BD流式全面介紹

會(huì)計(jì)學(xué)1BD流式全面介紹流式細(xì)胞儀系統(tǒng)簡(jiǎn)介通過(guò)流式細(xì)胞儀我們可以得到以下信息

- 相對(duì)細(xì)胞大小

-相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度

-染色過(guò)細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度第1頁(yè)/共131頁(yè)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第2頁(yè)/共131頁(yè)流式細(xì)胞儀的光信號(hào)散射光信號(hào)熒光信號(hào)第3頁(yè)/共131頁(yè)1.散射光信號(hào)前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信號(hào)細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積。側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）

入射激光90角的散射光信號(hào)

細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性。第4頁(yè)/共131頁(yè)前向角散射光——FSCForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser第5頁(yè)/共131頁(yè)側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser第6頁(yè)/共131頁(yè)散射光散射光能被用來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異

- 通常使用“散點(diǎn)圖”來(lái)看散射光信號(hào)

- 散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)第7頁(yè)/共131頁(yè)散點(diǎn)圖——DotPlotlysedwholeblood第8頁(yè)/共131頁(yè)ReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?AB第9頁(yè)/共131頁(yè)2.熒光信號(hào)熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為 振動(dòng)能和熱能 釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng) 第10頁(yè)/共131頁(yè)熒光檢測(cè)器FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)第11頁(yè)/共131頁(yè)Two-ColorCellAnalysisWhichofthethreepopulationshasthemostAbAbindingsites?AbAAbB第12頁(yè)/共131頁(yè)現(xiàn)代流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng)聚焦細(xì)胞以供檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)和收集光信號(hào)電子系統(tǒng)將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，并使其數(shù)字化以供計(jì)算機(jī)分析

第13頁(yè)/共131頁(yè)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處第14頁(yè)/共131頁(yè)SampleFlowinOpticalCuvetteSampleLaminar

FlowLowSampleFlowRate12mL/minSheathSheathSampleLaminar

FlowSheathSheathOpticalCuvetteHighSampleFlowRate60mL/min第15頁(yè)/共131頁(yè)ReviewQuestionWhichofthefollowingwouldcausedisturbanceinthelaminarflowoftheopticalcuvette?bubblescellularconcentrationsampleflowrate第16頁(yè)/共131頁(yè)Optics

Excitationopticsconsistof:LasersLensesandmirrorsthatroutethelaserlighttothefluidicstreamCollectionopticsconsistof: Filtersthatdirectthesignalstotheappropriateopticaldetectors第17頁(yè)/共131頁(yè)OpticalFilters460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

Longpass Shortpass Bandpass第18頁(yè)/共131頁(yè)FACSCalibur光路圖第19頁(yè)/共131頁(yè)OpticsLaserFluorochromesDetectorParameterFilterFITCGFPFL1530/30PEPIFL2585/42PerCPPerCP-CY5.5FL3670LPAPCFL4661/16488nm635nm第20頁(yè)/共131頁(yè)ElectronicsConvertsanalogsignalstoproportionaldigitalsignalsComputesHeight

foreachpulseCalculateswidthandareaInterfaceswiththecomputerfordatatransfer第21頁(yè)/共131頁(yè)CreationofaVoltagePulse-AnalogSignalLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage第22頁(yè)/共131頁(yè)QuantificationofaVoltagePulseTime

VoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0Heightisameasurementforallparameters.Width=Area/Height第23頁(yè)/共131頁(yè)EffectoftheInstrumentControlsontheDataInstrumentControlsDetectorFSCdetector250gainFSCdetector350gain第24頁(yè)/共131頁(yè)Review

DataProcessingFL2FL1SSCFSCFL4FL3第25頁(yè)/共131頁(yè)ReviewQuestionsWhichofthefollowingfluorochromescannotbeusedwiththeFACSCalibur?DAPI(ex.345nm,emits455nm)PropidiumIodide(ex.536nm,emits617nm)AlexaFluor647(ex.650nm,emits668nm)WhatarethethreemeasurementsofaparticlethatcanbedeterminedbyFACSCalibur?Brieflydescribethefunctionsofthefluidics,optics,andelectronicssystems.第26頁(yè)/共131頁(yè)ReviewQuestionsWhatwouldhappentothepopulationbelowifyouincreasedtheRedparametervalueintheInstrumentcontrols?第27頁(yè)/共131頁(yè)ReviewQuestionsWhichinstrumentcomponentsensurethatthefluorescencesignalofaspecificfluorochromeisonlymeasuredbyadesignateddetector?Forexample,APCisonlymeasuredbytheFL4detector.第28頁(yè)/共131頁(yè)樣本處理第29頁(yè)/共131頁(yè)細(xì)胞懸液的制備細(xì)胞懸液：分離PBMC、PRP等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細(xì)胞特定群體丟失，并可能引入某些誤差直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣本用血量小灌洗液、體腔積液培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系實(shí)體組織：病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本針吸組織：新鮮樣本鞘液、洗液等：清潔無(wú)顆粒雜質(zhì)第30頁(yè)/共131頁(yè)步驟一：

選擇合適的熒光染料必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少第31頁(yè)/共131頁(yè)熒光產(chǎn)生過(guò)程第32頁(yè)/共131頁(yè)P(yáng)ropidiumIodide400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm第33頁(yè)/共131頁(yè)Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm第34頁(yè)/共131頁(yè)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)Protein第35頁(yè)/共131頁(yè)Allophycocyanin(APC)Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm第36頁(yè)/共131頁(yè)

FITC和PE熒光光譜

第37頁(yè)/共131頁(yè)補(bǔ)償調(diào)節(jié)前后對(duì)比FL1FL2第38頁(yè)/共131頁(yè)步驟二：

染色體積溫度孵育時(shí)間對(duì)照第39頁(yè)/共131頁(yè)直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low第40頁(yè)/共131頁(yè)間接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high第41頁(yè)/共131頁(yè)Avidin-BiotinmethodIbiotinylatedprimaryAbbiotinavidinbiotinylateddye第42頁(yè)/共131頁(yè)步驟三：

數(shù)據(jù)收集和分析畫(huà)圖尋找目標(biāo)細(xì)胞調(diào)整儀器設(shè)置到合適的狀態(tài)我們可以得到怎樣的結(jié)果？它們意味著什么？第43頁(yè)/共131頁(yè)儀器設(shè)置調(diào)節(jié)1.用未染色細(xì)胞調(diào)整儀器PMT電壓2.用單染色的細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器補(bǔ)償?shù)?4頁(yè)/共131頁(yè)關(guān)于同型對(duì)照例：一個(gè)雙色染色的實(shí)驗(yàn)抗體AFITC，抗體BPE

對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要準(zhǔn)備的是陰性對(duì)照：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE單陽(yáng)性對(duì)照：

FITC:細(xì)胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:細(xì)胞加上AbBPE,IgG1FITC第45頁(yè)/共131頁(yè)數(shù)據(jù)分析設(shè)門(mén)設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)第46頁(yè)/共131頁(yè)如何設(shè)定陰性與陽(yáng)性的界限第47頁(yè)/共131頁(yè)第48頁(yè)/共131頁(yè)第49頁(yè)/共131頁(yè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用第50頁(yè)/共131頁(yè)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞計(jì)數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢查HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病第51頁(yè)/共131頁(yè)流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用免疫功能研究癌癥病人的多藥耐藥性細(xì)胞動(dòng)力學(xué)功能研究動(dòng)物性別篩選海洋與環(huán)境微生物分析染色體分選第52頁(yè)/共131頁(yè)流式細(xì)胞儀的遺傳學(xué)應(yīng)用細(xì)胞DNA,RNA含量的測(cè)定染色體倍體分析染色體分離基因表達(dá)產(chǎn)物的生物活性研究基因轉(zhuǎn)染表達(dá)的生物效應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控研究細(xì)胞內(nèi)基因定位酵母轉(zhuǎn)基因株的篩選報(bào)告基因的定性定量檢測(cè)植物遺傳學(xué)研究??????第53頁(yè)/共131頁(yè)WhatcanFlowCytometertellusaboutacell?CellLineage/SubsetPhenotypeCytokine/ChemokineProductionRepertoireCytokine/ChemokineReceptorRepertoireMigration/HomingPhenotypreCellcyclestatus第54頁(yè)/共131頁(yè)細(xì)胞增殖（細(xì)胞周期）細(xì)胞內(nèi)DNA含量增殖相關(guān)基因的表達(dá)BrdU的結(jié)合示蹤染料第55頁(yè)/共131頁(yè)DNA探針DNA探針最主要的特點(diǎn)是，它們與DNA含量是成化學(xué)正比關(guān)系的——這樣，帶有的探針熒光分子的數(shù)目就和DNA分子的含量相當(dāng)，從而檢測(cè)DNA含量第56頁(yè)/共131頁(yè)NucleicacidProbes菲啶基PropidiumIodideEthidiumBromide苯甲亞胺Hoechst33342抗生素Mithramycin,ChromamycinA3AcridineOrange-AOPyronynY第57頁(yè)/共131頁(yè)G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

第58頁(yè)/共131頁(yè)AtypicalDNAHistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents第59頁(yè)/共131頁(yè)紅色為正常二倍體細(xì)胞；黃色為異倍體細(xì)胞第60頁(yè)/共131頁(yè)

增殖相關(guān)基因PCNA(Proliferatingcellnuclearantigen)

一種蛋白質(zhì)，在DNA復(fù)制和核苷酸的切除修復(fù)中起到作用Ki-67-proliferationrelatedantigenKi-S1-proliferationrelatedantigenPhospho-histoneCyclinD1,E,A,B1第61頁(yè)/共131頁(yè)

BrdUrdIncorporationBromodeoxyuridine(BrdU)是一個(gè)胸腺核苷的類(lèi)似物能夠在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期狀態(tài)分析中起作用BrdU能與正在復(fù)制周期內(nèi)的細(xì)胞相結(jié)合使用BrdU抗體能夠檢測(cè)到BrdU第62頁(yè)/共131頁(yè)

BrdUrdIncorporation第63頁(yè)/共131頁(yè)

細(xì)胞分裂的分析

哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)需要有大量的增殖，能夠確?？乖禺愋缘腡細(xì)胞和B細(xì)胞具有足夠的增殖速度，能夠?qū)Ω吨尾∩镌斐傻母腥綜FSE是一種示蹤染料，能夠均等地在兩個(gè)子代細(xì)胞中分布，其結(jié)果可以區(qū)分出8-10代的子細(xì)胞。第64頁(yè)/共131頁(yè)TracingDye(CFSE)第65頁(yè)/共131頁(yè)

Apoptotic

CellDeath

--ageneticallyencodedcelldeathprogram,whichismorphologically,biochemicallyandmolecularlydistinctfromnecrosis第66頁(yè)/共131頁(yè)Flowcytometryofapoptoticcelldeath細(xì)胞散射光在細(xì)胞調(diào)亡中，細(xì)胞收縮，從而FSC下降，SSC上升或是沒(méi)有明顯變化第67頁(yè)/共131頁(yè)第68頁(yè)/共131頁(yè)Flowcytometryofapoptoticcelldeath熒光吸收細(xì)胞的胞膜對(duì)于DNA染料的通透性和細(xì)胞的活性、死亡和凋亡相關(guān)，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞第69頁(yè)/共131頁(yè)FlowcytometryofapoptoticcelldeathFCMofCaspases通過(guò)抗體和活化的caspase-3片斷相結(jié)合來(lái)檢測(cè)

使用特異性的caspase-3熒光底物新的抗原決定基CK18第70頁(yè)/共131頁(yè)第71頁(yè)/共131頁(yè)Flowcytometryofapoptoticcelldeath線(xiàn)粒體功能的變化

TMP會(huì)在調(diào)亡中產(chǎn)生，可以通過(guò)一些標(biāo)記用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用有膜穿透性的親脂性陽(yáng)離子熒光染料，如Rh123,DiOC6,JC-1,CMXRos等，可作為流式檢測(cè)的探針。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡時(shí)，一個(gè)線(xiàn)粒體膜表面蛋白——7A6抗原會(huì)出現(xiàn)Bcl-2/baxfamilyofproteins.

第72頁(yè)/共131頁(yè)第73頁(yè)/共131頁(yè)第74頁(yè)/共131頁(yè)Flowcytometryofapoptoticcelldeath鈣離子流和pH值變化

胞漿內(nèi)Ca2+水平的上升和由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸化造成的選擇性的pH值的調(diào)節(jié)降低是伴隨著細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的后果之一。使用Ca2+選擇性熒光探針，如Quin-2,Fluo-3,Indo-1通過(guò)流式檢測(cè)是測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的最佳方案酸化的檢測(cè)同樣可以用對(duì)pH敏感的熒光探針，如DCH,BCECF,BCECF-AM,SNAFLs,SNARFs等進(jìn)行檢測(cè)第75頁(yè)/共131頁(yè)FlowcytometryofapoptoticcelldeathPhospholipidredistribution第76頁(yè)/共131頁(yè)第77頁(yè)/共131頁(yè)FlowcytometryofapoptoticcelldeathDNA鏈的斷裂細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)度在180-200bp的DNA片段。斷裂的末端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶(TdT)連接上dUTP。第78頁(yè)/共131頁(yè)第79頁(yè)/共131頁(yè)第80頁(yè)/共131頁(yè)第81頁(yè)/共131頁(yè)Flowcytometryofapoptoticcelldeath細(xì)胞DNA含量

在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過(guò)流式檢測(cè)DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。第82頁(yè)/共131頁(yè)FlowCytometryofApoptoticCellsPI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells第83頁(yè)/共131頁(yè)

AnIntegratedApproach

toCellImmunology第84頁(yè)/共131頁(yè)ImmuneFunctionassay

免疫細(xì)胞亞群檢測(cè)Antigen-peptidespecificTcells檢測(cè)T-cells活化TregCells細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子/趨化因子檢測(cè)磷酸化第85頁(yè)/共131頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來(lái)判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病

NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，

能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。第86頁(yè)/共131頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T(mén)輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)，此外，這一比值還可用來(lái)監(jiān)測(cè)骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻擊

Th/Ts升高：自身免疫性疾?。?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血第87頁(yè)/共131頁(yè)AbsoluteCounts--CellspermLPositiveCellAbsoluteCountBeadsNegativeCellCD4PECD4PE第88頁(yè)/共131頁(yè)抗原特異性T細(xì)胞提供檢測(cè)者一個(gè)強(qiáng)有力的工具用于研究對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答和疫苗的開(kāi)發(fā)第89頁(yè)/共131頁(yè)MHC:ClassIandClassIIGeneProductsTcell受體不直接和可溶性抗原相連抗原必須通過(guò)MHC由抗原呈遞細(xì)胞傳遞給T細(xì)胞(Macrophages,Dendriticcells,Bcells)MHCClassIGeneProducts呈遞抗原給CD8+Tcells誘導(dǎo)細(xì)胞毒應(yīng)答MHCClassIIGeneProducts呈遞抗原給CD4+Tcells誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，免疫球蛋白的分泌第90頁(yè)/共131頁(yè)

MHC/TCRSignaling第91頁(yè)/共131頁(yè)二聚體可溶性MHC類(lèi)似物與四聚體的比較第92頁(yè)/共131頁(yè)Quantitationofantigen-specificTlymphocytesinperipheralblood

HAMControlHIVCD8Tax-A2/IgGag-A2/Ig第93頁(yè)/共131頁(yè)Treg細(xì)胞的檢測(cè)Treg細(xì)胞與自身免疫耐受相關(guān)，通常的檢測(cè)方法用CD4陽(yáng)性細(xì)胞中CD25高表達(dá)，同時(shí)結(jié)合胞內(nèi)FoxP3含量來(lái)判斷最新發(fā)現(xiàn)人的Treg細(xì)胞低表達(dá)CD127。CD127的表達(dá)模式與Foxp3很接近，說(shuō)明低表達(dá)CD127，高/中表達(dá)CD25的CD4陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞就是Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）。該方法比胞內(nèi)檢測(cè)Foxp3的優(yōu)點(diǎn)在于，檢測(cè)后的細(xì)胞可用于后續(xù)的培養(yǎng)及其他的體外試驗(yàn)。另外的優(yōu)點(diǎn)是用這種檢測(cè)方案分選的Treg細(xì)胞得率更高。第94頁(yè)/共131頁(yè)第95頁(yè)/共131頁(yè)ImmuneFunctionAssays--APowerfulResearchToolforAnsweringBasicBiologicalQuestionsin...AIDS或癌癥機(jī)理的研究Tcell亞群對(duì)于病毒和細(xì)菌抗原的反應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)機(jī)會(huì)感染的免疫反應(yīng)藥物/疫苗的效果評(píng)價(jià)

免疫調(diào)節(jié)移植監(jiān)控毒理研究第96頁(yè)/共131頁(yè)第97頁(yè)/共131頁(yè)第98頁(yè)/共131頁(yè)第99頁(yè)/共131頁(yè)TraditionalCytokineFlowCytometryIL-2PhycoerythrinCD4FITC第100頁(yè)/共131頁(yè)細(xì)胞因子檢測(cè)細(xì)胞因子是可溶性蛋白，在淋巴細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答，研究生理或病理免疫調(diào)節(jié)因素所致細(xì)胞因子合成的應(yīng)答與改變是研究疾病病因與免疫狀態(tài)的重要工具。第101頁(yè)/共131頁(yè)T細(xì)胞的細(xì)胞因子分型Ⅰ型細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)引起遲發(fā)過(guò)敏反應(yīng)、巨噬細(xì)胞活化、2型反應(yīng)下調(diào)刺激來(lái)源：病毒、某些細(xì)菌Ⅱ型體液介導(dǎo)免疫反應(yīng)引起B(yǎng)細(xì)胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反應(yīng)下調(diào)刺激來(lái)源：多細(xì)胞寄生蟲(chóng)、過(guò)敏源第102頁(yè)/共131頁(yè)細(xì)胞因子第103頁(yè)/共131頁(yè)BiologicalVariationAmongCMV-seropositiveDonorsinResponsetoCMV第104頁(yè)/共131頁(yè)CFC&Proliferation 使用溫和的方法進(jìn)行細(xì)胞破膜和固定，在中性pH值條件下，使細(xì)胞和BrdU結(jié)合，可以同時(shí)檢測(cè)到：S期細(xì)胞周期

表型活化狀態(tài)核型決定基胞漿內(nèi)決定基細(xì)胞因子/趨化因子其他…………..第105頁(yè)/共131頁(yè)CFC&ProliferationAllowsthecorrelationof:PhenotypeCytokineexpressionCellCycleProliferation第106頁(yè)/共131頁(yè)BDPhosflow磷酸化檢測(cè)系統(tǒng)更好的特異性的抗體建立在單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上的檢測(cè)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)參數(shù)快速、靈敏、樣本量更少第107頁(yè)/共131頁(yè)P(yáng)PYYYY非磷酸化特異性抗體 ?檢測(cè)全部的相關(guān)蛋白 unphosphorylated+phosphorylated亞型 ?抗原：重組的蛋白質(zhì)片斷磷酸化特異性抗體

?僅僅檢測(cè)磷酸化亞型 ?抗原：合成的4-10mer磷酸化肽段Y磷酸化特異性和非磷酸化特異性抗體的差異第108頁(yè)/共131頁(yè)BDPhosFLOW和Westernblot的比較AtheoreticalexperimentcomparingWesternblotandflowcytometrywiththreesamplesandaproteinofinterestat1,10,or50copiespercell.Sample2and3lookthesameviaWesternblot,butwhenstainedwithfluorescentlylabeledantibodies,thedifferencesbetweenthesamplesbecomemorerelevant.(Source:P.O.Krutziketal./ClinicalImmunology110(2004)206–221)第109頁(yè)/共131頁(yè)BDPhosFlowGenomics&Proteomics--SingleCellsHaveBigProteomicsStoryto

Tell.

BDPhosFlownotonlytellsyouactivationofasinglecellforoneparticularphosphoproteinandpathway,butallowsyoutostudymultiplephosphorylationeventsandpathwayssimultaniously.第110頁(yè)/共131頁(yè)100101102103104100101102103104PBMC050100150200250FSC-H050100150200250SSC-HCD20PerCP-Cy5.5CD3PEZap70(Y319)/Syk(Y352)Alexa647

100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104100101102103104CD3PE100101102103104020406080100100101102103104020406080100100101102103104020406080100CD3-/CD20+

CD3+/CD20-CD3-/CD20-CD20PerCP-Cy5.5WholeBloodCD3CrossLink

050100150200250FSC-H050100150200250SSC-H21.8Multi-ColorPhosFlowinCD3/CD28orCD3crosslinkedhumanPBMCsorWholeBloodCD3/CD28CrosslinkUntreatedcells(unshaded)vstreatedcells(shaded)第111頁(yè)/共131頁(yè)BDCBA

一種“三明治”免疫測(cè)定法——

使用結(jié)合有高親和性抗體的小球，用來(lái)特異性地捕獲可溶性的抗原.

用熒光檢測(cè)抗體來(lái)檢測(cè)被捕獲的抗原

使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析第112頁(yè)/共131頁(yè)第113頁(yè)/共131頁(yè)MultiplexedBeadsShadesofacolorAntibodycoupledbeads,emittingatdistinctFL3intensitiesVariousanalytesAntibodycoupledPElabel,emittingatFL2intensityproportionaltoanalyteconc.第114頁(yè)/共131頁(yè)MultiplexedBeads0pg/mL80pg/mL1250pg/mL5000pg/mLFL3BeadsFL2(PE)第115頁(yè)/共131頁(yè)使用BD?CytometricBeadArray

(CBA)系統(tǒng)你可以:

?從單一小體積樣本中得到多項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果?對(duì)所有的檢測(cè)項(xiàng)目，只需要制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)混合物來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?避免人為造成的酶聯(lián)放大的假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生?用更少的時(shí)間和精力，卻得到大量的結(jié)果?如果是用488nm和635nm兩根激光器來(lái)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件更容易建立?使用配有HTS選件的BD流式細(xì)胞儀可以做到自動(dòng)平板上樣和高通量檢測(cè)第116頁(yè)/共131頁(yè)目前CBA主要提供的檢測(cè)內(nèi)容可溶性細(xì)胞因子細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白磷酸化蛋白第117頁(yè)/共131頁(yè)BDCBAFlexSetABCDEFGHI123456789FL4-HorRed-AFL3-HorNIR-AOldFormatBDCBABeadsBDCBAFlexSetBeads第118頁(yè)/共131頁(yè)更為靈活強(qiáng)大的CBAFlexSet最多可同時(shí)檢測(cè)72個(gè)項(xiàng)目可自由選擇搭配檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)項(xiàng)目范圍更廣泛需要488nm和635nm兩種波長(zhǎng)的激光器ABCDEFGHI123456789FL4-HorRed-AFL3-HorNIR-A第119頁(yè)/共131頁(yè)9個(gè)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)活化T細(xì)胞1234567891.Itk(Y511)2.ERK(T202/Y204)3.JNK(T183/Y185)4.P38(T180/Y182)5.PLCg(Y783)6.ZAP70(Y319)7.LAT(Y171)8.c-Jun(S63)9.RSK(S380)第120頁(yè)/共131頁(yè)KineticsofJurkatCellActivationWithAnti-CD3/CD28110100FOLDINCREASEINUNITS/ML05101520TIME(MINUTES)RSK(S380)Jun(S63)LAT(Y171)Itk(Y511)ZAP-70(Y319)PLCg(Y783)P38(T180/Y1