人類性染色質(zhì)小體的制備與觀察

人類性染色質(zhì)小體的制備與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼^察與鑒別X染色質(zhì)的簡(jiǎn)易方法，識(shí)別其形態(tài)特征及所在部位；鑒定個(gè)體的性別，為進(jìn)一步研究人類染色體畸變與疾病的關(guān)系提供基礎(chǔ)方法、為遺傳病臨床診斷提供參考。1、發(fā)現(xiàn)

1949年，Barr等人在雌貓的神經(jīng)元細(xì)胞核中首次發(fā)現(xiàn)一種染色較深的濃縮小體，而在雄貓則沒(méi)有這種結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其他雌性哺乳動(dòng)物（包括人類）也同樣有這種顯示性別差異的結(jié)構(gòu)。而且不僅是神經(jīng)元細(xì)胞，在其他細(xì)胞的間期核中也可以見(jiàn)到這一結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為這種小體是兩個(gè)X染色體中的一個(gè)在間期發(fā)生異固縮形成的，故而將其稱為X小體，X染色質(zhì)，Barr小體（巴氏小體）或性染色質(zhì)小體。Barr小體出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物雌性個(gè)體細(xì)胞的細(xì)胞核膜邊緣，這主要是因?yàn)檫@條染色體處在失活狀態(tài)所致，Morishima等利用放射性標(biāo)記的方法證實(shí)了失活狀態(tài)的性染色體與其他異染色質(zhì)（heterochromatin）一樣，在DNA復(fù)制時(shí)總落后于其他常染色質(zhì)，且大多出現(xiàn)在核膜邊緣。性染色質(zhì)的數(shù)目是X染色體數(shù)減1。故可以根據(jù)X小體的有無(wú)、數(shù)目來(lái)鑒定胎兒的性別和性別畸形。

二、實(shí)驗(yàn)原理表性染色體組成與X小體數(shù)目的關(guān)系性染色體組成性別X小體的數(shù)目XY男0XO女0XX女1XXY男1XXX女2XXXX女32、萊昂假說(shuō)為什么正常男女之間的X染色質(zhì)存在差異？女性兩個(gè)X染色體上的每個(gè)基因座的兩個(gè)等位基因所形成的產(chǎn)物，為什么不比只有一個(gè)X染色體半合子男性的相應(yīng)基因產(chǎn)物多？為什么某一X連鎖的突變基因純合子女性的病情并不比半合子的男性嚴(yán)重？20世紀(jì)60年代以來(lái)，不少學(xué)者曾提出了一些假說(shuō)來(lái)解釋這一現(xiàn)象。其中比較著名的假說(shuō)是由M．F．Lyon于1961年提出的Lyon假說(shuō)（Lyonhypothesis）：

1.）正常雌性哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞中，兩條X染色體中只有一條在遺傳上有活性，另一條在遺傳上無(wú)活性。

2.）X染色體的失活是隨機(jī)的。

3.）失活發(fā)生在胚胎發(fā)育早期，X染色體一經(jīng)失活，其后代細(xì)胞中該染色體均處于失活狀態(tài)。

4.）雜合體雌性在伴性基因的作用上是嵌合體。

3、劑量補(bǔ)償：細(xì)胞內(nèi)的X染色體數(shù)目超過(guò)兩條時(shí)，仍只有一條保持活性，其余的都形成異固縮的X染色質(zhì)。正常男性只有一條X染色體，所以X染色質(zhì)的數(shù)目為0。45，XO性腺發(fā)育不全的患者雖然是女性，但是因?yàn)橹挥幸粭lX染色體，所以細(xì)胞內(nèi)無(wú)X染色質(zhì)。一個(gè)細(xì)胞中所含的X染色質(zhì)的數(shù)目等于X染色體數(shù)目減一。劑量補(bǔ)償：由于雌性細(xì)胞中的兩個(gè)X染色體中的一個(gè)發(fā)生異固縮（也稱為L(zhǎng)yon化現(xiàn)象），失去活性，這樣保證了雌雄兩性細(xì)胞中都只有一條X染色體保持轉(zhuǎn)錄活性，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。這種效應(yīng)稱為X染色體的劑量補(bǔ)償。需要指出的是，失活的X染色體上基因并非都失去了活性，有一部分基因仍保持一定活性，因此X染色體數(shù)目異常的個(gè)體在表型上有別于正常個(gè)體，出現(xiàn)多種異常的臨床證狀。如47，XXY的個(gè)體不同于46，XY的個(gè)體；47，XXX的個(gè)體不同于46，XX的個(gè)體，而且X染色體越多時(shí)，表型的異常更嚴(yán)重。三、實(shí)驗(yàn)用品

1.材料口腔粘膜（男、女）、發(fā)根細(xì)胞（女）。2.器具顯微鏡、牙簽、染色缸、蓋玻片、載玻片、擦鏡紙、記號(hào)筆3.試劑固定液（95%酒精：冰醋酸=3：1，盛在染色缸中）、蒸餾水、

70%、95%酒精、無(wú)水酒精、45%醋酸、5mol/LHCl、二甲苯、香柏油、卡寶品紅染液。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1．獲取實(shí)驗(yàn)材料A.口腔黏膜細(xì)胞取一干凈的載玻片，用記號(hào)筆在即將涂細(xì)胞的一面作個(gè)標(biāo)記。先用水將口漱凈，盡可能除去口中的雜物。然后用牙簽鈍頭在口腔一側(cè)用力刮取，棄去第一次得到的刮取物，在同一部位繼續(xù)刮?。ㄟ@樣就可取得深層的表皮細(xì)胞），將刮得的細(xì)胞涂抹在干凈載玻片上，反復(fù)幾將從，使玻片上的材料盡量厚些。勿令玻片上的材料干燥，迅速將玻片插入裝固定液的染色缸中固定30分鐘以上。如果讓材料在空氣中干燥，會(huì)使細(xì)胞變形。拿剛涂抹的玻片直接插入固定液中，當(dāng)然會(huì)使許多材料丟失，但粘在玻片面性上的細(xì)胞足夠觀察之需。固定后將載玻片在空氣中晾干，這樣，細(xì)胞就可以緊貼在玻片的表面。B.毛囊細(xì)胞（Hairfolliclecell）拔取一根毛根比較大的毛發(fā)（頭發(fā)或其他部位，如手臂上的毛發(fā)均可；如可能，盡量選用白色或淺顏色的毛發(fā)，這樣在制片中就可減少色素的干擾）。在一張干凈的載玻片中央滴一滴45%的醋酸，將毛根浸漬其中。靜置約5分鐘，待毛根稍軟后用鑷子尖或解剖針尖將外層毛囊的組織細(xì)胞輕輕刮下（用力太大，則可能將毛發(fā)上的色素細(xì)胞一起刮下，影響制片效果）。棄去毛干。用解剖針將載玻片上的組織細(xì)胞均勻攤平。攤平的材料在空氣中晾干。2．染色1)．在晾干的玻片上直接滴上染料，染色10分鐘。2)．在95%的酒精中分色1-3分鐘。3)．在無(wú)水酒精中繼續(xù)分色兩次，每次1分鐘。4)．用二甲苯透明兩次，每次約3分鐘，直接加蓋玻片封片（或用樹(shù)膠封片）后觀察。3．觀察觀察X染色質(zhì)要用油鏡。人口腔X小體X小體：油鏡下可見(jiàn)X小體為一致密的濃染小體。輪廓清晰，約1um，常附著于核膜邊緣或靠邊內(nèi)側(cè)，其形態(tài)有三角形、卵形、扁平形等。正常女性間期細(xì)胞核中X小體比例約30%～50%，男性中則偶爾可見(jiàn)（2%），且不典型。注意事項(xiàng)

1．刮口腔上皮前要漱口；2．刮時(shí)用滅菌玻璃片的寬邊，勿用一角，以免劃破口腔；3．第一次刮下的脫落細(xì)胞用酒精棉球擦去，在原位重復(fù)刮一下制片；4．盛放酒精棉球的小廣口瓶，瓶蓋用完即時(shí)蓋好；五.結(jié)果與分析在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)到X染色質(zhì)為一結(jié)構(gòu)致密、輪廓清楚染色較深的小體。人類的X染色質(zhì)常附著于核膜內(nèi)側(cè)，這個(gè)位置就是晚復(fù)制的X染色體所處的位置（Morishima,1962）。大小約在1μm左右，呈三角形、卵形、短棒形或者雙球形。一般說(shuō)來(lái)，在動(dòng)物細(xì)胞中，X染色質(zhì)可以處于三個(gè)位置：靠近核仁，靠近核膜，或者自由地處于核區(qū)內(nèi)。這種位置，對(duì)于每一種來(lái)說(shuō)是相對(duì)固定的。處于核膜內(nèi)側(cè)的X染色質(zhì)在壓片時(shí)完全可能被壓在核的中央。這種情形下，X染色質(zhì)容易與核中其他的著色的結(jié)構(gòu)相混。為保險(xiǎn)計(jì)，我們通常只計(jì)數(shù)接近于核膜的小體。還應(yīng)注意一個(gè)問(wèn)題，并非在所有的正常女性細(xì)胞中都能看到巴氏小體，用正常女性的組織制片，統(tǒng)計(jì)200-400個(gè)沒(méi)有破損、形態(tài)正常的細(xì)胞，可觀察到具巴氏小體的細(xì)胞比率約在30%-50%。但這一比率在不同實(shí)驗(yàn)之間差異較大。

1．分別觀察男女各50個(gè)可數(shù)細(xì)胞，計(jì)算顯示X染色質(zhì)所占百分比。2．觀察中選繪4-5個(gè)典型細(xì)胞，示明X染色質(zhì)體的形成和部位。1．X小體的觀察

取材:受檢查者用水漱口數(shù)次，盡可能除去細(xì)菌和食物殘?jiān)?；用潔凈的牙簽從口腔兩?cè)頰部刮取粘膜，第一次刮取物棄去，將第二次、第三次刮取物涂在干凈的載玻片上。固定:滴加固定液（95%乙醇:乙醚=1:1或直接用乙醇）固定20～30min，空氣干燥。染色制片:滴加1～2滴改良品紅于室溫下染色10～20min（勿使干燥），加上蓋片，墊上濾紙用手指輕輕加壓即可。鏡檢：低倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)核膜完整，細(xì)胞不重疊，無(wú)核固縮的細(xì)胞；并在高倍或油鏡下觀察。若使用女性發(fā)根細(xì)胞，需選用帶有毛囊的頭發(fā)（約2cm長(zhǎng)），再加一滴染液后加上蓋玻片，灑精燈上微熱，靜置5min，后蓋一濾紙壓片。

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．Y小體：熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核中有發(fā)亮的熒光小體，直徑0.3～0.5um，正常情況下Y小體的出現(xiàn)率為25～50%，正常女性無(wú)，性異常者，如核型為47，XYY的個(gè)體，可見(jiàn)兩個(gè)Y小體。

七、作業(yè)及思考題1.統(tǒng)計(jì)X小體的頻率，畫(huà)2～3個(gè)典型細(xì)胞，示X小體的形態(tài)和所處部位。2.計(jì)算出現(xiàn)Y小體的細(xì)胞頻率。3.什么是劑量補(bǔ)償效應(yīng)？4.Barr小體分析技術(shù)在人類遺傳學(xué)工作中有什么用途？5.在制片過(guò)程中使用HCl酸解的目的是什么？6.為什么Barr小體一般出現(xiàn)在核膜邊緣？

四、實(shí)驗(yàn)步驟1.口腔頰部粘膜細(xì)胞巴氏小體觀察刮取頰部粘膜上皮細(xì)胞（用滅菌玻璃片）→涂片（兩片45°角）→60%冰醋酸固定5分鐘→吸去冰醋酸，用改良苯酚品紅染色1-2分鐘→壓片→鏡檢。2.發(fā)根細(xì)胞巴氏小體觀察拔取帶毛囊頭發(fā)一段→45%冰醋酸解離5分鐘→剝?nèi)∶摇旧?-3分鐘→壓片。3.觀察在女性間期細(xì)胞核內(nèi)側(cè)靠近核膜處有約1微米大小的反光極強(qiáng)的顆粒狀亮點(diǎn)，即為巴氏小體。材料不同，觀察結(jié)果可能有不同，且必須和核仁區(qū)別開(kāi)來(lái)（核仁往往離核膜較遠(yuǎn)或接近核中央部位）。五、作業(yè)1．分別觀察男女各50個(gè)可數(shù)細(xì)胞，計(jì)算顯示X染色質(zhì)所占百分比。2．觀察中選繪4-5個(gè)典型細(xì)胞，示明X染色質(zhì)體的形成和部位。正常女性口腔粘膜細(xì)胞中約30-50%有一個(gè)巴氏小體，男性則低于1-2%。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)X染色質(zhì)的標(biāo)本制作。觀察X染色質(zhì)、形態(tài)特點(diǎn)。了解人類染色體G顯帶技術(shù)方法二、實(shí)驗(yàn)原理在間期，女性體細(xì)胞中兩條X染色體中的一條異染色質(zhì)化。用Giemsa染色法可使其著色，本方法的優(yōu)點(diǎn)是只有細(xì)胞核清晰著色，胞漿不著色，因此細(xì)胞核背景清晰，利于對(duì)位于核膜邊緣的X染色質(zhì)的辨認(rèn)。Giemsa染料是由噻嗪和曙紅組成的，著色時(shí)DNA先與2個(gè)噻嗪分子結(jié)合，然后再與一個(gè)曙紅分子結(jié)合，形成沉淀物，而DNA的某些部位對(duì)染料不敏感，由此形成明暗相間的條帶。G顯帶的方法很多，最常用的是將已固定的染色體制片進(jìn)行預(yù)處理，再用Giemsa染色。預(yù)處理的方法非常多，可用熱、堿、各種蛋白酶、尿素等，其中最常用的是胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理。方法簡(jiǎn)便，周期短。G顯帶區(qū)的DNA有較豐富的A-T對(duì)，有相當(dāng)一部分中度重復(fù)序列DNA可能在G帶區(qū)，Giemsa染料在G帶區(qū)的結(jié)合與其相應(yīng)的DNA和非組蛋白有關(guān)。

三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1,制備：G-帶胰酶消化法外周血培養(yǎng)常規(guī)法制作染色體標(biāo)本，置60℃烘箱烘8h～10h，或80℃烘3h，然后置37℃烘箱烘3d左右即可予處理。置0.02%胰蛋白酶溶液入染色缸，加入0.4%酚紅2滴，并以3%三羥甲基氨基甲烷液調(diào)節(jié)pH為6.4～6.6，37℃水浴。將烤三天的玻片從37℃烘箱取出，投入0.02%胰蛋白酶溶液中，并不斷擺動(dòng)，2.5min左右。取出自來(lái)水沖洗。染色：Giemsa染液（