光合細(xì)菌Rhodoseudomonasacidohila的胞外聚合物的提取

光合細(xì)菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物的提取研究摘要：采用了五種不同的方法——EDTA、NaOH、H2SO4、熱提取和高速離心，對(duì)光合細(xì)菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物（EPS）進(jìn)行提取。結(jié)果表明，EDTA法是一種比較好的提取方法，提取效率高，對(duì)細(xì)胞破壞小。EPS中的多糖、蛋白和核酸含量分別為6.5、58.4、5.4mg/g干重。EDTA的適宜提取時(shí)間1～3h，用量約為2.8g/g干重。采用不同的提取方法，提取的EPS中的組分含量大不相同。本文還采用了兩種方法檢查細(xì)胞的破壞程度，一種是測(cè)定核酸含量，一種是測(cè)定光合細(xì)菌提取前后UV-Vis光譜和EPS的UV-Vis光譜，兩種方法的結(jié)果一致。EDTA提取方法中，細(xì)菌的UV－Vis峰強(qiáng)度在提取前后沒(méi)有變化，EPS溶液中也沒(méi)有新的色素峰出現(xiàn)，說(shuō)明基本沒(méi)有細(xì)胞被破壞。由于UV－Vis光譜測(cè)定方便快速，可以用來(lái)監(jiān)測(cè)在EPS提取過(guò)程中細(xì)胞的溶解情況。關(guān)鍵詞：胞外聚合物；光合細(xì)菌；UV-Vis光譜；蛋白；核酸；多糖；提取ExtractionoftheextracellularpolymericsubstancesfromaphotosyntheticbacteriumRhodopseudomonasacidophilaAbstract:Amongthefivemethodsforextractingextracellularpolymericsubstances(EPS)fromRhodopseudomonasacidophilausingEDTA,NaOH,H2SO4,heatingandhighspeedcentrifugation,EDTAextractionwasfoundtobethemosteffectivemethodbecauseofhigherextractionefficiencyandlowercelllysis.ThecontentsofthemajorcomponentsofEPSfromR.acidophila,i.e.,carbohydrate,proteinandnucleicacid,were6.5,58.4and5.4mg/gdrycell,respectively.Thefeasibleextractiontimewas1-3handtheEDTAdosagewasabout2.8g/gdrycellsforEDTAextraction.Twomethods,i.e.thecontentofnucleicacidandUV-Visspectrum,wereusedtoevaluatecelllysisduringextraction.TheabsorptionpeaksforphotosyntheticpigmentsinUV-VisspectrumseemednochangepriortoandafterEDTAextraction,andnopigmentpeaksappearedinthespectrumofEPS,indicatingthatfewcellsweredestroyedandthatlysisdidnotoccurduringEDTAextraction.TheUV-VisspectrumcouldbeusedtomonitorthecelllysisduringEPSextractionfromRacidophila.Keywords:Carbohydrate;Extracellularpolymericsubstances;Extraction;Nucleicacid;Rhodopseudomonasacidophila;UV-Visspectrum;Protein微生物利用有機(jī)廢水產(chǎn)氫已經(jīng)引起了人們廣泛的興趣，其中光合細(xì)菌（PSB）被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的一種產(chǎn)氫微生物，文獻(xiàn)中報(bào)道一些光合細(xì)菌，例如Rhodobactersp.[1]，能夠利用低級(jí)有機(jī)酸作為電子受體，光作為能源，產(chǎn)生氫氣。從應(yīng)用觀點(diǎn)看，光合細(xì)菌要能夠在光反應(yīng)器中生長(zhǎng)和連續(xù)產(chǎn)氫，反應(yīng)器中微生物必須保持一定的濃度，但是，由于光合細(xì)菌的絮凝沉降性能不好[2]，不能有效的和溶液分離，在產(chǎn)氫光反應(yīng)器中，光合細(xì)菌一般濃度都很低。為了解決這個(gè)問(wèn)題，必須研究PSB的絮凝沉降特性。細(xì)菌的絮凝性能和胞外聚合物（EPS）有很大的關(guān)系。EPS是吸附在細(xì)菌表面的一些高分子聚合物（Mw>10000），主要來(lái)源是微生物分泌、細(xì)胞產(chǎn)物自溶和廢水中的有機(jī)物的吸附[3]。EPS的主要成分是多糖、蛋白和核酸，它們的含量對(duì)細(xì)菌的絮凝性能有著顯著的影響。EPS的研究最早應(yīng)用于好氧活性污泥中，到目前為止，對(duì)水處理中好氧活性污泥和厭氧污泥、顆粒污泥、生物膜等已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[4－6]，但是對(duì)光合細(xì)菌的EPS特性研究很少。Watanabe等人[2]分離了一株海洋光合細(xì)菌，Rhodovulumsp.，并且研究了它的絮凝特性，他們認(rèn)為胞外核酸的含量是影響光合細(xì)菌絮凝性能的最主要因素，但該株細(xì)菌能不能產(chǎn)氫沒(méi)有報(bào)道。本文選用了一株產(chǎn)氫光合細(xì)菌Rhodopseudomonsaacidophila，比較了幾種常用的不同的EPS提取方法的提取效率?；诒容^結(jié)果，選擇EDTA作為提取方法，進(jìn)一步研究提取時(shí)間和提取劑用量的對(duì)EPS提取的影響。而且，對(duì)EPS的UV-Vis和紅外光譜特性也進(jìn)行的簡(jiǎn)單的研究，并且提出了一個(gè)簡(jiǎn)單方便的方法，用來(lái)判斷提取過(guò)程中的細(xì)胞破壞程度。1．材料與方法1.1光合細(xì)菌R.acidophila,從中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所購(gòu)得。這株光合細(xì)菌能夠利用乙酸、丙酸、丁酸產(chǎn)氫。在4000Lux，30oC下，當(dāng)?shù)孜餅?.8g/l乙酸、1.0g/l丙酸、0.4g/l丁酸的混和酸時(shí)，在208小時(shí)以?xún)?nèi)，該P(yáng)SB能夠產(chǎn)生494ml氫氣，最大產(chǎn)氫速率為21.9ml/l/h。生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分為(每升)：KH2PO40.5g,K2HPO40.6g,NaCl0.4g,MgSO4?7H2O0.2g,CaCl2?2H2O0.05g,(NH4)2SO41.25g,琥珀酸鈉9.8g，1ml微量元素溶液。培養(yǎng)基的pH為7.0，培養(yǎng)溫度32oC，光照強(qiáng)度3000Lux，充氬氣保持厭氧環(huán)境。1.2EPS的提取方法采用五種方法從R.acidophila提取EPS，即EDTA、NaOH、H2SO4、熱處理和高速離心。分別取40mlPSB培養(yǎng)液，12000rpm，4oC離心10min，菌體用0.9%NaCl溶液洗滌兩次，然后重懸于10ml二蒸水中，再分別加入一定量的EDTA(2%)、NaOH(1N)、H2SO4(8%)溶液，4oC放置提取3h。為了比較，另取兩份，分別采用熱提取(70oC，1h)和高速離心方法提取EPS。然后，將細(xì)菌EPS溶液經(jīng)4oC12000rpm離心15min，除去剩余的細(xì)菌，上清液為EPS溶液。因EDTA干擾蛋白的測(cè)定，將EDTA提取的EPS溶液對(duì)二蒸水透析過(guò)夜。最后，將所得的EPS溶液經(jīng)0.45μm醋酸纖維素膜過(guò)濾，再進(jìn)行成分分析。1.3分析方法多糖用蒽酮法測(cè)定，蛋白用Lowry法測(cè)定，核酸含量用紫外吸收法測(cè)定。Ca2+和Mg2+用原子吸收法測(cè)定(WFx-120，Rayleigh分析儀器公司)。為了測(cè)定EPS的紅外光譜，將兩倍預(yù)冷乙醇加入EPS溶液中，沉淀重懸于雙蒸水中，透析過(guò)夜，再用乙醇沉淀，沉淀物用乙醇洗滌兩次，最后真空干燥。干燥的沉淀物用于IR分析(VECTOR22,Bruker公司)。UV－Vis光譜用島津UV-2401PC儀器分析。2.結(jié)果與討論：2.1提取方法的比較不同提取方法的比較結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，提取出的EPS量和提取方法有很大關(guān)系，其中，NaOH法，提取的EPS最多，熱處理和EDTA法次之，H2SO4法和高速離心最少。一個(gè)好的提取方法，不但提取效率要高，而且對(duì)細(xì)胞的破壞要少，一般核酸的含量用來(lái)評(píng)價(jià)提取過(guò)程中細(xì)胞破壞程度[7]。上述五種提取方法中，提取的EPS溶液中核酸含量大小順序?yàn)椋篘aOH>熱提取>EDTA>H2SO4>離心。用NaOH提取EPS，核酸的含量是用離心法的9.6倍，說(shuō)明提取過(guò)程中細(xì)胞破壞嚴(yán)重，大量提取出來(lái)的EPS其實(shí)是胞內(nèi)物質(zhì)。同樣，熱提取的EPS中，核酸含量也很高。EDTA法、硫酸法和離心法對(duì)細(xì)胞破壞少，但是硫酸法和離心法提取的EPS量很少，提取效率低，不是一種有效的提取方法。結(jié)果表明，EDTA的提取效率高，對(duì)細(xì)胞的破壞少，是一種從R.acidophila中提取EPS的有效方法，比其他幾種方法要優(yōu)越。用EDTA提取的EPS中多糖，蛋白、核酸的含量分別為6.5,58.4和5.4mg/g干重。在以后的實(shí)驗(yàn)中，都采用EDTA法來(lái)提取EPS。從表中還可以看出，用不同的提取方法，提取的EPS量在12.9~159.2mg/g干重中變動(dòng)，同樣多糖蛋白比值在0.06~1.71范圍內(nèi)。由上述討論可知，EPS的提取方法和操作步驟同時(shí)影響提取的EPS的成分和含量。表1.不同方法從R.acidophila中提取的EPS的含量(mg/g干重)與多糖/蛋白比EDTANaOHH2SO4熱提取高速離心多糖6.57.710.610.34.1蛋白58.4126.66.237.76.2核酸5.424.94.623.62.6總EPS70.3159.221.471.612.9多糖/蛋白0.110.061.710.270.66從R.acidophila中提取的EPS中，蛋白的含量和Watanabe等人[2]從海水中分離的Rhodovulumsp.的EPS中蛋白含量基本相同，但是多糖和核酸的含量卻小于Rhodovulumsp.的EPS中的，Rhodovulumsp.的EPS中多糖/蛋白約為0.6，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于R.acidophilaEPS中的多糖/蛋白0.11。由于Rhodovulumsp.具有良好的絮凝性能，而R.acidophila絮凝性能相對(duì)較差，EPS的含量和物質(zhì)成分的差別可能也是一部分原因，Watanabe等認(rèn)為胞外核酸在細(xì)菌的絮凝性能中起主導(dǎo)作用。2.2提取時(shí)間和提取劑用量的影響從圖1和2可以看出，EPS中蛋白含量受提取時(shí)間和提取劑用量影響很大，而多糖和核酸幾乎不受影響。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)1h，EPS的含量基本保持不變，維持在48.4，7.5和7.3mg/g干重左右。EDTA的提取速度快，可能是由于EDTA和二價(jià)離子的絡(luò)合反應(yīng)速度很快。從圖2(A)中可以得出，當(dāng)EDTA的用量從0.8增加到2.8g/g干重時(shí)，EPS的量也從29.9迅速增加到84.3mg/g干重，然而當(dāng)EDTA用量繼續(xù)增加時(shí)，提取的EPS的量基本保持不變。這和細(xì)菌培養(yǎng)液中多價(jià)離子含量有限有關(guān)，當(dāng)多價(jià)離子都被EDTA絡(luò)合后，再增加EDTA的量，將不會(huì)顯著的提高EPS的提取效率。從圖2(B)中可以看出，Ca2+和Mg2+的含量隨著EDTA的用量增加而增加，到2.8g/g干重之后，這些二價(jià)離子的濃度都基本上保持不變或略有降低。這些二價(jià)離子的濃度和蛋白的濃度有一定的相關(guān)性，EPS中Ca2+和Mg2+的含量增高，蛋白的含量也增大，說(shuō)明在細(xì)菌EPS中，這些二價(jià)離子是主要和蛋白結(jié)合的，因?yàn)樵谥行詶l件下，蛋白質(zhì)的羧基會(huì)離解而帶負(fù)電，然后就靠這些二價(jià)離子通過(guò)離子橋接把EPS和細(xì)菌結(jié)合在一起。當(dāng)EDTA除去這些離子時(shí)，EPS也就隨之釋放到溶液中去了。圖1.提取時(shí)間對(duì)EPSS量的影響圖2.提取劑用量的影響響：(A)EPS量；(B)Caa2+和Mg2+含量EPS中三種主要物質(zhì)的提取難易程度也有所不同，從圖2可以看出，用EDTA提取，多糖和核酸比較容易提取，在少量的EDTA存在下，較短的時(shí)間就能提取比較完全，而蛋白比較難提取，很大的EDTA劑量才能提取比較完全。這說(shuō)明，提取的操作也同時(shí)影響著提取的EPS的量和成分。2.3EPS紅外光譜圖3是從R.acidophila中提取的EPS的紅外光譜圖。譜圖中有五個(gè)很明顯的峰：3422，2923，1635，1395，1055cm-1，其中3422處峰是OH伸展振動(dòng)產(chǎn)生的，2923處的較弱的峰是C－H振動(dòng)峰，而1635和1395處是羧基中C=O不對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸展振動(dòng)峰。處于1000~1200處的吸收峰一般為糖衍生物的典型吸收峰。從紅外光譜譜圖中，我們可以知道，EPS中含有的最主要的活性基團(tuán)是羧基和羥基。2.4UV－Vis光譜圖3.R.accidophhila的EPS的紅外光譜譜圖4.A：EPSS提取前后R.aciddophilla溶液UV-Viis光譜；B：EDTA和NaOH提取的EPSUUV－Vis光譜圖4(A)為PSB提取前和經(jīng)EDTA和NaOH提取后的UV-Vis光譜圖，圖4(B)為從PSB中提取的EPS的Uv-Vis譜圖。從圖4(A)可以看到細(xì)胞色素的幾個(gè)典型吸收峰，590，800，860nm，如果在提取過(guò)程中細(xì)胞被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏出來(lái)，則提取前后細(xì)胞的吸收峰強(qiáng)度在譜圖上就應(yīng)該可以看出發(fā)生了改變，而且在EPS譜圖上應(yīng)該也可以觀察到類(lèi)似的吸收峰，因而，可以利用UV－Vis譜圖來(lái)判斷提取過(guò)程對(duì)細(xì)胞的破壞程度。從圖上可以看出，EDTA提取前后細(xì)胞色素峰的強(qiáng)度幾乎沒(méi)有改變，EDTA提取的EPS的UV-Vis譜圖上也沒(méi)有色素峰的出現(xiàn)；而經(jīng)過(guò)NaOH提取，細(xì)胞懸浮液的峰強(qiáng)度明顯減弱，甚至消失，而在NaOH提取的EPS譜圖上，液可以看到有色素峰的出現(xiàn)。這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明，EDTA提取方法對(duì)細(xì)胞破壞少，而NaOH方法細(xì)胞破壞卻很?chē)?yán)重，這個(gè)結(jié)果也和前述核酸數(shù)據(jù)相符。細(xì)胞破壞程度是判斷一種提取方法是否恰當(dāng)?shù)囊粋€(gè)重要指標(biāo)，很難估計(jì)，缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)判斷方法。以前一般用蛋白或者核酸的含量來(lái)判斷，但是EPS本身中也含有大量的蛋白和核酸，所有這種方法并不是很恰當(dāng)，后來(lái)有用ATP或葡萄糖－6－磷酸脫氫酶這些胞內(nèi)物質(zhì)的含量來(lái)判斷[7]，可是這些物質(zhì)的測(cè)量方法都很費(fèi)時(shí)費(fèi)事，使用中受限。UV－Vis作為一種快速方便的方法，可以用來(lái)評(píng)價(jià)EPS提取過(guò)程中的細(xì)胞破壞程度。3.結(jié)論：從R.acidophilaEPS的提取方法比較來(lái)看，EDTA法的提取效率高，對(duì)細(xì)胞的破壞程度小，是一種較好的提取EPS的方法。用EDTA法提取的EPS量為70.3mg/g干重。EDTA的適宜提取時(shí)間約為1～3h，提取劑量約為2.8gEDTA/g干重。提取方法，提取時(shí)間和提取劑的用量都會(huì)影響提取的EPS的量和成分。同樣，從EPS和細(xì)菌的UV－Vis數(shù)據(jù)中同樣可以看出，EDTA對(duì)細(xì)胞的破壞較小，而NaOH破壞很大。提取過(guò)程中細(xì)胞的破壞程度是判斷一種提取方法優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，但目前缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)判斷方法，UV－Vis法作用一種方便快速的方法，有可能用來(lái)判斷EPS提取過(guò)程中細(xì)胞的破壞程度。參考文獻(xiàn)[1]ErogluI,AslanK,GunduzU,YucelM,TurkerL.SubstrateconsumptionratesforhydrogenproductionbyRhodobactersphaeroidesinacolumnphotobioreactor.JBiotechnol,1999,70:103-113[2]WatanabeM,SasakiK,NakashimadaY,KakizonoT,NoparatnarapornN,NishioN.GrowthandflocculationofamarinephotosyntheticbacteriumRhodovulumsp.ApplMicrobiolBiotechnol,1998,50:682-691[3]MorganJW,ForsterCF,EvisonL.Acomparativestudyofthenatureofbiopolymersextractedfromanaero