an第五章目的基因的導(dǎo)入和重組子的篩選

本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術(shù)第八章植物基因工程及應(yīng)用第九章動物基因工程及應(yīng)用第十章醫(yī)學基因工程及應(yīng)用1/17/20231第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選5.1DNA片段的連接重組5.2受體細胞選擇的基本原則5.3基因轉(zhuǎn)移5.4重組子的篩選1/17/202325.1DNA片段的連接重組5.1.1DNA連接類型5.1.2DNA片段之間連接的方式5.1.3DNA重組中需注意的問題1/17/20233DNA分子連接

不同的DNA片段（目的基因和載體）經(jīng)適當酶切后，在連接酶的作用下，連接在一起構(gòu)建成重組DNA分子。1/17/202345.1.1DNA重組（連接）的類型插入重組:載體上只有唯一的酶識別位點隨機（非定向）插入置換重組(1)載體上有兩個同樣的酶識別位點隨機（非定向）置換(2)載體上有兩個不同的酶識別位點定向置換1/17/202355.1.2DNA片段之間連接的方式具互補黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行的連接DNA片段加linkeroradaptor后的連接1/17/202365.1.3DNA重組中需注意的問題兩端具相同粘性末端的DNA分子會發(fā)生自身環(huán)化。對于置換重組，需將切割的DNA分子經(jīng)過凝膠電泳分離，回收目的片段。無論單酶切還是雙酶切，目的DNA分子均可能發(fā)生串聯(lián)，必需檢測重組DNA插入片段的分子大小。1/17/202375.2受體細胞及其選擇的基本原則5.2.1受體細胞5.2.2受體細胞選擇的基本原則1/17/202385.2.1受體細胞受體細胞（receptorcell）：又稱為宿主細胞或寄主細胞（hostcell）從實驗技術(shù)上講：是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞。從實驗?zāi)康纳现v：是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細胞。1/17/202395.2.2受體細胞選擇的原則外源DNA分子能穩(wěn)定存在，限制酶缺陷型；重組基因缺陷型；易于轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)；易篩選遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)；安全性高；內(nèi)源蛋白酶基因缺失或缺陷；遺傳密碼無明顯偏好性；具有較好的轉(zhuǎn)譯加工機制；較高的理論和實踐應(yīng)用價值。1/17/2023105.3基因因轉(zhuǎn)移（genetransfer）載體與目的基基因連接后，，體系中可能能存在下列分分子：a.未未連接的載體體分子b.未未連接的DNA片段c.載載體的自連連d.含有錯錯誤插入片段段的重組DNA分子e.重重組DNA分子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化過程中中，這些分子子同時被轉(zhuǎn)移移到宿主細胞胞內(nèi)。未連接接的分子即使使被細菌攝取取，只有在特特殊的條件下下才能復(fù)制，，寄主的酶可可降解這些DNA片段。。自連的載體體和錯誤插入入的重組質(zhì)粒?？梢赃M入1/4/202311宿主細胞胞進行正正常的復(fù)復(fù)制。因因此，需需要將重重組克隆隆鑒定出出來。把重組DNA導(dǎo)導(dǎo)入受體體細胞進進行擴增增根據(jù)所用用載體的的特性選選擇適宜宜的受體體細胞及及選擇適適宜的重重組DNA導(dǎo)入入的方式式：轉(zhuǎn)化化、轉(zhuǎn)染染和轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)。1/4/2023125.3基基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移（genetransfer）5.3.1重重組質(zhì)粒粒DNA分子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸腸桿菌5.3.2重重組噬菌體體DNA分子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸腸桿菌5.3.3重重組DNA分子子轉(zhuǎn)入真真核細胞胞1/4/2023135.3.1重重組質(zhì)粒粒DNA分子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化大腸腸桿菌5.3.1.1細菌菌轉(zhuǎn)化的的機制5.3.1.2化學學轉(zhuǎn)化法法（CaCl2誘導(dǎo)大腸腸桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法））5.3.1.3電激激法（電電穿孔轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法））5.3.1.4轉(zhuǎn)化化率的計計算及其其影響因因素1/4/2023145.3.1.1細菌菌轉(zhuǎn)化的的機制轉(zhuǎn)化(transformation)：：重組質(zhì)粒粒DNA分子通通過與膜膜蛋白結(jié)結(jié)合進入入受體細細胞，并并在受體體細胞內(nèi)內(nèi)穩(wěn)定維維持和表表達的過過程稱為為轉(zhuǎn)化。。自然界界中，，轉(zhuǎn)化化并不不是細細菌或或的遺遺傳信信息的的主要要方式式，實實驗室室中只只有小小部分分的細細菌可可以很很容易易的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化，，進一一步的的研究究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)，這這類細細菌含含有DNA結(jié)合合和吸吸收的的代謝謝機制制。正正常條條件下下，大大部分分細菌菌包括括大腸腸桿菌菌，只只能吸吸收有有限的的DNA，，為了了提高高轉(zhuǎn)化化效率率，建建立了了一系系列的的轉(zhuǎn)化化方法法：a.熱熱激激法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化感感受態(tài)態(tài)細胞胞b.PEG介介導(dǎo)的的原生生質(zhì)體體轉(zhuǎn)化化1/4/202315c.高高壓壓電穿穿孔法法轉(zhuǎn)化化d.顯顯微微注射射法轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化e.接接合合轉(zhuǎn)化化f.噬噬菌菌體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染1/4/202316表4—1大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率Ca誘導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結(jié)合轉(zhuǎn)化104-51/4/2023175.3.1.2化化學轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法法（CaCl2誘導(dǎo)大大腸桿桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法法）原理：：0oC、低濃濃度（（50～100mM））CaCl2，Ca2+改變細細胞膜膜的磷磷脂層層結(jié)構(gòu)構(gòu)，提提高膜膜的通通透性性，而而且增增強進進入細細胞的的DNA分分子抗抗DNase的的能力力。特點：操作簡便，不不需特殊儀器器，一般實驗驗室均可進行行。轉(zhuǎn)化率在在5106～2107個轉(zhuǎn)化子/g質(zhì)粒DNA范圍內(nèi)，，完全可滿足足常規(guī)克隆的的需要。1/4/2023185.3.1.2化學轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌菌轉(zhuǎn)化法）感受態(tài)細胞制制備：感受態(tài)細胞：指處于能吸吸收周圍環(huán)境境中DNA分分子的生理狀狀態(tài)的細胞。。菌種活化、培培養(yǎng)、收菌和和進行CaCl2處理。DNA分子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細細胞：冰浴、42oC熱激、37oC恢復(fù)、涂板培培養(yǎng)。1/4/2023195.3.1.3電電激法法（電電穿孔孔轉(zhuǎn)化化法））原理：利用高高壓電電脈沖沖作用用，在在細菌菌細胞胞膜上上進行行電穿穿孔（electroporation）），形形成可可逆的的瞬間間通道道，促促進外外源DNA的有有效吸吸收。。特點：1.感感受受態(tài)細細胞制制備簡簡單；；2.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化率高高達109～1010個轉(zhuǎn)化化子/g質(zhì)粒粒DNA；；3.用用途途廣泛泛，但但需特特殊儀儀器電電激儀儀。除感受受態(tài)細細胞制制備及及轉(zhuǎn)化化與化化學法法不同同之外外，其其余步步驟包包括所所設(shè)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化對對照與與化學學法相相均相相同。。1/4/2023205.3.1.4轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化率率的計計算及及其影影響因因素轉(zhuǎn)化率率：是指DNA分子子轉(zhuǎn)化化受體體菌獲獲得轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子子的效效率。。轉(zhuǎn)化率率計算算：＝轉(zhuǎn)化化子總總數(shù)/DNA分分子總總數(shù)或或質(zhì)量量或＝＝轉(zhuǎn)化化子總總數(shù)/受體體細胞胞數(shù)實際中中按轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子子總數(shù)數(shù)/DNA分子子質(zhì)量量(g)計算算1/4/202321影響轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化效效率的的因素素受體細細胞的的感受受態(tài)，它決決定轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化因因子能能否被被吸收收進入入受體體細胞胞；受體細細胞的的限制制酶系系統(tǒng)和和其他他核酸酸酶，它們們決定定轉(zhuǎn)化化因子子在整整合前前是否否被分分解；；受體和和供體體染色色體的的同源源性，它決決定轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化因因子的的整合合；重組DNA分分子大大小重組DNA純度度、濃濃度1/4/2023225.3.2重重組噬菌菌體DNA分子子轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)大腸腸桿菌菌轉(zhuǎn)染(transfection)：采用與與質(zhì)粒粒DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化受受體細細胞相相似的的方法法，將將重組組噬菌菌體DNA分子子直接接導(dǎo)入入受體體細胞胞中的的過程程，稱稱為轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染。。效率較較低，，103～104個噬菌菌斑/gDNA，較難難滿足足一般般實驗驗要求求，實實踐中中少用用。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：是指通通過噬菌菌體（（病毒毒）顆顆粒感感染宿宿主細細胞的的途徑徑把外外源DNA分子子轉(zhuǎn)移移到受受體細細胞內(nèi)內(nèi)的過過程。。效率高，可可達103～104個噬菌斑/gDNA，需進行體外外包裝。1/4/202323體外裝配（（invitropackaging）：λDNA的轉(zhuǎn)染染效率不高高，如果將將重組的λλ分子裝配配成頭-尾尾結(jié)構(gòu)的病病毒粒子，，將極大的的提高效率率。1/4/202324噬菌體轉(zhuǎn)化大大腸桿菌的方方法1/4/202325噬菌體轉(zhuǎn)化大大腸桿菌的方方法1/4/202326λ噬菌體的體體外裝配有兩種不同的的系統(tǒng)可以應(yīng)應(yīng)用：一一種是cos位點突變的噬噬菌體的單品品系系統(tǒng)。另另一種種系統(tǒng)需要兩兩種不同的缺缺陷品系一個個是基因D的的突變體，另另一個品系是是基因E的突突變體，由于于蛋白質(zhì)合成成的缺陷。體體外的裝配過過程可以利用用兩種不同培培養(yǎng)物的混合合物，含有完完整的外殼蛋蛋白，完成裝裝配過程。將將裝配的噬菌菌體接入細菌菌就可以完成成正常的侵染染過程。1/4/202327λ噬噬菌菌體體體體外外裝裝配配的的兩兩種種系系統(tǒng)統(tǒng)1/4/202328噬菌菌斑斑λ和和M13噬噬菌菌體體都都能能形形成成噬噬菌菌斑斑，，λλ形形成成的的是是真真正正的的噬噬菌菌斑斑(透透明明)，，是是由由于于細細胞胞的的裂裂解解引引起起的的；；而而M13的的噬噬菌菌斑斑是是渾渾濁濁的的，，因因為為細細胞胞并并未未裂裂解解，，它它引引起起的的是是細細菌菌生生長長的的減減慢慢，，而而使使細細菌菌的的濃濃度度低低于于周周圍圍細細胞胞。。1/4/202329重組噬菌體體的鑒定（一）利用用插入失活活鑒定M13噬菌菌體，多種種λ噬菌體體載體都含含有l(wèi)acZ’基因因，可以通通過插入失失活鑒定重重組噬菌體體。（二））λ噬噬菌體體的cI基基因的的插入入失活活λ噬菌菌體載載體在在cI基因因位點點上含含有單單一的的酶切切位點點，該該位點點上插插入外外源基基因可可以導(dǎo)導(dǎo)致該該基因因的失失活，，引起起表現(xiàn)現(xiàn)型的的變化化。正常的的噬菌菌斑是是渾濁濁的，，但重重組的的噬菌菌斑是是清亮亮的。（（三））利用用Spi(sensitivetoP2inhibition)表型型選擇擇一一般來來講，，λ噬菌菌體不不能侵侵染已已被P2噬噬菌體體侵染染的大腸腸桿菌菌細胞胞，因因此λλ噬菌菌體被被稱為為Spi+（對對P2前噬噬菌體體抑制制敏感感），，插入入新的的DNA后后，能能變成成spi-，可可以侵侵染含含有P2噬噬菌體體的細細菌，，只有重重組子子是Spi-可可以形形成噬噬菌斑斑，因此此可以以很方方便的的選擇擇出來來。1/4/202330（四））根據(jù)據(jù)λ基基因組組的大大小篩篩選λλ裝裝配系系統(tǒng)，，只有有37kb-52kb的DNA分分子可可以進進入頭頭部結(jié)結(jié)構(gòu)，，小于于37kb的不不能裝裝配。。許多多構(gòu)建建的λλ載體體切除除了部部分DNA，因因而小小于37kb，，只有有插入入外源源DNA分分子后后才能能被裝裝配到到頭部部結(jié)構(gòu)構(gòu)中，，使載載體的的長度度等于于或大大于37kb。。對于于這樣樣的λλ噬菌菌體載載體，，只有有重組組的噬噬菌體體才能能進行行正常常的復(fù)復(fù)制。。1/4/202331利用lacZ'基因因的插入失失活篩選重重組噬菌斑斑1/4/2023325.3.3重組DNA分子子轉(zhuǎn)入真核核細胞重組DNA分子導(dǎo)入入植物細胞胞－植物基因工工程(見后后面第八章章)重組DNA分子導(dǎo)入入哺乳動物物細胞－動物基因工工程(見后后面第九章章)1/4/2023335.4重重組子篩選選的方法5.4.1遺傳傳表型直接接檢測法5.4.2依賴賴重組子結(jié)結(jié)構(gòu)特征分分析的篩選選法5.4.3基因因表達產(chǎn)物物分析法5.4.4DNA序列測測定法1/4/2023345.4.1遺傳傳表型直接接檢測法根據(jù)載體的的選擇標記記的初步篩篩選根據(jù)插入序序列的表型型特征篩選選重組子1/4/202335通過插入入失活可可以初步步篩選重重組子，，但篩選選到的克克隆是否否插入了了正確的的片段，，還需要要進一步步的鑒定定，鑒定定的方法法主要有有如下幾幾種情況況：1限限制性性內(nèi)切酶酶法：外外源片段段通過特特定的酶酶切位點點插入到到載體上上，因此此，可以以通過這這些限制制性酶酶酶切重組組質(zhì)粒，，電泳分分析插入入片段長長度是否否正確。。2PCR法法：如果果已知插插入DNA片段段的某些些序列，，就可以以通過PCR的的方法進進行鑒定定3菌菌落原位位雜交法法：將在在后面的的章節(jié)中中提到。。4基基因產(chǎn)物物檢測法法：如果果使用的的是表達達載體，，那么就就可以通通過鑒定定基因產(chǎn)產(chǎn)物的方方法鑒定定正確的的克隆。。1/4/202336抗藥性選選擇標記記插入失失活/插插入表達達篩選法法pBR322有有許多單單一切點點的限制制性位點點，可以以用來切切開分子子插入新新的DNA片段段。如BamHI可可以從四環(huán)素位位點切開開，使該基因不能能表達，但仍能表達氨氨芐抗性性基因，對四環(huán)環(huán)素是敏敏感的。。篩選重重組pBR322按按照以下下方法進進行，將將轉(zhuǎn)化細細胞培養(yǎng)養(yǎng)于氨芐芐培養(yǎng)基基中，只只有轉(zhuǎn)化化細胞可可以生長長形成克克隆，影影印到四四環(huán)素培培養(yǎng)基上上，不能能在該培培養(yǎng)基上上生長的的菌落可可能就是是目的克克隆。這這屬于負向選擇擇1/4/202337根據(jù)載體的選選擇標記的初初步篩選抗藥性選擇標標記插入失活活/插入表達達篩選法-半乳糖苷苷酶顯色反應(yīng)應(yīng)篩選法（－互補篩選選）利用報告基因因篩選植物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化細胞利用遺傳選擇擇標記篩選哺哺乳底物轉(zhuǎn)基基因細胞1/4/2023381/4/202339利用tetR的插入失活活篩選重組組克隆1/4/202340抗藥性性選擇擇標記記插入入表達達篩選選法正向選選擇重組子子在培培養(yǎng)基基上能能生長長，而而非重重組子子不能能生長長。1/4/202341-半半乳糖糖苷酶酶顯色色反應(yīng)應(yīng)篩選選法（（－－互補補篩選選）載體：：含有有β-半乳乳糖苷苷酶基基因lacZ的調(diào)控控序列列和頭頭146個個aa的編編碼序序列宿宿主主：缺缺失了了lacZ基因，，可編編碼ββ-半半乳糖糖苷酶酶C端端序列列αα-互互補：：lacZ基因因上缺失近近操縱縱基因因區(qū)段段的突變變體可可以與與帶有完完整的的近操操縱基基因區(qū)區(qū)段的β-半乳乳糖苷苷酶隱隱性突突變體體之間間實現(xiàn)現(xiàn)互補補。在在這這樣的的系統(tǒng)統(tǒng)中，，轉(zhuǎn)化化質(zhì)粒粒的細細菌獲獲得了了amp抗抗性，，自連連質(zhì)粒粒可以以合成成正常常的酶酶，而而重組組質(zhì)粒粒的細細菌不不能合合成正正常的的酶。。在培培養(yǎng)基基中添添加酶酶的誘誘導(dǎo)物物IPTG，乳乳糖的的類似似物X-gal乳糖糖酶作作用下下顯示示藍色色，藍藍斑是是載體體自連連產(chǎn)物物，而而白色色克隆隆是重重組質(zhì)質(zhì)粒。。這一一系統(tǒng)統(tǒng)稱為為lacselection。1/4/202342X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚哚-b-D-半乳糖糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶酶（b-galactosidase)水解后生生成的吲哚哚衍生物顯顯藍色。IPTG是異丙基硫硫代半乳糖糖苷（Isopropylthiogalactoside)，，為非生理理性的誘導(dǎo)導(dǎo)物，它可可以誘導(dǎo)lacZ的的表達。1/4/202343利用用lacZ'基基因因的的插插入入失失活活篩篩選選重重組組子子1/4/202344植物物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基基因因載載體體的的選選擇擇標標記記/報報告告基基因因新霉霉素素磷磷酸酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基基因因:抗新新霉霉素素（（neomycin））或或卡卡那那霉霉素素（（kanamycin））潮霉素磷酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶(hygromycinphosphotransferase,HPT)基因因:抗卡那霉素或或潮霉素（hygromycin）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因:抗氯霉素-葡萄糖酸酸苷酶(-Glucuronidase,GUS)基因:熒光檢測或組組織化學檢測測，非正向選選擇抗除草劑bar基因：抗PPT（L-谷氨酸的的類似物）1/4/202345動物轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因載體體的選選擇標標記基基因氯霉素素乙酰酰轉(zhuǎn)移移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因因:抗氯霉霉素新霉素素磷酸酸轉(zhuǎn)移移酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基基因:抗新霉霉素（（neomycin）或或卡那那霉素素（kanamycin）胸苷激激酶基基因（（thymidinekinase,TK））二氫葉葉酸還還原酶酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基基因黃嘌呤呤－鳥鳥嘌呤呤磷酸酸核糖糖基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶酶(XGPRT)1/4/2023465.4.2依依賴賴重組組子結(jié)結(jié)構(gòu)特特征分分析的的篩選選法5.4.2.1菌菌落落裂解解瓊脂脂糖凝凝膠電電泳快快速檢檢測法法5.4.2.2限限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶酶切切分析析檢測測5.4.2.3PCR法法檢測測5.4.2.4核核酸酸分子子雜交交檢測測法1/4/2023475.4.2.1瓊瓊脂脂糖凝凝膠電電泳檢檢測原理：根據(jù)外外源DNA片段段插入入的重重組質(zhì)質(zhì)粒與與載體體DNA之之間大大小的的差異異來區(qū)區(qū)分重重組子子和非非重組組子。。特點：操作簡簡單、、快捷捷，成成本低低，適適合大大規(guī)模模篩選選。特特別適適用于于插入入片段段較大大的重重組子子的篩篩選。。1/4/2023485.4.2.2限限制性內(nèi)內(nèi)切酶酶切切分析檢測測原理：小量抽提質(zhì)質(zhì)粒DNA，利用限限制性內(nèi)切切酶酶切，，通過電泳泳分析確定定是否含有有插入片段段及其大小小、插入方方向。特點：可以區(qū)別假假陽性重組組子，結(jié)果果判斷較準準確，但操操作比較復(fù)復(fù)雜，不適適用于大規(guī)規(guī)模的篩選選。1/4/2023495.4.2.3PCR法法檢測原理：利用載體上上已知序列列設(shè)計的引引物進行PCR反應(yīng)應(yīng)，通過電電泳分析確確定是否含含有插入片片段及其大大小。特點：操作簡單，，便于大規(guī)規(guī)模篩選，，但Taq酶成本要