體液免疫球蛋白測定備課講稿

第十六章體液(tǐyè)免疫球蛋白測定P188湖南省中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫(miǎnyì)教研室李志芳第一頁，共32頁。抗體（antibody,Ab)：是B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合(jiéhé)球蛋白。(生物學(xué)功能上的概念)抗體主要存在于血清等體液中，故將抗體介導(dǎo)的免疫稱為體液免疫。幾個(gè)(jǐɡè)概念第二頁，共32頁。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）：具有(jùyǒu)抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。（化學(xué)結(jié)構(gòu)上的概念）Ab與Ig的聯(lián)系(liánxì)1.所有的Ab都是Ig2.Ig并非都是Ab分泌型（secretedIg，sIg）：存在于血清(xuèqīng)等體液中，如Ab膜型（membraneIg，mIg）是B細(xì)胞上的抗原受體。第三頁，共32頁。

Ig的基本結(jié)構(gòu)：

四肽鏈結(jié)構(gòu),所有Ig的基本單位都是四條肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)。兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）。每條重鏈和輕鏈分為(fēnwéi)氨基端和羧基端。第四頁，共32頁。免疫球蛋白分類(fēnlèi)及特性重鏈性質(zhì)，Ig分5類：IgG(γ)、IgA(α)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)輕鏈性質(zhì)，Ig分2型：κ、λIg占血漿蛋白總量：20%Ig含量(hánliàng)：血清IgG、IgA、IgM：g/L、IgD、IgE：mg/L體液IgG、IgA、IgM：mg/L檢測意義：反應(yīng)機(jī)體的免疫功能、診斷疾病第五頁，共32頁。五類免疫(miǎnyì)球蛋白的特點(diǎn)和功能第六頁，共32頁。第一節(jié)體液(tǐyè)中IgG、IgA、IgM測定的臨床應(yīng)用體液免疫球蛋白測定主要指對人體的血液、尿液、腦脊液等樣本中的IgG、IgA、IgM定量檢測，由于免疫球蛋白IgG、IgA、IgM在人體體液中含量(hánliàng)相對較高，測定快速，臨床意義明確，臨床應(yīng)用較廣泛第七頁，共32頁。IgG是血清中含量最高(占80%)的免疫球蛋白，是血液(xuèyè)和細(xì)胞外液中的主要抗體，也是機(jī)體再次免疫的主要抗體。IgA分為血清型A1和分泌型A2，是參與黏膜局部免疫的主要抗體，主要存在于胃腸道和支氣管分泌液、初乳、唾液和淚液中。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，是個(gè)體發(fā)育過程中最早合成和分泌的抗體，也是抗原刺激誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體。測定方法

單向環(huán)狀免疫(miǎnyì)擴(kuò)散法(耗時(shí)、重復(fù)性差)

免疫(miǎnyì)濁度法（速率散射比濁）常用第八頁，共32頁。年齡：血液Ig隨年齡、性別、血型、種族及測定方法不同有所差別，各實(shí)驗(yàn)室要建立自己(zìjǐ)的參考范圍一、血液免疫(miǎnyì)球蛋白測定的臨床意義高Ig血癥多克隆Ig增高（感染）單克隆Ig增高（免疫增殖?。┑虸g血癥:先天性低Ig血癥（免疫缺陷?。┇@得性低Ig血癥(蛋白(dànbái)丟失、淋巴系統(tǒng)腫瘤、使用免疫抑制劑)第九頁，共32頁。正常人尿液中的Ig含量甚微，當(dāng)機(jī)體的免疫功能(gōngnéng)異?；蜓装Y反應(yīng)引起腎臟疾病時(shí)，可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜分子屏障破壞或電荷屏障受損，從而引起球蛋白及其他大分子蛋白質(zhì)漏出增多。二、尿液免疫(miǎnyì)球蛋白測定的臨床意義判斷腎小球?yàn)V膜受損程度：選擇性蛋白尿指數(shù)SPI可根據(jù)尿內(nèi)Ig增高的類型幫助鑒別診斷腎小球疾病的種類(zhǒnglèi)尿中游離輕鏈的檢測對診斷輕鏈病和MM有重要意義第十頁，共32頁。三、腦脊液免疫(miǎnyì)球蛋白測定的臨床意義生理情況下，Ig根據(jù)其分子量大小，通過血腦屏障的難易度不同，IgG、IgA、IgM在腦脊液中的濃度遞減。病理(bìnglǐ)狀態(tài)時(shí)，血腦屏障通透性增加，腦脊液組分發(fā)生改變。血腦屏障受損程度：白蛋白商值、CSF-IgG指數(shù)增高有臨床意義：多發(fā)性硬化癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(xìtǒng)感染第十一頁，共32頁。第二節(jié)血液IgD和IgE的測定及臨床(línchuánɡ)應(yīng)用正常人血液中IgD含量很低（0.2%），目前生物學(xué)功能尚不清楚IgE是正常人血清中含量最少的免疫球蛋白，主要由黏膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞分泌，為親細(xì)胞抗體，引起(yǐnqǐ)I型超敏反應(yīng)；與機(jī)體抗寄生蟲免疫也可能有關(guān)。第十二頁，共32頁。一、IgD的測定(cèdìng)及臨床意義測定方法：放免、免疫比濁、ELISA(常用)臨床意義：血液中含量波動范圍大，各實(shí)驗(yàn)室最好(zuìhǎo)使用固定的試劑盒，建立自己的參考范圍第十三頁，共32頁。二、IgE的測定(cèdìng)及臨床意義測定(cèdìng)方法：總IgE測定(cèdìng)：放射免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法(常用)免疫比濁法酶聯(lián)免疫吸附法(常用)特異性IgE測定(cèdìng)：免疫斑點(diǎn)法酶聯(lián)免疫吸附法臨床意義：增高：變態(tài)反應(yīng)性疾病、寄生蟲感染、病毒感染、自身免疫性疾病。降低：意義不大第十四頁，共32頁。第三節(jié)血清(xuèqīng)IgG亞類測定及臨床意義Ig亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，其含量依次下降測定方法：單向(dānxiànɡ)免疫擴(kuò)散法免疫比濁法（常用）放射免疫分析法酶聯(lián)免疫吸附法（常用）臨床意義：IgG亞類可能和感染復(fù)發(fā)、免疫缺陷和自身免疫性疾病有關(guān)，因而測定IgG亞類對上述疾病有重要意義。即使當(dāng)總IgG水平在正常范圍內(nèi)，IgG的亞類分配也可能發(fā)生紊亂第十五頁，共32頁。第四節(jié)M蛋白(dànbái)測定及臨床意義M蛋白：B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞單克隆異常(yìcháng)增殖產(chǎn)生的一種在氨基酸組成及順序上十分均一的異常(yìcháng)單克隆免疫球蛋白臨床上多見于多發(fā)性骨髓瘤、高丙種球蛋白血癥、惡性淋巴瘤、重鏈病、輕鏈病等第十六頁，共32頁。M蛋白(dànbái)測定蛋白區(qū)帶電泳：經(jīng)典(jīngdiǎn)方法計(jì)算蛋白含量和百分比免疫比濁法：免疫球蛋白定量準(zhǔn)確性高、快速免疫電泳：M蛋白分型免疫固定電泳：M蛋白分型及鑒定，分辨率高(最常用)各方法(fāngfǎ)視具體情況合理選用第十七頁，共32頁。蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳是血清蛋白的經(jīng)典分析方法，血清（或尿液）標(biāo)本中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)由于其等電點(diǎn)，分子量和分子形狀各不相同，其電泳速度就不同，可明顯分開形成(xíngchéng)不同的區(qū)帶，與正常的電泳圖譜進(jìn)行比較，很容易發(fā)現(xiàn)患者電泳圖譜中不一樣的狹窄而濃縮的集中帶，即M區(qū)帶。這是由于M蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度均一，因而其電泳遷移率十分一致。如果將這些區(qū)帶電泳圖譜掃描，還可計(jì)算出異常蛋白的含量和百分比。這種M區(qū)帶較多見于γ或β區(qū)，偶亦可見于α區(qū)。該法方便，是篩選M蛋白的最基本方法。但是區(qū)帶電泳不能判定免疫球蛋白的類型，最終還需用特異性抗體進(jìn)行鑒定。一、血清蛋白區(qū)帶電泳(diànyǒnɡ)第十八頁，共32頁。gba2白蛋白a1:a1酸性糖蛋白,

a1抗胰蛋白酶:結(jié)合珠蛋白,

a2

巨球蛋白,

a脂蛋白,

銅藍(lán)蛋白:轉(zhuǎn)鐵蛋白,血液結(jié)合素,C3補(bǔ)體,b脂蛋白:免疫球蛋白血清蛋白電泳(diànyǒnɡ)第十九頁，共32頁。正常(zhèngcháng)的電泳圖譜第二十頁，共32頁。出現(xiàn)(chūxiàn)在β區(qū)域的單克隆免疫球蛋白第二十一頁，共32頁。

出現(xiàn)在γ區(qū)域(qūyù)單克隆免疫球蛋白第二十二頁，共32頁。二、血清免疫(miǎnyì)球蛋白定量測定血清免疫球蛋白定量測定也可作為檢測M蛋白的初篩試驗(yàn)。免疫球蛋白定量測定較常用的方法有單向擴(kuò)散法與免疫濁度法，前者較為簡便，后者更為準(zhǔn)確迅速免疫球蛋白定量檢測，有助于丙種球蛋白病的診斷，并對丙種球蛋白病的良、惡性鑒別有幫助。惡性單克隆丙種球蛋白病常呈現(xiàn)某一類丙種球蛋白的顯著(xiǎnzhù)增高，大多在30g/l以上；在良性丙種球蛋白病的血清標(biāo)本中，M蛋白多在20g/l以下第二十三頁，共32頁。三、免疫電泳（常規(guī)(chángguī)方法）疑為丙種球蛋白(dànbái)病的患者，經(jīng)血清蛋白(dànbái)區(qū)帶電泳和免疫球蛋白(dànbái)測定，已基本證實(shí)是否有免疫球蛋白(dànbái)的異常增高和其含量的多少，但是增高的M蛋白(dànbái)究竟是哪一類免疫球蛋白(dànbái)，仍需進(jìn)一步分類鑒定，常應(yīng)用各種類型的特異性抗血清，做不同形式的電泳或免疫擴(kuò)散。免疫電泳是將區(qū)帶電泳和免疫擴(kuò)散結(jié)合起來的一種免疫學(xué)分析法。一般多用抗IgG、IgM、IgA、κ和λ輕鏈等5種抗血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用抗正常人血清作為對照。M蛋白(dànbái)與相應(yīng)抗體發(fā)生反應(yīng)所出現(xiàn)的沉淀弧較為特殊，較普通沉淀弧寬，凸出呈弓形，不難辨認(rèn)第二十四頁，共32頁。+-免疫電泳示意圖第二十五頁，共32頁。四、免疫固定電泳(diànyǒnɡ)（最常用）區(qū)帶電泳+沉淀反應(yīng)：將待測血清或其他標(biāo)本在瓊脂平板上作區(qū)帶電泳，分離后于其上覆蓋含抗κ或λ輕鏈或各類重鏈的抗血清濾紙，當(dāng)抗體(kàngtǐ)與某區(qū)帶中的單克隆免疫球蛋白結(jié)合后，便形成復(fù)合物而沉淀下來，再通過漂洗與染色，呈現(xiàn)濃而狹窄的著色區(qū)帶，即可判斷單克隆丙種球蛋白的輕鏈和重鏈型別結(jié)合蛋白質(zhì)電泳的高分辨率和抗原抗體(kàngtǐ)反應(yīng)的特異性測定時(shí)間短(1.5-2h)、敏感性高（0.5-1.5g/l）、結(jié)果直觀易于分析判斷第二十六頁，共32頁。左圖為IgGκ型,中圖為IgGλ型，右為正常(zhèngcháng)SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ免疫固定電泳(diànyǒnɡ)示意圖第二十七頁，共32頁。五、本-周蛋白(dànbái)的檢測本周蛋白即尿中游離的免疫球蛋白輕鏈，其檢測對輕鏈病的診斷是必不可少的項(xiàng)目，并對多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白病、重鏈病等疾病的診斷、鑒別和預(yù)后判斷均有一定幫助加熱沉淀法:本周蛋白在pH5.0的條件下，加熱至50℃～60℃時(shí)出現(xiàn)沉淀，繼續(xù)加熱至90℃后又重新溶解。根據(jù)這種理化性質(zhì)，又將其稱為凝溶蛋白，故可根據(jù)這一特點(diǎn)，用化學(xué)方法進(jìn)行檢測。這種方法簡便易行，但敏感度較低，也不能確定輕鏈的型別免疫電泳分析法：尿標(biāo)本用抗κ和λ型輕鏈抗血清進(jìn)行免疫電泳分析，游離輕鏈往往與其中(qízhōng)一型的抗血清起反應(yīng)，在β-γ區(qū)附近形成一條致密的弓形沉淀弧。第二十八頁，共32頁。六、κ-Ig和λ-Ig定量(dìngliàng)測定樣本：尿液、血液方法：單向免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法（常用，準(zhǔn)確、快速）應(yīng)用(yìngyòng)：M蛋白血癥的分型及鑒定多數(shù)實(shí)驗(yàn)室確立的κ/λ比率正常范圍在1.2-2.4，通過κ/λ比率測定有助于判斷疾病類型和監(jiān)測治療效果第二十九頁，共32頁。冷球蛋白是血清中的一種特殊蛋白質(zhì)，在4℃時(shí)自發(fā)沉淀，在37℃時(shí)又可溶解，常利用這種可逆性冷沉淀的特性對其進(jìn)行測定。取患者外周血，分離出血清置4℃冰箱中，一般在24～72h出現(xiàn)沉淀，若1周仍不出現(xiàn)沉淀者方可判斷為陰性(