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文檔簡介
實驗三:PCR擴增檢測乙肝病毒精選ppt
乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎,我國發(fā)病率很高,HBV的檢測極其重要。HBVDNA存在就可以引起乙肝的傳染,乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分,是病毒復制的發(fā)動機。精選pptPCR技術可以檢測出極微量的病毒,是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術已成為公認的對病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預防研究工作最理想的方法之一。精選ppt一、實驗目的1.掌握PCR技術擴增的原理2.熟悉PCR擴增檢測乙肝病毒的基本操作過程。精選ppt二、實驗原理聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR,是在體外條件下利用DNA聚合酶、催化一對引物間的特異性DNA片段合成的基因體外擴增技術,它包括三個基本過程:精選ppt1.變性:加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?.退火:急速降溫使引物和互補模板在局部形成雜交鏈3.延伸:耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應精選ppt模板DNA高溫變性低溫退火引物適溫延伸經(jīng)過25-35次循環(huán)后,目的片段擴增2n倍兩條子代DNA一次循環(huán)Tap酶5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’精選ppt三、主要器材及試劑1.主要器材:9700型PCR儀電泳槽、電泳儀精選ppt
紫外分析儀臺式高速離心機精選ppt2.主要試劑:HBV-PCR定性檢測試劑盒PCR反應管HBV陽性標本DNA提取液精選ppt四、操作步驟1.標本處理:取患者血清40μl,加入DNA提取液40μl,沸水浴10分鐘,10000轉離心5分鐘,取上清液4μl做PCR反應。精選ppt2.加樣:加入提取好的標本4μl,6000轉離心10秒。取試劑盒中PCR反應管
TapDNA聚合酶10×擴增緩沖液
4種dNTP混合物引物(小分子DNA片段)
Mg2+精選ppt三個擴增步驟溫度及時間溫度時間變性93℃45″(首次5′)退火55℃45″延伸72℃60″(末次5′)循環(huán)次數(shù):25次3.PCR儀上擴增:精選pptPCR儀上擴增加入標本離心6000轉離心10秒精選ppt4.電泳檢測:①制備2%瓊脂糖凝膠
2%瓊脂糖的制備:電泳槽的準備:稱取0.8g瓊脂糖40mlTBE電泳緩沖液(PH8.0)煮沸溶解加入冷卻60℃左右加入溴乙啶EB20μl倒膠精選ppt``②加樣:取擴增后的產(chǎn)物10ul點樣于凝膠孔取樣點樣精選ppt③電泳:點樣端接“-”,穩(wěn)壓,50V,電泳30分鐘。五、結果觀察:紫外分析儀下觀察,出現(xiàn)橙黃色條帶則為HBV陽性HBV陽性HBV陰性HBV陽性對照HBV陰性對照正極負極點樣孔精選ppt五、注意事項1.試劑盒內陽性標本及DNA提取液使用前需充分融化離心。2.反應液的表面為固體封蓋劑
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