克隆動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物課件

克隆動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物課件第一頁，共五十九頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第二頁，共五十九頁，2022年，8月28日Chapter1

概論第三頁，共五十九頁，2022年，8月28日Example.Geneconstruct

第四頁，共五十九頁，2022年，8月28日Example.microinjection第五頁，共五十九頁，2022年，8月28日Example.TransgeneanalysisBiopsyPCRanalysisSouthernblot第六頁，共五十九頁，2022年，8月28日Example.PhenotypicanalysisPhenotypicAnalysisonfoundersharboringGFPgene(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice第七頁，共五十九頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)基礎(chǔ)DNA重組技術(shù)胚胎操作技術(shù)動(dòng)物個(gè)體第八頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.1concept----轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源DNA引起的遺傳改變相關(guān)的遺傳改變外源DNA片段至少整合到一條染色體的一個(gè)位點(diǎn)上；外源DNA的插入使基因組中任何一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排；導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體，例如：一條人工染色體或者可以自我復(fù)制并傳遞給子細(xì)胞的非染色體DNA元件。第九頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.1concept----轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源DNA引起的遺傳改變無關(guān)的遺傳改變由于化學(xué)品的誘變作用導(dǎo)致基因發(fā)生改變；由于輻射作用導(dǎo)致基因發(fā)生改變；由于化學(xué)品或輻射的作用使染色體發(fā)生畸變；通過核移植交換遺傳物質(zhì)；使用基因治療技術(shù)導(dǎo)入DNA等等。第十頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.1concept----轉(zhuǎn)基因動(dòng)物隨機(jī)整合位置效應(yīng)拷貝數(shù)定點(diǎn)整合Integrationof

foreigngene第十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.1concept----轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名Founder(G0)G1,G2,…….人性化命名第十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因動(dòng)物微觀性：具體技術(shù)宏觀性：戰(zhàn)略決策第十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimalsVectorconstruct微觀角度第十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimalsTechniques微觀角度Pronuclearmicroinjection(原核注射）ICSI(卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)

)Cloning(nucleartransfer)SpermvectorRetrovirusvector第十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimalsanalysisofPhenotypeProspectedtisssuesororgansRelatedtissuesororgansWholetissuesororgans微觀角度第十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日目的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因方法純化技術(shù)臨床實(shí)驗(yàn)宏觀角度第十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Fromthegenetothetransgenicanimal轉(zhuǎn)：techniquesfortransgenesis“+”gene：transgenicanimals“-”gene：Knockoutmice“基因”:來源、構(gòu)建、純化宏觀角度第十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals轉(zhuǎn)基因動(dòng)物動(dòng)物：選擇物種(mouse,rat,livestock)動(dòng)物的生殖生理、生殖內(nèi)分泌、飼養(yǎng)管理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物founder的分子鑒定轉(zhuǎn)基因系的建立表型分析動(dòng)物福利宏觀角度第十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.3History第一階段：方法的建立Gurdonetal,Nature,1971,(蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA)---顯微注射技術(shù)的嘗試Jaenisch，PNAS,1974,1976，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠的囊胚，使病毒DNA整合到小鼠的基因組中，并傳遞給后代---不能廣泛應(yīng)用，只是少數(shù)ES細(xì)胞整合外源基因，部分組織有外源基因

Gordonetal,PNAS,1980;Brinsteretal,Cell,1981;Costantini&Lacy,Nature,1981;Wagneretal,PNAS,1981---顯微注射技術(shù)建立，基因結(jié)構(gòu)沒有合理和認(rèn)真的設(shè)計(jì)，不能分析基因的生理功能第二十頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.3History第二階段：轉(zhuǎn)基因小鼠模型及快速生長(zhǎng)家畜Palmiter,Brinster,Hammeretal,1982,Nature(MT-GH)---超級(jí)小鼠其它功能基因---基礎(chǔ)研究中一直使用Hammeretal,1985,

Nature(rabbit,sheep,pig)GH為主，開始關(guān)注轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的病理變化第二十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.3History第三階段：乳腺反應(yīng)器（目前正在開發(fā)的產(chǎn)品）異種器官移植Simmonsetal,1987,

NatureSheepbeta-lactoglobulininmousemilkGordonetal,1987,BiotechnolHumantPAinthemilkofmousePPL,1991humanAATinthemilkofsheep第二十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.3History第三階段：異種器官移植(pig)

乳腺反應(yīng)器TMtransgenemiceDenningetal2001,NatBiotech.(GT&PrP)Daietal,2002,NatBiotech(GT-outpig)Laietal,2002,Science(GT-outpig)第二十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.3History第四階段：Knockout/Knockinmice(ES,NT)Livestock(克隆技術(shù)的入盟)1987，Thomas&Capecchi，Cell1987，Doetschmanetal,Nature

1989，Thompsonetal,Cell至2004年10月，約10%的mousegenome實(shí)現(xiàn)了Knockout第二十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimals1.3History第四階段：Knockout/Knockinmice(ES,NT)

Livestock(克隆技術(shù)的入盟)Schniekeetal1997,McCreathetal2000,Science(F-IX)

Nature(AAT)第二十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日基因治療與治療性克隆細(xì)菌發(fā)酵工程細(xì)胞工程克隆技術(shù)干細(xì)胞技術(shù)Transgenesis與相關(guān)技術(shù)第二十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimalsWhyproducetransgenicanimals人為地制造自然界不存在的突變分析異常表型變化推測(cè)原因加以利用1.2意義第二十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日Part1.transgenicanimalsToobtainfundationalinformationonlivingorganismsandhumandiseases.解析哺乳類基因的功能(genefunction)研究生理系統(tǒng)的遺傳調(diào)控(mechnisms)建立人類遺傳疾病的模型(addedorinactivated)Touseanimalsasasourceofpharmaceuticalproteins,cellsandorgans（乳腺反應(yīng)器）Toimproveanimalproduction（育種）1.7Applications第二十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.1.Examplesinbasicresearch1.7ApplicationsgeneadditionorreplacementProjectofknockoutmice第二十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7Applicationsgeneticdiseases：cysticfibrosis,CFTRgenemutation(needGM-rabbit,-sheep),

(mice不行,有chloridechannelcompensation)infectiousdiseases:一些病原體有種間特異性，因此需要將其受體導(dǎo)入動(dòng)物中李斯特桿菌?。篖ecuitetal,Science,2001Viralinfections:CD46-tgmice對(duì)麻疹V(Oldstone,etal,1999)uPA-tgmice與C型肝炎V(Fausto,2001)CD4-tgrabbit與HIV(Dunnetal,1995)CCR5-tg與HIV(Cohen,2001)第三十頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7ApplicationsPriondiseasesPrPgeneandproteinarenessarybutnotsufficienttoinduceapriondiseaseinanimals(Moor&Melton,1997;Manloakouetal,2001;Denningetal,2000)Alzheimer’sdisease(屬于綜合性病變）不溶性beta-淀粉樣蛋白和多體tau蛋白沉積引起的大腦病變，與prenisilin1&2genes,apolipoproteinB,IL-1等基因有關(guān)(Chapmanetal,2001)動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，屬于綜合性病變)多種與脂代謝有關(guān)的基因(Miller&Rubin,1997;Brousseau&Hoeg,1999)Celldeath(apoptosis)

該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)確認(rèn)了至少25個(gè)基因(Rangeretal,2001)第三十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7ApplicationsCanceractivationofoncogenesinactivationofanti-oncogenesMammarytumorsC-myc,erbB2,cyclinD1—Seigeletal,2000;Yuetal,2001Neu,ras,orWnt1----Akt----Schwertfegeretal,2001LungcancerK-ras:Johnsonetal,2001第三十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7Applications炎癥性疾病----類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Brodmerkel&Vaddi,CurrOpinBiotech,2003第三十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.2.Examplesforhumandiseases1.7Applications炎癥性疾病----肺炎Brodmerkel&Vaddi,CurrOpinBiotech,2003第三十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.3.ExamplesforXenografting1.7ApplicationsDaietal,2002,NatBiotech(GT-outpig)Laietal2002,Science.(GT–outpig)第三十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.3.ExamplesforXenografting1.7Applications(Inthescientificfield)RejectionmechanismsPossibleinfectionwithpigpathogens(virus,PrP)PigorgansmaynotfunctionefficiencyinhumansHeartKidney?LiverX第三十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.4.Examplesforanimalbreeding1.7Applications

兩種策略(Houdebine,2002)

GeneadditionGenereplacementGeneselectionResistancetodiseases人畜共患病動(dòng)物重點(diǎn)疾病(prion)，抗體，種間抗病基因lysozymeorLysostaphin(溶葡萄球菌素)genesDigestionandmetabolism脂肪酸代謝、降低飼料成本、減少豬糞污染(唾液腺表達(dá)細(xì)菌植酸酶phytase基因，Golovanetal,2001a,b)往反芻動(dòng)物瘤胃中轉(zhuǎn)移將乙酸轉(zhuǎn)化成葡萄糖的基因第三十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.4.Examplesforanimalbreeding1.7ApplicationsMilkcomposition（人類30%的蛋白來源）K-casein↑→減少微球粒尺寸，穩(wěn)定奶(Brophyetal,2003cow)s1-casein↑→有利于提高整個(gè)奶中蛋白含量toKnockoutbeta-lactoglobulingene,majormilkallergen必需脂肪酸、減少乳糖（20%ofhuman不消化乳糖，不能喝奶）Jostetal,1999奶制品工業(yè)需求（cheese,yoghurt,etc)、人源化奶、口服疫苗(抗冠狀病毒的抗體)適合動(dòng)物后代的奶成分(pigexpresscow-lactalbumin-仔豬成活↑

Carcassandwoolgrowth生長(zhǎng)速度，GHinpig,60頭中篩選了5個(gè)品系（Nottle，1997）生長(zhǎng)速度:myostatingene(Yangetal,2001)增加不飽和脂肪酸（fad2,fat-1）:Kangetal,2004羊毛細(xì)度:enhancingcysteinesynthesis第三十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.4.Examplesforanimalbreeding1.7ApplicationsFADtransgene18:3微生物、部分海洋生物高等植物人、哺乳類16:018:018:118:222FAD3酶Ω-6脂肪酸Ω-3脂肪酸飽和脂肪酸單不飽和metabolismpathwayoffattyacidsFAD2酶FAD樣酶抗癌物CLA第三十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.5.Examplesinpharmaceuticalproduction1.7Applicationstraditionalpharmacopoeia

crudeplantextractsChemicalsynthesisproteinpharmaceuticals

extractedproteinsfromhumanoranimalorgans(advantage:nativestateandquiteactive，drawbacks:產(chǎn)量低，contamination(virus,prions)Insulin---pigpancreasGrowthHormoneCoagulationfactorsAntibodiesBSA第四十頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.5.Examplesinpharmaceuticalproduction1.7ApplicationsRecombinationproteins—GeneticengineeringGeneticallymodifiedbacteriaoryeast

(優(yōu)點(diǎn)：純度較高，活性接近自然；缺點(diǎn)：部分蛋白不能合成、純化困難、不能糖基化、不能翻譯后加工等)Humaninsulin,humanGHGeneticallymodifiedanimalcells(優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)量好，自然活性；缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，≤10kg/年)Hybridomas(mAb，產(chǎn)量高);CHO(HumanFSH;EPO)GManimalsBloodmilk

(優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)量好，產(chǎn)量高；缺點(diǎn)：技術(shù)難度大，風(fēng)險(xiǎn)高)第四十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日重組藥物實(shí)例：r-huFSHglycoprotein(Gonal-F)r-hFSH(GONAL-F):Ares-Serono,Switzerland(rFSH;Puregon):Organon,TheNetherlandsPituitarycDNAlibrariesDihydrofolatereductase第四十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.7.6.glandbioreactor1.7Applications生物反應(yīng)器：乳腺血液尿液生物反應(yīng)器：乳腺血液尿液第四十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器

乳腺生物反應(yīng)器的研制，就是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)，通過乳腺特異啟動(dòng)子的控制，獲得乳腺生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

Gordonetal,1987,NatureBiotechnology,humantPA/mousemilk第四十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日動(dòng)物乳腺反應(yīng)器產(chǎn)生的背景轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功商業(yè)要求：1g/L第四十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日乳腺產(chǎn)品的優(yōu)越性產(chǎn)物多樣：多肽（）到大分子蛋白（）分泌性蛋白到內(nèi)膜蛋白多聚體（二價(jià)抗體、三價(jià)fibrinogen）質(zhì)量好（糖基化、磷酸化、天然折疊等）安全，不會(huì)引起抗藥性產(chǎn)量高純化簡(jiǎn)單成本低第四十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)品的開發(fā)和利用

動(dòng)物種類的選擇轉(zhuǎn)基因技術(shù)的選擇基因表達(dá)載體的選擇目標(biāo)產(chǎn)品的選擇第四十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器產(chǎn)品的開發(fā)和利用

專利的影響第四十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日動(dòng)物種類的選擇第四十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日2、動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)載體第五十頁，共五十九頁，2022年，8月28日目標(biāo)產(chǎn)品的選擇

血液蛋白質(zhì)第二代醫(yī)用蛋白質(zhì)基因工程牛奶其它工業(yè)蛋白質(zhì)獸醫(yī)產(chǎn)品第五十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日血液蛋白質(zhì)第五十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日第五十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日Companiesproducingbioproductsusingtransgenicdomesticlivestock(2004)第五十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日用動(dòng)物乳腺生產(chǎn)第二代產(chǎn)品舉例第五十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日乳腺產(chǎn)品的缺點(diǎn)post-t