五制分子生物學

五制分子生物學第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉入受體細胞---轉1、轉化2、轉染3、感染第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉入受體細胞---轉1、轉化：將重組質粒導入細菌或酵母細胞的過程。感受態(tài)細胞：容易接受外源DNA進入的細菌。轉化方法：化學方法(氯化鈣法)物理方法(電穿孔法)第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉入受體細胞---轉1、轉化：第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉入受體細胞---轉2、轉染：將外源DNA直接導入真核細胞的過程。（包括噬菌體導入細菌的過程）轉化方法：化學方法(磷酸鈣共沉淀法，脂質體融合法)物理方法(顯微注射法，電穿孔法)第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（四）重組DNA轉入受體細胞---轉2、轉染：第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉入受體細胞---轉3、感染將外源DNA通過包裝成病毒顆粒，然后導入到細胞的過程。第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉入受體細胞---轉1、轉化2、轉染3、感染第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉入受體細胞---轉（五）重組體的篩選與鑒定---篩第九頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲取---分（二）載體的選擇與構建---選（三）目的DNA與載體連接---接（四）重組DNA轉入受體細胞---轉（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法2、序列特異性篩選法3、親和篩選法第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（1）利用抗生素抗性標志篩選：含有抗生素的培養(yǎng)基上不含有載體的細菌含有載體的細菌是否含有外源DNA第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（1）利用抗生素抗性標志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：載體上需要有兩個篩選標志外源DNA插入其中一個篩選標志使其失去篩選作用另一個篩選標志仍發(fā)揮作用第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日（2）利用基因的插入失活特性篩選：第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日（2）利用基因的插入失活特性篩選：如何得到含有重組質粒的細菌？第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（1）利用抗生素抗性標志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標志補救篩選：載體上的標志基因表達，補救宿主細胞的缺陷基因，使細胞在選擇性培養(yǎng)基上存活。第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日1、遺傳標志篩選法（3）利用標志補救篩選：第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（1）利用抗生素抗性標志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標志補救篩選：藍白篩選第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）利用標志補救篩選：藍白篩選第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）利用標志補救篩選：藍白篩選第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）利用標志補救篩選：藍白篩選第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）利用標志補救篩選：藍白篩選第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日（3）利用標志補救篩選：藍白篩選X-gal藍色產物-半乳糖苷酶第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（1）利用抗生素抗性標志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標志補救篩選：（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日

coscos12bp12bp48500bpNonessentialportionforreplicationLong(left)armShort(right)arm三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：重組λDNA的長度為其野生型長度的75%～105%時，才能包裝形成有活性的噬菌體顆粒。第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法2、序列特異性篩選（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸雜交法（4）DNA測序法第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽性克隆的重組DNA第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日

Linearvector(2700bp)insert(300bp)

M空質粒重組質粒NcoIHindIII2700bp300bp提取陽性克隆的重組DNARE消化電泳有無DNA片段的插入；插入片段的大小三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：提取陽性克隆的重組DNA第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在a、提取陽性克隆重組DNAb、用特異引物進行PCRc、電泳PCR產物d、判斷PCR產物是否與外源DNA一致NcoIHindIII2700bp300bp第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽性克隆第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽性克隆（4）DNA測序法：最準確的鑒定方法第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日（五）重組體的篩選與鑒定---篩2、序列特異性篩選（1）RE酶切法：酶切鑒定插入片段（2）PCR法：直接鑒定目的DNA的存在（3）核酸雜交法：原位雜交鑒定陽性克隆（4）DNA測序法：最準確的鑒定方法3、親和鑒定法：抗原-抗體反應Ab第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法2、序列特異性篩選3、親和鑒定法第三十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法（1）利用抗生素抗性標志篩選：（2）利用基因的插入失活特性篩選：（3）利用標志補救篩選：（4）利用噬菌體的包裝特性篩選：2、序列特異性篩選3、親和鑒定法第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（五）重組體的篩選與鑒定---篩1、遺傳標志篩選法2、序列特異性篩選（1）RE酶切法（2）PCR法（3）核酸雜交法（4）DNA測序法3、親和鑒定法第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術一、重組DNA技術中常用的工具酶二、重組DNA技術中常用的載體三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（一）目的DNA的分離獲?。ǘ┹d體的選擇與構建（三）目的DNA與載體連接（四）重組DNA轉入受體細胞（五）重組體的篩選與鑒定（六）克隆基因的表達第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術一、重組DNA技術中常用的工具酶二、重組DNA技術中常用的載體三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（六）克隆基因的表達基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。蛋白表達系統(tǒng)是指由外源基因、載體、宿主和輔助成分組成的體系。第三十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術一、重組DNA技術中常用的工具酶二、重組DNA技術中常用的載體三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（六）克隆基因的表達蛋白表達系統(tǒng)是指由外源基因、載體、宿主和輔助成分組成的體系。第三十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)重組DNA技術二、重組DNA技術中常用的載體（一）克隆載體（二）表達載體1、原核表達載體2、真核表達載體三、重組DNA技術的基本原理及操作步驟（六）克隆基因的表達1、