高效液相色譜-02

第七章

高效液相色譜分析法一、液-固吸附色譜liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色譜liquid-liquidpartitionchromatograph三、離子交換色譜ion-exchange

chromatograph四、離子色譜ionchromatograph五、離子對(duì)色譜ion-pairchromatograph六、排阻色譜size-exclusionchromatograph七、親和色譜(AC)Affinity

chromatograph第二節(jié)

主要分離類型與原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2023/1/147.1HPLC的分類與基本原理7.1.1高效液相色譜法的分類化合物的極性、電荷、分子大小、旋光性四種主要的性質(zhì)可以用來(lái)產(chǎn)生高效液相色譜分離。2023/1/14按固定相分類按分離機(jī)理分類液液色譜法LLC液固色譜法LSC分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學(xué)鍵合色譜法親合色譜法膠束色譜法HPLC

7.1高效液相色譜法的分類2023/1/14詳細(xì)分類圖1液－固吸附色譜法LSC

2液－液分配色譜法LLC3化學(xué)鍵合色譜法BPC4離子交換色譜法IEC5空間排阻色譜法SEC6親合色譜法AC7膠束色譜法MC8手性色譜法CC9毛細(xì)管電泳色譜法CE正相～NLLC反相～RLLC正相～NBPC反相～RBPC一般～I(xiàn)EC離子色譜法IC氨基酸色譜法AA凝膠滲透色譜法GPC凝膠過(guò)濾色譜法GFC開(kāi)管～OTCEC填充～PCEC一般～RBPC離子對(duì)色譜法PIC離子抑制色譜法ISC膠束～

MEKC壁處理～

CEC鍵合相～

CEC毛細(xì)管凝膠～

CGEHPLC2023/1/147.3各類高效液相色譜法>>

7.3.1吸附色譜法LSC1.分離機(jī)理吸附色譜法是被分離的組分分子(溶質(zhì)分子)與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心，因溶質(zhì)分子的吸附系數(shù)的差別而分離。2.影響容量因子(k)的因素以硅膠吸附劑為例：⑴硅膠與溶質(zhì)分子的親和力順序：k大者后出峰。kmin→飽和烴＜芳烴＜…＜酯醛酮＜…＜羧酸→kmax⑵溶質(zhì)的極性：常用流動(dòng)相是以烷烴為底劑，加入適當(dāng)?shù)臉O性溶劑組成二元或多元溶劑系統(tǒng)，從而能調(diào)整溶解的極性，控制組分的保留時(shí)間。溶劑系統(tǒng)的極性越大，洗脫力越強(qiáng)。2023/1/14液-固吸附色譜

liquid-solidadsorptionchromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2023/1/147.3各類高效液相色譜法>>

7.3.2分配色譜法(LLC)1.分離機(jī)理：分配色譜法是由于樣品組分溶入固定相(s)與流動(dòng)相(m)達(dá)到“平衡”后的分配系數(shù)的差別而分離。組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度差別越大(K、k差別也大)分離效果越好。2.正相液－液色譜法(NLLC)：流動(dòng)相極性小于固定相極性的LLC稱為NLLC。正相洗脫時(shí)樣品中極性小的組分先流出色譜柱，極性大的組分后流出色譜柱.3.反相液－液色譜法(RLLC)：流動(dòng)相極性大于固定相極性的LLC稱為RLLC。反相洗脫時(shí)樣品中極性大的組分先流出色譜柱，極性小的組分后流出色譜柱.2023/1/14液-液分配色譜

liquid-liquidpartitionchromatography固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2023/1/147.3.3離子交換色譜

ion-exchangechromatography

固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；

流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/1/147.3.4離子色譜

ionchromatography

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹(shù)脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。

2023/1/147.3.5排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2023/1/147.3.6親和色譜(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2023/1/147.3.7化學(xué)鍵合色譜法化學(xué)鍵合相：將具有官能團(tuán)的固定相鍵合到載體表面，構(gòu)成化學(xué)鍵合相?；瘜W(xué)鍵合色譜法：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合色譜法(bondphasechromtography)。特點(diǎn)：既有分配作用，又有吸附性能。硅膠表面十八烷基硅烷鍵合相ODS2023/1/14反相鍵合相色譜法，RBPC正相鍵合色譜法，NBPC離子對(duì)色譜法，IPCor.PIC

離子抑制色譜法，ISC其他色譜法

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法

2023/1/14反相鍵合相色譜法RBPC典型的反相鍵合色譜法(RBPC)，是用非極性的鍵合固定相和極性流動(dòng)相組成的色譜體系。固定相常用十八烷基硅烷鍵合相(ODS或C18)；流動(dòng)相常用甲醇－水、乙腈－水。非典型反相鍵合色譜系統(tǒng)，用弱極性或中等極性鍵合相與極性大于固定相的流動(dòng)相組成。

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>1.反相鍵合相色譜法

2023/1/14

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>1.反相鍵合相色譜法⑴分離機(jī)理反相鍵合相表面具有非極性烷基官能團(tuán)和未被取代的硅醇級(jí)，分離機(jī)理較復(fù)雜，有疏溶劑理論、雙保留機(jī)理、頂替吸附－液相相互作用模型等。疏溶劑理論：把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，它有較強(qiáng)的疏水特性。如圖10-4所示。圖10-4疏水劑締合示意圖2023/1/14

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>1.反相鍵合相色譜法當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；另方面被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開(kāi)固定相，并減小其保留作用。結(jié)果兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。圖20-4疏水劑締合示意圖2023/1/14

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>1.反相鍵合相色譜法

⑵流動(dòng)相的極性與容量因子的關(guān)系流動(dòng)相極性增大，洗脫能力降低，溶質(zhì)的k增大，tR增大；反之，k減小，tR也減小。作反相洗脫時(shí)，對(duì)于結(jié)構(gòu)相近的組分，極性大的組分先出峰。2023/1/14正相鍵合色譜法(NBPC)：固定相一般以氰基或氨基等極性基團(tuán)作為鍵合相；流動(dòng)相以烷烴(正己烷)中加入適量的極性調(diào)整劑(如氯仿、甲醇、乙腈等)為流動(dòng)相。用途主要用于分離極性不同的化合物、異構(gòu)體，特別適用于分離不同類型的化合物。⑴分離機(jī)理主要靠組分分子與固定相之間的范德華力、氫鍵作用力的差別而進(jìn)行分離。⑵流動(dòng)相的極性與容量因子的關(guān)系作正相洗脫時(shí)，流動(dòng)相的極性增大，洗脫能力增加，k減小，tR減小；反之，k與tR增大。分離結(jié)構(gòu)相近的組分時(shí)，極性大的組分后出峰。7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>2.正相鍵合色譜法2023/1/14

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>3.離子對(duì)色譜法⑵分離機(jī)理

以RPIC分離堿類物質(zhì)為例，用離子對(duì)模式說(shuō)明分離機(jī)理⑶分配系數(shù)⑷主要用途有機(jī)酸堿鹽的分離，避免流動(dòng)相(酸堿)對(duì)泵和流路的腐蝕；藥物分析，如生物堿、有機(jī)酸、磺胺類藥物、某些抗生素和維生素，體內(nèi)藥物分析等。缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴。固定相流動(dòng)相2023/1/14在反相色譜法中，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。⑴適用范圍適用于3.0≤pKa≤7.0弱酸；7.0≤pKa≤8.0弱堿。⑵抑制劑流動(dòng)相中加入少量的弱酸、弱堿或緩沖溶液為抑制劑(常用乙酸、氨水、磷酸鹽、乙酸鹽)。

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>4.離子抑制色譜法2023/1/14⑶影響容量因子的因素對(duì)于弱酸，當(dāng)流動(dòng)相pH＜pKa時(shí)，組分以分子形式為主，k值增大，tR增大；反之，組分以離子形式為主，k值變小，tR減小。對(duì)于弱堿，以上兩種情況正好相反。⑷用途可用于有機(jī)弱酸、弱堿與兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時(shí)的分離。不適用于pKa＜3的酸、pKa＞8的堿，這些可采用離子對(duì)色譜法、離子交換色譜法進(jìn)行分離。

7.3.7化學(xué)鍵合色譜法>>4.離子抑制色譜法2023/1/14

7.3.8其他色譜法(閱讀)手性色譜法環(huán)糊精色譜法膠束色譜法親和色譜2023/1/14概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀(jì)60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線檢測(cè)器，從而發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)。隨著科學(xué)和技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為重要、廣泛的分離分析手段.特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)化。7.4對(duì)比>>

2023/1/14

HLPC與經(jīng)典液相色譜和氣相的比較4.23高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜比較2023/1/14高效液相色譜與氣相色譜比較2023/1/14HPLC與經(jīng)典LC和GC在基本原理、概念和方法基本上相同，主要差別是流動(dòng)相的性質(zhì)不同。因此，某些公式的表現(xiàn)形式或參數(shù)的含意有些差別。1.VanDeemter方程式2023/1/141.VanDeemter方程式⑴VanDeemter方程在氣相色譜中的表現(xiàn)形式⑵VanDeemter方程在HPLC的表現(xiàn)形式：H=A+Cu流動(dòng)相為液體，組分的縱向擴(kuò)散系數(shù)B很小，流速u較高，故縱向擴(kuò)散相B/u可以忽略?？梢越频卣J(rèn)為H與u成線性關(guān)系，A為截距，C為斜率。2023/1/141.VanDeemter方程式⑶由H=A+Cu，討論A項(xiàng)與C項(xiàng)對(duì)HPLC柱效的影響

渦流擴(kuò)散項(xiàng)：A＝2λdp，可以通過(guò)①降低固定相粒徑dp、②降低不規(guī)則因子λ，使A變小柱效提高。故HPLC的塔板理論高度H主要由渦流擴(kuò)散項(xiàng)、流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)構(gòu)成。2023/1/141.VanDeemter方程式⑷應(yīng)用范氏方程選擇HPLC的分離條件①采用粒徑小而均勻的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相。②采用低黏度流動(dòng)相，低流量(1mL/min)，首選甲醇。③采用柱溫箱，避免室溫波動(dòng)，增加實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，柱溫以25～30℃為宜。2023/1/147.5.1定性分析方法7.5.2定量分析方法7.5.定性、定量分析方法2023/1/141色譜鑒定保留值對(duì)比鑒定2化學(xué)鑒定分離制備后鑒定3色譜－光譜聯(lián)用鑒定7.5定性、定量分析方法>>

7.5.1定性分析方法2023/1/14工作曲線法外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)二點(diǎn)法采用對(duì)照品外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法采用內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)對(duì)比法校正因子法工作曲線法7.5定性、定量分析方法>>

7.5.2定量分析方法2023/1/14(1)內(nèi)標(biāo)對(duì)比法不需校正因子。藥物分析常用示量％表示

(ms)樣品—樣品溶液中內(nèi)標(biāo)物的含量；(ms)對(duì)照—對(duì)照品溶液中內(nèi)標(biāo)物的含量；w—平均片重(或丸重)；m—取樣量；(Ai/As)樣品—樣品溶液中，待測(cè)物A/內(nèi)標(biāo)物A；(Ai/As)對(duì)照—對(duì)照品溶液中，待測(cè)物A/內(nèi)標(biāo)物A。7.5定性、定量分析方法>>

7.5.2定量分析方法2023/1/14例10-3用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定復(fù)方乙酰水楊酸片(APC)中阿司匹林A、非那西汀P、咖啡因C三組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，撲熱息痛S作內(nèi)標(biāo)物。實(shí)驗(yàn)條件：色譜0.4×50cm日立3010膠；流動(dòng)相：甲醇/三乙醇胺=1/500，流量1mL/min；UV273nm檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。樣品溶液：稱取1片量的藥品粉末0.5005g經(jīng)多次萃取后配制成1