大二下-微免實驗孫子須

微生物學與免疫學試驗（二）嚴沁

大吞噬實驗（單核巨噬細胞對大顆粒異物的吞噬）小吞噬實驗（中性粒細胞對小顆粒異物的吞噬）

1、天然免疫/固有免疫/非特異性免疫：①解剖學屏障結構：皮膚、黏膜、胃酸……②固有免疫細胞：吞噬細胞、DC、NK細胞……③固有免疫分子：補體、細胞因子……2、獲得性免疫/適應性免疫/特異性免疫:①T淋巴細胞——細胞免疫②B淋巴細胞——體液免疫免疫應答實驗內容示教/錄像：淋巴細胞轉化實驗、E花環(huán)形成實驗示教：沉淀反應——單向瓊脂擴散、火箭電泳、

雙向瓊脂擴散操作：沉淀反應——對流免疫電泳操作：凝集反應——玻片凝集反應一、淋巴細胞轉化試驗

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示教、錄像有絲分裂原縮寫淋巴細胞增殖反應T淋巴細胞B淋巴細胞植物血凝素PHA++-刀豆蛋白AConA++-葡萄球菌A蛋白SPA-+美洲商陸PWM+++檢測人外周血T淋巴細胞功能的體外試驗。一、淋巴細胞轉化試驗

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示教、錄像原理：利用人外周血T淋巴細胞表面的有絲分裂原受體與相應絲裂原在體外結合后，可使細胞轉化為淋巴母細胞，表現(xiàn)為體積增大、胞漿豐富、并能進行有絲分裂。根據(jù)其轉化的程度和轉化率，可測定機體的細胞免疫功能狀態(tài)。正常人淋巴細胞轉化率約為70％。分型：（1）小淋巴細胞：核質密、胞漿少、無核仁（2）過渡型：比小淋巴細胞略大、核質略疏松，有核仁（3）淋巴母細胞：大4～5倍，核質疏松，核仁1～3個，核周淡染的透明區(qū)，胞漿網(wǎng)狀可見空泡（4）分裂相：染色體型一、淋巴細胞轉化試驗

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示教、錄像二、E花環(huán)形成試驗

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示教、錄像檢測人類外周血T細胞數(shù)量的一種體外試驗方法原理：利用人類T淋巴細胞表面具有綿羊紅細胞受體，可非特異性吸附綿羊紅細胞。顯微鏡下可見以T細胞為中心，周圍環(huán)繞綿羊紅細胞，形似花環(huán)，即為E花環(huán)。一個E花環(huán)形成細胞即為一個T細胞。正常人外周血中E花環(huán)形成細胞約占淋巴細胞總數(shù)的60％～80％。血清學反應

一、概念

血清學反應（serologicreactions）是指相應的抗原和抗體在體外進行的結合反應。由于抗體主要存在于血清中，進行這類反應時一般都要用含有抗體的血清作為實驗材料，所以把體外的抗原、抗體反應稱為血清學反應。

二、一般特點：特異性、可逆性、可見性

三、影響因素：濃度、比例、電解質、

溫度、酸堿度

四、基本類型

（一）沉淀反應：環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、瓊脂擴散、

免疫電泳

（二）凝集反應：直接凝集反應、間接凝集反應

（三）補體結合試驗

（四）中和反應

（五）免疫標記技術

血清學反應沉淀反應（precipitationtest）

一、概念

可溶性抗原（如血清、毒素、細菌滲出液等）與相應抗體結合，在有適量電解質存在下，若二者比例適當，經(jīng)過一定時間形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應。

二、重要的沉淀反應試驗

1、單向瓊脂擴散

2、火箭電泳

3、雙向瓊脂擴散

4、對流免疫電泳

}}定量定性單向瓊脂擴散

（singleagardiffusion）

將一定量已知抗體混于瓊脂中，制板，在適當位置打孔，將抗原加入孔中向四周自由擴散，與板中抗體相遇，在比例合適處呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。

單向瓊脂擴散試驗是一種定量試驗，主要用于測定血清各種Ig和補體成分的含量

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（rocketelectrophoresis）

將一定量已知抗體混于瓊脂中，制板，在板的一端打一排小孔，加入待檢樣品，置于陰極端進行電泳?？乖谟緞舆^程中，與抗體在比例合適部位形成錐形沉淀峰，狀如火箭，稱火箭電泳，又稱為單向定量免疫電泳。沉淀峰的高低與抗原的濃度成正比。

本法敏感度與單擴相仿，但需時較短。

雙向瓊脂擴散

（doubleagardiffusion）

在瓊脂板上打孔，抗原和抗體分別加到相應孔中，二者自由向四周擴散，在比例合適處形成沉淀線。若同時含有若干對抗原抗體系統(tǒng)，可出現(xiàn)多條沉淀線。

雙向瓊脂擴散是一種定性試驗，可用于分析和鑒定標本中多種未知抗原成分，也可用已知抗原檢測未知抗體。雙向瓊脂擴散

（doubleagardiffusion）三、對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

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操作一、原理：抗原抗體在一定的pH溶液中帶有電荷，在電場的作用下可發(fā)生定向移動。將抗原抗體加入pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體只帶有微弱的負電荷，而且它的分子量又較大，所以泳動慢。更重要的是抗體分子受電滲作用影響較大，也就是說電滲作用大于它本身的遷移率。在電泳時，抗體不但不能抵抗電滲用向正極移動，反而向負極倒退。而一般抗原蛋白帶負電荷，將抗原置于負極，將抗體置于正極，電泳后則在兩孔之間相遇，并在比例適當?shù)牟课恍纬扇庋劭梢姷某恋砭€。

二、操作1、材料瓊脂板1塊/2人，打孔器2個/組抗AFP血清——已知AbAFP陽性血清——陽性Ag對照陰性血清——陰性Ag待檢血清：標本1——未知Ag

標本2——未知Ag三、對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

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操作2、方法－＋AgAbAgAb>1.5cm>1.5cm陰性陽性標1陰性標2陽性1、制板：用吸管吸取溶化的瓊脂加于載玻片上，約3.5mm（已備）2、打孔：用金屬打孔器打兩排孔，Ag孔與Ab孔間距離為4~5mm3、加樣：將抗AFP血清加入Ab孔內，將AFP陽性血清、對照陰性血清、待檢血清1和2分別加入相應Ag孔內。（如圖所示）*注意：每孔約加入10ul，加樣時切勿溢出孔外！4、電泳：將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，Ag孔置陰極端，Ab孔置陽極端。5、關閉電源，取出瓊脂板，觀察結果4mm4mm3、結果：在相應Ag、Ab孔間可見白色沉淀線。*記錄觀察結果后，請將瓊脂板上瓊脂刮入固體垃圾盆，統(tǒng)一放入前面的瓷缸里！三、對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)

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操作

凝集反應（agglutinationtest）一、概念：

顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細胞等）與相應抗體結合，在有電解質存在的條件下，經(jīng)過一定時間，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。二、類型直接凝集反應：顆粒性抗原+抗體玻片法：定性（操作）試管法：半定量間接凝集反應：可溶性抗原/抗體+微球載體（與免疫無關）

顆粒性抗原+抗體/抗原{↓四、直接凝集反應——玻片凝集

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操作材料：玻片1張/1人，1號、2號菌，抗痢疾桿菌診斷血清方法：取生理鹽水4-5環(huán)，加入血清4-5環(huán)，刮取少許菌苔混勻

輕搖玻片，1～2分鐘后觀察結果判定：出現(xiàn)乳白色凝集塊為陽性反應*玻片扔進水池旁臺上的玻璃缸里！

實驗結束后泡手消毒！1號菌液＋診斷血清2號菌液＋診斷血清1、示教：作圖（淋巴細胞轉化實驗、E花環(huán)形成實驗、單向瓊脂擴散、雙向瓊脂擴散、火箭電泳）2、操作：步驟、作圖、結果分析（對流免疫電泳、玻片凝集反