磁性納米材料的細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測(cè)

會(huì)計(jì)學(xué)1磁性納米材料的細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測(cè)2小尺寸效應(yīng)：小尺寸效應(yīng)(Smallsizeeffect)，當(dāng)顆粒的尺寸與光波波長(zhǎng)、德布羅意波長(zhǎng)以及超導(dǎo)態(tài)的相干長(zhǎng)度或透射深度等物理特征尺寸相當(dāng)或更小時(shí)，晶體周期性的邊界條件將被破壞，非晶態(tài)納米粒子的顆粒表面層附近的原子密度減少，導(dǎo)致聲、光、電、磁、熱、力學(xué)等特性呈現(xiàn)新的物理性質(zhì)的變化稱為小尺寸效應(yīng)。對(duì)超微顆粒而言，尺寸變小，同時(shí)其比表面積亦顯著增加，從而產(chǎn)生如下一系列新奇的性質(zhì)。小尺寸效應(yīng)特殊的光學(xué)性質(zhì)特殊的熱學(xué)性質(zhì)特殊的磁學(xué)性質(zhì)特殊的力學(xué)性質(zhì)第1頁(yè)/共13頁(yè)3磁導(dǎo)向性：

人們發(fā)現(xiàn)鴿子、海豚、蝴蝶、蜜蜂以及生活在水中的趨磁細(xì)菌等生物體中存在超微的磁性顆粒，使這類生物在地磁場(chǎng)導(dǎo)航下能辨別方向，具有回歸的本領(lǐng)。磁性超微顆粒實(shí)質(zhì)上是一個(gè)生物磁羅盤，生活在水中的趨磁細(xì)菌依靠它游向營(yíng)養(yǎng)豐富的水底。通過(guò)電子顯微鏡的研究表明，在趨磁細(xì)菌體內(nèi)通常含有直徑約為2′10-2微米的磁性氧化物顆粒。小尺寸的超微顆粒磁性與大塊材料顯著的不同，大塊的純鐵矯頑力約為80安／米，而當(dāng)顆粒尺寸減小到2′10-2微米以下時(shí)，其矯頑力可增加1千倍，若進(jìn)一步減小其尺寸，大約小于6′10-3微米時(shí)，其矯頑力反而降低到零，呈現(xiàn)出超順磁性。利用磁性超微顆粒具有高矯頑力的特性，已作成高貯存密度的磁記錄磁粉，大量應(yīng)用于磁帶、磁盤、磁卡以及磁性鑰匙等。利用超順磁性，人們已將磁性超微顆粒制成用途廣泛的磁性液體。第2頁(yè)/共13頁(yè)4二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

使學(xué)生掌握用動(dòng)物細(xì)胞評(píng)價(jià)生物納米材料生物相容性的方法技術(shù)。具體檢測(cè)小鼠單核巨噬細(xì)胞對(duì)磁納米材料的細(xì)胞氧化應(yīng)激。要求學(xué)生掌握MTT測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的方法、普魯士藍(lán)染色法和超薄切片透射電鏡觀察法分析磁性納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的技術(shù)，以及檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激的一些主要指標(biāo)及技術(shù)。包括（1）分光光度法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶，丙二醛，黃嘌呤氧化酶的含量（2）細(xì)胞流式儀測(cè)定自由基產(chǎn)生（3）熒光酶標(biāo)儀測(cè)定線粒體損傷。第3頁(yè)/共13頁(yè)5三、實(shí)驗(yàn)原理：

1、普魯士藍(lán)染色：原理：鐵離子遇到亞鐵氰根會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀。2、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)：四挫鹽比色實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。實(shí)驗(yàn)所用的顯示劑四挫鹽是一種能接受氫原子的燃料，化學(xué)名3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮挫溴鹽，商品名是噻挫藍(lán)，簡(jiǎn)稱為MTT?；罴?xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶解的紫藍(lán)色結(jié)晶物并沉積在活細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。第4頁(yè)/共13頁(yè)6

3、超氧化物歧化酶測(cè)定SOD對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。此酶能清楚超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，該試劑采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力?？蓽y(cè)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的血清（漿）、腦脊液、胸水、腹水、腎透析液、尿液、精液、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、心肌培養(yǎng)細(xì)胞，腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞，各種動(dòng)植物細(xì)胞，及亞細(xì)胞水平中的SOD活力。通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化氫胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)其吸收度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸亞減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。第5頁(yè)/共13頁(yè)7四、實(shí)驗(yàn)材料：1.12nm的Fe3O4處理細(xì)胞2.小鼠單核巨噬細(xì)胞3.普魯士藍(lán)染液A4.0.1%核固紅染液配方5.普魯士藍(lán)染液B6.4%多聚甲醛配方7.0.2MPBS配方8.固定液配方9.3-（4,5-二甲基噻挫-2）-2,5-二苯基四氮噻溴鹽，商品名噻挫藍(lán)，簡(jiǎn)稱MTT10.二甲基亞砜11.超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒12.微量丙二醛測(cè)定試劑盒13.黃嘌呤氧化酶測(cè)定試劑盒14.細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè)15.線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒第6頁(yè)/共13頁(yè)8五、實(shí)驗(yàn)步驟：1.

普魯士藍(lán)染色（1）RAW264.7貼壁培養(yǎng)一天，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；（2）加入不同濃度的納米粒子，一定時(shí)間后，光鏡下觀察下觀察納米粒子的攝入情況。（3）PBS洗滌納米粒子干預(yù)后的細(xì)胞（4）4%多聚甲醛固定10min（5）棄去多聚甲醛，PBS再次洗滌（6）普魯士藍(lán)染色（A液和B液等體積混合，靜置5min后即可使用）染色20min（7）棄去普魯士藍(lán)染液，PBS再次洗滌（8）核固紅復(fù)染10min（9）棄去核固紅染液，PBS再次洗滌（10）顯微鏡下觀察，拍照。第7頁(yè)/共13頁(yè)92.

電鏡檢查方法：（1）胰酶收集納米粒子干預(yù)好的細(xì)胞（2）PBS清洗一遍（3）PBS和固定液等體積混合的液體清洗一遍，棄上清；（4）加入固定液，沉淀在固定液底部，過(guò)夜（5）1%鋨酸再固定1h（6）丙酮梯度脫水（7）Epon-812樹(shù)脂包埋（8）半薄切片定位（9）70nm超薄切片（10）醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色（11）JEM-1200透射電鏡觀察第8頁(yè)/共13頁(yè)10六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果