flowjo應(yīng)用常見問題及其解答

210722012-7-2513:27|個人分類:FlowJo|系統(tǒng)分類:周期青，F(xiàn)lowJo技術(shù)專1.點擊坐標軸旁邊的“T”按鈕，選擇“Changedisplayedparameter在彈出框中輸入坐標軸范2.直方圖中怎樣調(diào)整Y軸的范在圖形窗口中打開“opton”選項，在“YAxis”中選擇“Auto”或者“Manual”，自動，軟件能自動調(diào)整Y軸的范圍，將整個直方圖顯示出來Manual：手動需要在后面的“Max”選項中手動輸入Y軸標度的最大值，然后按“回車鍵”確認。比如，在此需要將“Max”值設(shè)為160博給我留發(fā)送消 FlowJoFlowJo 流式細胞技術(shù)相關(guān)資 ，流式細胞數(shù)據(jù)分析，流式技術(shù)支持及培博客首動博相好作者的其他博 全高端流式研討會，你會參一首非常好聽的歌，必flowjo中國流式小組第二次活動（流式細胞技術(shù)培訓(xùn)課通知(第四屆東南亞國家流式熱門博文導(dǎo) 全減招會熔斷嗎向XU館長等求教：學術(shù)谷狗教育公平背后的5：什么是公平？說說高流式細胞儀(Flow文獻數(shù)據(jù)庫的標引質(zhì)量問逃還是不逃，這是一個問科研人員在成果保護中存在該怎么回答孩子“是一案-娼問題是關(guān)鍵問備注：關(guān)于FlowJo調(diào)整坐標軸的詳細內(nèi)容請參考博文：FlowJo如何調(diào)整在布局頁中右鍵單擊某個細胞群的圖，在彈出的下拉菜單中選擇 輸出圖形時怎樣自動對在布局頁中選中需要對齊的多個圖形，到布局頁的“排齊”菜單中選擇對齊的類型，常用的有：頂端對齊(Tops)、底部對(Bottoms)、左對齊(Lefts)、右對齊輸出的格式有哪幾種，哪種的分辨率最ungroup，進行單個編輯，不過插入PPT后，轉(zhuǎn)變?yōu)镻PT可識別的圖，將會降低分辨率。如果是用作文章的話，建議將保存為PDF格式，再在專業(yè)的編輯器如Photoshop或者Illustrtor里面進行編輯，再輸出為雜志要求的文件格式，一般為JPG,現(xiàn)在也有雜志傾向于接收PDF。FlowJo默認的圖形輸出格式為PNG格式，如果需要更改，到“編輯”菜單欄里選擇“偏好設(shè)置>文件格式”，在“布局編輯器的輸出格式類型中選擇是否可以調(diào)整偽中每個點所表示的細胞個數(shù)，即調(diào)整點的數(shù)目，使其分辨率更不可以調(diào)整。但是 Plot可以調(diào)整。(具體內(nèi)容請參考博文：如何比較不同細胞數(shù)目的流式數(shù)據(jù)應(yīng)用模板分析數(shù)據(jù)時，導(dǎo)入數(shù)據(jù)之后，布局編輯器里的圖形批處理結(jié)果顯示為 在這個例子中，在布局頁中選擇“Exp1”，然后點擊“Batch”按鈕，重新Mean,Median,Mode,Geom.Mean的區(qū)Mode mean：幾何平均數(shù)，是指n個觀察值連乘積的n次，計算公式為在標準的分布情況下，Median=mean=mode.通常在流式中因為總會有異常值（或者超低值）的存在，不是完美的分布，建議使用Median，降低異常值對數(shù)據(jù)的影響。不影響。同一組實驗中的不同樣本，目標細胞群的位置和分布范圍可能會有變化，在設(shè)門的時候，需要將目標細胞群都劃在門內(nèi)；而在分析數(shù)據(jù)的時候，是以統(tǒng)計學方法分析整個細胞群的分布情況，得到百分比以及平均熒光強度等數(shù)據(jù)。因此不會影響可比性。沒有補償對照單染管（單染樣本或者單染Beads）是否可以用FlowJo調(diào)補不可以。不論是在儀器上調(diào)補償，還是在軟件比如FlowJo上調(diào)補償，都必需實際實驗的時候，單染管沒有明顯的雙峰分布，應(yīng)該怎么調(diào)補如果沒有明顯的雙峰分布，在設(shè)門界定群和陽性群的時候：應(yīng)使用區(qū)域門進行設(shè)門，群和陽性群之間的距離要盡量遠一些， 群不要包含極低值區(qū)域，陽性群不要包含極高值區(qū)域。如下圖所示：關(guān)于用FlowJo做軟件補償請參考博文：FlowJo軟件熒光補怎樣才能確定FlowJo依據(jù)單染對照進行判定。以一個兩色實驗為例（FL1::CD3-FITC和FL2::CD4-PE），在補償之后，如果單染對照（比如FITC單染）中FITC陽性群和FITC群的中位數(shù)（MedianofFL2::CD4-PE）一致，說明補償準確。詳細內(nèi)容請參考博文：如何確定流式分析中熒光補償雙指數(shù)轉(zhuǎn)換中的3個參數(shù)分別表示什WidthBasis：寬度基底，為負值。在圖形顯示效果上反映了壓縮的程度。在Logile軸中，-10表示“-101~0段”以及“0~101段”以線性形式顯示，-100表示“-102~0段”以及“0~102段”以線性形式顯示，如下圖：左圖中WidthBass為-10，右圖中為-100Exranegatvedecades：附加負十進位，即在坐標軸中增加的負數(shù)段的數(shù)目?！?”表示增加1個負十進位段，如下圖：紅色方框中的部分為在坐標軸上增加1個負十進位段 decades：正十進位，表示正十進位的數(shù)目。左圖中Positivedecades為4，表示有4個正十進位段：101~102、102~103、103~104、104~105增大 Decades，能在二維圖中以更大的空間顯示低位段（0~101）的數(shù)CellRMSFlowJo沒有給出一個確定的RMS值范圍來判斷周期分析結(jié)果是否可用。RMS反映的是FlowJo擬合結(jié)果和實際數(shù)據(jù)的吻合程度，吻合得越好，RMS值越小。在進行周期分析的時候，如果數(shù)據(jù)比較好，F(xiàn)lowJo能自動擬合得到一個好的周期擬合結(jié)果，RMS值很小。如果數(shù)據(jù)不是很理想，需要不斷更改限制條件，使RMS值更小，模型擬合得更好。RMS是對同一個數(shù)據(jù)的不同擬合情況進行比較的，數(shù)值越小則擬合越好，不能用來比較不同數(shù)據(jù)間擬合的好壞。CVFlowJo擬合得到的CV值明顯高于CV為變異系數(shù)，反映的是峰的寬度。ModFit在呈現(xiàn)數(shù)據(jù)的時候，是將熒光強度的范圍歸并為256個Channel，因此在分析任何數(shù)據(jù)的時候，其坐標軸的范圍均為256。Flowo則是呈現(xiàn)實際的熒光強度，坐標軸的范圍依據(jù)具體數(shù)據(jù)的熒光強度來確定，大于256。因此FlowJo得到的CV值高于ModFit。下圖中為同一個數(shù)據(jù)分別用ModFit和FlowJo進行分析得到的結(jié)果，左邊為ModFit，右邊為FlowJoFlowJoFlowJo的周期模塊是專門用來分析細胞周期的，得到細胞周期各個時期的比例。分析細胞凋亡一般需要采用特定的方法，比如AnnexinV-FITC/PI雙標記法，用四分門設(shè)門方法來界定出凋亡細胞。具體內(nèi)容請參考博文：FlowJoFlowJoFlowJo在分析細胞周期的時候，能夠得到某一個細胞周期各個時期的比例。如果樣本中包含有多個不同的倍體（比如同時含有二倍體以及異倍體），該樣本中含有多個細胞周期，則需要借助其他的分析工具來分析?！皠?chuàng)建門”創(chuàng)建門之前，計算細胞周期各個時期的比例是根據(jù)擬合方程計算出來的。左圖為創(chuàng)建門之前的周期圖，其中G1期與S期有相交部分，對于相交的部分，是根據(jù)方程計算出其屬于G1期的可能性有多少，屬于S期的可能性有多少，然后再計算出G1期細胞所占的總的比例。創(chuàng)建門之后，如右圖，G1期、S期、G2期之間沒有相交的部分，而是硬性地設(shè)了一個門，明確規(guī)定出G1期、S期和G2期的范圍。因此，創(chuàng)建門之后，細胞周期各個時期的百分比會發(fā)生變化。如果周期分析的目的只是為了計算出細胞周期各個時期的比例，則不需要“創(chuàng)建門”如果周期分析之后，需要界定出G1期、S期、G2期的細胞，并對某個時期比如G1期的細胞做進一步分析，則需要“門”界定出各個時期的細胞。關(guān)于周期分析的內(nèi)容，請參考博文：FlowJo軟件分析細增殖分析章時采用哪個參增殖指數(shù)和指數(shù)的定義及其區(qū)別和關(guān)增殖指數(shù)（ProliferationIndex）：次數(shù)的總和除以發(fā)生過增殖的親代細胞數(shù)目指數(shù)（DivisionIndex）：次數(shù)的總和除以增殖發(fā)生前的細胞總數(shù)為什么默認的增殖峰的最大值為根據(jù)以往的研究結(jié)果，在CFSE法分析細胞增殖的實驗中，可分辨出的最多的增殖峰的數(shù)目為8本本 地址HYPE