jié)果登記及痰片的保存。1.標(biāo)本收集：用密封有蓋盒收集痰標(biāo)本，容器應(yīng)標(biāo)明病姓名、送檢日期及門診號(hào)。標(biāo)本性質(zhì)：應(yīng)為深咳痰液，痰性狀類別：膿樣痰、干酪樣痰、血性樣痰、膿性粘液痰和水樣痰。第十五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制2.試劑：染液外觀無(wú)沉淀、無(wú)懸浮物（金胺O非常穩(wěn)定，一般不產(chǎn)生沉淀），貯存環(huán)境避光通風(fēng)、避免高溫，每次使用后及時(shí)蓋緊，已開(kāi)瓶的試劑的使用，一般控制在6個(gè)月內(nèi)用完或棄去。3.涂片：應(yīng)當(dāng)取痰的膿樣、干酪樣部分，于玻片右側(cè)2/3均勻涂成10×20mm痰膜，自然干燥，染色前固定。第十六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制4.染色：初染15分鐘要避免染液干燥，可續(xù)加染液；脫色符合要求，復(fù)染操作根據(jù)試劑說(shuō)明書或經(jīng)驗(yàn)控制好時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可導(dǎo)致熒光亮度消失。初染、脫色、復(fù)染的水洗后，都要瀝去玻片上的殘余水。5.顯微鏡維護(hù)：防塵、防潮、防震、避免陽(yáng)光直射，按操作規(guī)范使用，定期清掃灰塵。為延長(zhǎng)光源燈的使用壽命，一般不把光源調(diào)到最強(qiáng)，并且注意使用后及時(shí)關(guān)閉光源燈開(kāi)關(guān)和變壓器電源。第十七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日抗酸桿菌熒光染色檢查質(zhì)量控制6.鏡檢：鏡頭清晰，無(wú)霉菌，視野清晰，物鏡20