第十二章 植物種植資源的離體保存

植物種質(zhì)資源

的離體保存第十二章知識(shí)要求了解植物種質(zhì)離體保存的類型與特點(diǎn)；了解超低溫保存的特點(diǎn)與方法；掌握植物種質(zhì)低溫保存的基本操作技術(shù)。植物種質(zhì)資源保存具體方法很多，大體可分為兩大類。一類是原境保存，為此建立自然保護(hù)區(qū)、天然公園或就地保護(hù)處于危險(xiǎn)或受威脅的植物；另一類是異境保存，為此需要建立各種基因庫，如種子園、種植園等田間基因庫及種子庫、花粉庫等離體基因庫。野外保存植物種質(zhì)資源需要大量的土地和人力資源，成本高，且易遭受各種自然災(zāi)害的侵襲。種子庫只能保存正常型種子，對(duì)于頑拗型、脫水敏感的種子和有性繁殖困難的植物則無能為力，而且種子庫僅能保存基因，而不能保存特定的基因型材料。自1975年Henshaw和Morel首次提出離體保存(conservationinvitro)植物種質(zhì)的策略以來，該項(xiàng)技術(shù)受到植物界的極度重視。植物種質(zhì)離體保存：是指對(duì)離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)等材料，采用限制、延緩或停止其生長(zhǎng)的處理使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長(zhǎng)，并再生植株的方法。意義：所占空間少，節(jié)省大量的人力、物力和土地；便于種質(zhì)資源的交流利用；需要時(shí)，可以用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖；避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失。缺點(diǎn)：對(duì)于限制或延緩生長(zhǎng)的處理，需定期轉(zhuǎn)移，連續(xù)繼代培養(yǎng)；易受微生物污染或發(fā)生人為差錯(cuò)；多次繼代培養(yǎng)有可能造成遺傳性變異及材料和分化和再生能力的降低。超低溫保存可在一定程度上避免這些問題。常用的離體保存方法有緩慢生長(zhǎng)保存(slowgrowthconservation)和超低溫保存(cryopreservation)。前者適合中短期保存，后者用于長(zhǎng)期保存。第一節(jié)緩慢生長(zhǎng)保存緩慢生長(zhǎng)保存是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，抑制保存材料生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)繼代時(shí)間，減少操作和節(jié)省勞力的保存方法。影響離體保存的因素有保存時(shí)的光照、溫度、濕度、季節(jié)變化，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，種質(zhì)資源的地理分布和生態(tài)類型等，可以根據(jù)具體材料采取不同的方法來延緩其生長(zhǎng)。1．降低培養(yǎng)溫度降低培養(yǎng)溫度是植物組織培養(yǎng)物緩慢生長(zhǎng)保存最常用的方法。葡萄和草莓莖尖培養(yǎng)物分別在9℃和4℃下連續(xù)保存多年，每年僅需繼代一次。梨試管苗在4℃下，每2年繼代一次，保存后，材料田間生長(zhǎng)正常。芋頭莖培養(yǎng)物在9℃，黑暗條件下保存3年，仍有100%的存活率。正確選擇適宜低溫是保存后高存活率的關(guān)鍵。2．培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)常規(guī)組織培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素以促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)和發(fā)育。而試管苗種質(zhì)保存添加的則是生長(zhǎng)延緩劑或生長(zhǎng)抑制劑來抑制保存材料的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)其繼代周期。離體保存常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)有ABA(脫落酸)、CCC(矮壯素)、PP333(多效唑)、B9(比久)、MH(青鮮素)等。ABA對(duì)草莓試管苗芽增殖的抑制作用隨ABA使用濃度的增加而明顯增強(qiáng)，且均存在顯著性差異。在草莓試管苗的離體保存中，多效唑?qū)Σ葺嚬苊缪康姆只忻黠@的促進(jìn)作用，對(duì)草莓試管苗芽的伸長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

3．提高培養(yǎng)基滲透壓提高培養(yǎng)基的滲透壓可抑制培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)。最常用的方法是在培養(yǎng)基中加入甘露醇、醇等。這類化合物是惰性物質(zhì)，不易被外植體吸收，抑制外植體生長(zhǎng)的作用持久。其作用機(jī)理是提高培養(yǎng)基的滲透勢(shì)負(fù)值，造成水分逆境，降低細(xì)胞擴(kuò)大生長(zhǎng)所必需的膨壓，使細(xì)胞吸水困難，減弱新陳代謝，延緩細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)細(xì)胞壁酶的活性受到抑制，生長(zhǎng)受阻，減少了養(yǎng)分消耗。4．適宜的光照強(qiáng)度光因子對(duì)植物的光合作用和生長(zhǎng)有著重要的影響。調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度以達(dá)到最佳的保存效果也是種質(zhì)保存經(jīng)常使用的方法之一。在較弱光照條件下，培養(yǎng)材料由于光合作用弱，生長(zhǎng)緩慢而利于保存。5．合適的包扎物試管的包扎物也對(duì)保存材料的生長(zhǎng)有影響，主要表現(xiàn)在不同的封口材料對(duì)試管中氣體成分及其含量等的變化，培養(yǎng)基的風(fēng)干、污染等有不同程度的影響。因此，選擇合適的包扎物對(duì)保存效果的影響很大。辛淑英（1989）在甘薯種質(zhì)的保存研究中發(fā)現(xiàn)，以鋁箔封口保存效果最佳，保持濕度效果好，還可以防止污染，而使用棉塞時(shí)間過長(zhǎng)容易造成污染;使用橡皮塞容易造成缺氧，使材料死亡。6．培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)控制植物生長(zhǎng)發(fā)育依賴外界養(yǎng)分的供給，如果養(yǎng)分供應(yīng)不足，植物生長(zhǎng)緩慢，植株矮小。因此采用降低培養(yǎng)基中的養(yǎng)分水平也可有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，達(dá)到保存的目的。如菠蘿種質(zhì)在不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中保存12個(gè)月后存活率為92.2%，小苗的平均生長(zhǎng)量只有1cm左右；保存苗轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，很快恢復(fù)生長(zhǎng)并分化出叢生芽，在同一培養(yǎng)基中保存18個(gè)月后仍有85.7%的存活。7．降低培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度通過降低培養(yǎng)材料周圍的大氣壓力或氧含量來保存植物組織培養(yǎng)材料，這一想法最早是由Caplin（1959）提出的。近10年這方面的研究比較少。而權(quán)銀等（1989）在柑橘種質(zhì)離體保存中對(duì)不同封口材料的比較研究表明，封口材料以其透氣性能影響試管內(nèi)氣體成分，從而影響保存效果。第二節(jié)超低溫保存一、超低溫保存概述通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫。超低溫冷凍保存一般以液氮為冷源，使溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下，活細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，處于生理停頓狀態(tài)，因而可使植物材料在該溫度下不會(huì)發(fā)生遺傳性狀的改變，但細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能可保存。超低溫保存技術(shù)可極大地延長(zhǎng)儲(chǔ)存材料的壽命；避免細(xì)胞和組織的染色體數(shù)目因長(zhǎng)期繼代而發(fā)生的變異；避免了離體材料在長(zhǎng)期無性繁殖過程中可能造成的退化和病蟲侵害；可有效、安全地長(zhǎng)期保存那些珍貴稀有的種質(zhì)。二、超低溫保存的研究概況1.超低溫保存技術(shù)的發(fā)展低溫干燥；減壓；超低溫自從1973年Nag等首次成功地超低溫保存了胡蘿卜懸浮細(xì)胞以來，國(guó)內(nèi)外已對(duì)近200種植物材料進(jìn)行了超低溫保存。2.用于離體超低溫保存的植物材料種子、胚、胚軸和體細(xì)胞胚保存常用干凍法莖尖和分生組織大多用玻璃化法或包埋脫水法3.超低溫保存的植物種類超低溫保存已涉及到不同的植物種類，如野生及人工創(chuàng)造的谷類、豆類、薯類、油類、糖類、纖維類、蔬菜類、果樹、樹木、藥用植物和藻類等。超低溫冷凍保存為什么沒有把細(xì)胞凍死？細(xì)胞冰凍結(jié)冰保護(hù)性脫水理論溶液的玻璃化理論三、植物超低溫凍存的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞冰凍結(jié)冰保護(hù)性脫水理論常溫下，細(xì)胞及其溶液處于滲透平衡的狀態(tài)，當(dāng)溫度降到冰點(diǎn)以下時(shí)，首先是細(xì)胞外溶液部分“凍結(jié)”出冰；胞外溶液的濃度升高，破壞了細(xì)胞內(nèi)外溶液的平衡，水分由胞內(nèi)通過細(xì)胞膜向外滲透，細(xì)胞收縮，細(xì)胞內(nèi)濃度提高；當(dāng)溫度不斷降低時(shí)，凍結(jié)和滲透過程不斷進(jìn)行，這種過程稱為保護(hù)性脫水。當(dāng)復(fù)溫時(shí)，溫度升高，凍結(jié)的冰不斷融化，水分由胞外向胞內(nèi)滲透，使收縮的細(xì)胞膨脹，可能恢復(fù)原狀。精確控制上述過程，能使細(xì)胞在降溫、復(fù)溫、滲透過程中不被損傷而死亡。溶液的玻璃化理論溶液在降溫時(shí)，如果沒有均一晶核或晶核生長(zhǎng)缺乏足夠的時(shí)間，就首先形成過冷溶液。繼續(xù)降溫，均一晶核形成。如果降溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶。降溫速度足夠快，均一晶核很少或幾乎沒有形成，或均一晶核生長(zhǎng)缺乏足夠的時(shí)間，溶液就進(jìn)入無定型的玻璃化狀態(tài)。它是一種透明的固態(tài)，與液態(tài)相比，分子沒有發(fā)生重排，因此與晶態(tài)不同。被稱為玻璃態(tài)，此時(shí)的溫度叫玻璃化形成溫度。在玻璃化形成過程中，既沒有溶液效應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷，也沒有冰晶的形成對(duì)細(xì)胞造成的機(jī)械傷害。提高超低溫冷凍保存的措施由于植物細(xì)胞含水量比動(dòng)物細(xì)胞高，冰凍保存難度大，如果直接將保存材料放入液氮中，組織和細(xì)胞由于細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，引起組織和細(xì)胞死亡，因而，超低溫保存的植物材料必須借助于冷凍防護(hù)劑(cryoprotectant)。冷凍防護(hù)劑防護(hù)機(jī)理：在水溶液中能強(qiáng)烈地結(jié)合水分子，水合作用的結(jié)果使溶液的黏稠度增加。當(dāng)溫度下降時(shí)，溶液冰點(diǎn)下降，即冰的結(jié)晶中心增長(zhǎng)速度下降，使水的固化程度減弱。因而對(duì)于降低培養(yǎng)基冰點(diǎn)和植物組織、細(xì)胞冰點(diǎn)起重要作用。冷凍防護(hù)劑的使用提高了培養(yǎng)基滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞的輕微質(zhì)壁分離，相對(duì)提高了組織和細(xì)胞的抗寒力。常用的冷凍防護(hù)劑滲透型冷凍防護(hù)劑:多為小分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)的目的。包括二甲基亞砜（DMSO）（極易滲入細(xì)胞內(nèi)部，可防止細(xì)胞在冷凍和融冰時(shí)，引起過度脫水而遭受破壞）甘油甘露醇脯氨酸乙二醇丙二醇非滲透型冰凍保護(hù)劑:是聚合分子物質(zhì)，能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，從而起到保護(hù)作用。此類冰凍保護(hù)劑對(duì)快速、慢速冷卻均有保護(hù)效果。常見的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingyl

pyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羥乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)四、超低溫保存的方法超低溫保存的基本操作程序?yàn)椋哼x擇適宜年齡和生長(zhǎng)狀態(tài)的冷凍材料；對(duì)生物材料進(jìn)行預(yù)處理，提高分裂細(xì)胞的比例和減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，使材料達(dá)到最適生理狀態(tài)；將材料裝入試管或其他保存容器中，放入冰浴中；在冰浴條件下加入0℃預(yù)冷的冷凍保護(hù)劑，冰浴放置30～45min；采用不同的降溫冰凍方式進(jìn)行冷凍，直至最后放入液氮中，并在液氮中停留至少1h；保存后的化凍，一般采取在37～40℃溫水浴中快速化凍；材料化凍后的活力鑒定，進(jìn)行再培養(yǎng)，觀察恢復(fù)生長(zhǎng)的速度及植株的再生能力，分析凍后材料或再生植株的遺傳性狀。1.材料的選擇和預(yù)處理由于植物的基因型、抗凍性以及器官、組織和細(xì)胞的年齡、生理狀態(tài)等因素對(duì)超低溫保存的效果有較大的影響。一般來說，體積小、細(xì)胞質(zhì)稠密、無液泡、薄壁的小分生細(xì)胞的存活率高于含大量液泡的大細(xì)胞；莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)、愈傷組織等培養(yǎng)物，解凍后只有具有上述特征的細(xì)胞才能存活。而較大的植物材料，如莖尖、胚或試管苗等，由于高度液泡化的細(xì)胞易受損傷，冷凍后只有分生細(xì)胞能夠重新生長(zhǎng)。為了使保存材料達(dá)到超低溫保存所要求的生理特性，還要對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，總的原則是提高細(xì)胞分裂與分化的同步化，減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，增強(qiáng)細(xì)胞抗寒力。目前主要有3種預(yù)處理方式：（1）低溫鍛煉激活植物體內(nèi)抗寒機(jī)制（2）繼代培養(yǎng)增加有絲分裂細(xì)胞數(shù)目（3）預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中加冷凍保護(hù)劑或誘導(dǎo)抗寒力物質(zhì)2.冰凍方法降溫冰凍方法是影響超低溫保存效果的關(guān)鍵因素之一。（1）快速冰凍法將材料從0℃或預(yù)處理溫度直接投入液氮，其降溫速度在1000℃/min以上。這個(gè)過程可以使細(xì)胞內(nèi)的水分子還未來得及形成結(jié)晶中心就降到了-196℃的安全溫度，從而避免了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的危險(xiǎn)。此法適用于那些高度脫水的材料，如種子等。（2）慢速冰凍法采用逐步降溫的方法，以0.5～2℃/min的降溫速度，從0降到-30℃，-35或-40℃，隨即投入液氮，或者以此降溫速度連續(xù)降溫到-196℃。逐步降溫過程可以使細(xì)胞內(nèi)水分有充足的時(shí)間不斷流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)水分含量減少到最低限度，達(dá)到良好的脫水效果，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。這種方法適合于液泡化程度較高的植物材料，如懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等。（3）分步冰凍法此法將快速和慢速2種冰凍方法結(jié)合起來。首先用較慢的速度（0.5～4℃/min）使植物材料從0℃降至一定的預(yù)冷溫度（一般為-40℃）并停留一段時(shí)間（一般10min左右），使細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性脫水，然后再浸入液氮冷凍。（4）逐級(jí)冰凍法植物材料經(jīng)過冷凍保護(hù)劑0℃預(yù)處理后，逐級(jí)通過-10，-15，-25，-35，-40℃等，每個(gè)溫度停留10min左右，然后浸入液氮。（5）干燥冰凍法將樣品在含高濃度滲透性化合物（如甘油、糖類物質(zhì)等）培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間，或者經(jīng)硅膠、無菌空氣干燥脫水?dāng)?shù)小時(shí)，或者用褐藻酸鈣液泡包裹樣品，無菌風(fēng)進(jìn)一步干燥，然后直接投入液氮；或者用冷凍保護(hù)劑處理后吸除表面水分，密封于金箔中進(jìn)行慢凍。只要脫水足夠，細(xì)胞內(nèi)溶液濃度即可達(dá)到較高水平因而易進(jìn)入玻璃化狀態(tài)。這種方法對(duì)某些植物的愈傷組織、體細(xì)胞胚、胚軸、胚、花粉、莖尖及試管苗等較合適，但對(duì)大多數(shù)對(duì)脫水敏感的材料不適用。（6）脫水冰凍法將植物材料先用含有甘油和糖類的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行滲透脫水，再置于-20～-30℃的冷藏庫內(nèi)凍結(jié)脫水，然后立即投入液氮中迅速冷凍。（7）玻璃化法在投入液氮前，使用高濃度的冰凍保護(hù)劑，或稱之為玻璃化液，在25℃或4℃下處理一段時(shí)間（一般10～60min）。玻璃化法的主要程序?yàn)椋孩龠x擇適宜的材料；②材料的預(yù)培養(yǎng)；③裝載液處理；④在0℃或25℃下用玻璃化液（PVS2）脫水；⑤投入液氮保存；⑥保存后快速化凍；⑦去除玻璃化液；⑧材料的恢復(fù)培養(yǎng)。（8）包埋脫水法包埋脫水法是參照人工種子技術(shù)，結(jié)合低溫保存的需要，將包裹和脫水結(jié)合起來，應(yīng)用于超低溫保存中。包埋脫水法最早出現(xiàn)在法國(guó)學(xué)者保存馬鈴薯莖尖的研究中。（9）包埋玻璃化法為了克服玻璃化法和包埋脫水法的缺點(diǎn)，有人將兩者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，建立了包埋玻璃化法。需要指出的是，盡管各種冷凍方法各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，但目前為止還沒有一種方法普遍適用于所有的植物材料，所以必須根據(jù)不同材料來確定冷凍方法。

3.化凍和洗滌目前，多數(shù)研究采用快速化凍的方式，即將保存后的外植體材料在25～40℃的水浴中化凍1～2min，材料迅速通過冰晶生長(zhǎng)區(qū)（-60～-40℃)，從而避免了細(xì)胞再次結(jié)冰而造成的傷害。在一些研究中，采用室溫流動(dòng)空氣、自來水沖洗等進(jìn)行材料化凍也取得了較好的效果?；瘍龊蟮牟牧闲枇⒓催M(jìn)行洗滌，以除去材料組織中高濃度的冷凍保護(hù)劑，避免影響材料恢復(fù)和繼續(xù)生長(zhǎng)。最常用的洗滌方法是用含濃度為1.2mol/L蔗糖的基本培養(yǎng)基25℃下處理10min，也有用濃度為1.5～2.0mol/L的山梨醇的培養(yǎng)液進(jìn)行保護(hù)劑成分的洗滌。4.活性檢測(cè)和恢復(fù)培養(yǎng)凍后存活率的快速鑒定通常采用FAD熒光雙醋酸法、TTC(氯化三苯四氮唑)還原法、Evans(伊凡藍(lán))法等。這些方法均以細(xì)胞內(nèi)某些酶的活力檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)，不能完全表征細(xì)胞與組織的再生能力。因此凍存后材料的活力不能僅以此衡量。此外，染色法都要破壞材料來檢測(cè)。由此，出現(xiàn)了一種不破壞材料，通過檢測(cè)材料產(chǎn)生揮發(fā)性碳?xì)浠衔锶缫蚁?、乙烷等含量的方法。凍后再培養(yǎng)雖然費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，卻是檢驗(yàn)材料存活率的最可靠方法。通常將莖尖洗滌后，接種到恢復(fù)培養(yǎng)基7-15d后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)，1周統(tǒng)計(jì)存活率，1個(gè)月統(tǒng)計(jì)再生率?；謴?fù)培養(yǎng)時(shí)是否需要光照表現(xiàn)出物種差異。5.超低溫保存后的遺傳穩(wěn)定性種質(zhì)資源保存的最根本的目的是保持遺傳基因的穩(wěn)定，控制遺傳性狀不發(fā)生變化。因此超低溫凍存后材料的遺傳特性的檢測(cè)是十分必要的。Liuetal(2004)研究了超低溫保存后蘋果莖尖的形態(tài)學(xué)特征，并進(jìn)行了同工酶分析及RAPD和AFLP分析，發(fā)現(xiàn)凍存材料化凍后和對(duì)照材料具有相同的再生能力，在形態(tài)學(xué)上沒有差異，可溶性蛋白和POD酶也沒有差異。進(jìn)一步用RAPD和AFLP研究DNA水平的變化，也未發(fā)現(xiàn)兩者有DNA水平的差異。張玉進(jìn)等發(fā)現(xiàn)玻璃化法凍存后魔芋的遺傳特性未發(fā)生改變。其他的研究結(jié)果也表明超低溫保存后材料未發(fā)生染色體或DNA水平的變化，說明了超低溫保存在保持種質(zhì)資源遺傳穩(wěn)定性方面具有其他保存方法所不具有的優(yōu)越性。

五、影響超低溫保存效果的主要因素1.材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細(xì)胞的年齡以及生理狀態(tài)。不同基因型的植物離體材料對(duì)超低溫凍存的反應(yīng)各不相同。2.預(yù)培養(yǎng)和低溫鍛煉預(yù)處理對(duì)于調(diào)整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過預(yù)處理的植物材料，減少了細(xì)胞內(nèi)自由水的含量，使細(xì)胞能經(jīng)受低溫脅迫，減少或避免了冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。3.冰凍保護(hù)劑的應(yīng)用一般的生物體在沒有添加冰凍保護(hù)劑的情況下經(jīng)歷低溫后是很難存活下來的。所以，生物體的低溫保存離不開冰凍保護(hù)劑4.化凍方法液泡小、含水量少的細(xì)胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法。液泡大、含水量高的細(xì)胞則一般需要采用慢速化凍法。5.再培養(yǎng)經(jīng)凍存的材料會(huì)不可避免地受到不同程度的傷害。為了減少再培養(yǎng)中的光抑制，利于離體材料恢復(fù)生長(zhǎng)，凍存的材料一般在黑暗或弱光下培養(yǎng)1～2周，再轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)。再培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基一般是與保存前的相同，但有時(shí)需將大量元素或瓊脂含量減半，有時(shí)則在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生長(zhǎng)的恢復(fù)。六、植物種質(zhì)資源超低溫保存的展望建立在離體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上的超低溫保存技術(shù)，在種質(zhì)資源保存中獨(dú)具潛力與優(yōu)勢(shì)。超低溫保存的材料涉及原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、體細(xì)胞胚、花粉胚、花粉、花藥、種子、莖尖分生組織、芽、莖段，甚至植株幼苗等。同時(shí)，超低溫保存技術(shù)在瀕危植物資源的保存中發(fā)揮了巨大作用。植物種質(zhì)超低溫保存技術(shù)具有傳統(tǒng)