免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

免疫組織化學(xué)染色技術(shù)第一頁，共九十頁，2022年，8月28日

試劑：蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ

結(jié)果：病變處脂肪組織呈橙黃色

早期心肌梗死染色法

目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域試劑：0.1%NBT(硝基四唑藍(lán))/0.2mol/LPBS(pH7.6)

方法：將2-3mm厚新鮮心肌大片放入試劑中，37°C

孵育20min。結(jié)果：正常心肌呈藍(lán)色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結(jié)締組織、瘢痕組織呈淺藍(lán)色或不顯色。注意：新鮮標(biāo)本，尸檢心肌不超過6小時。第二頁，共九十頁，2022年，8月28日二、光學(xué)顯微鏡下的組織學(xué)染色方法常規(guī)HE染色（hematoxylinandeosinstaining）組織學(xué)特殊染色

1.Mallory三染色、Masson三染色

2.神經(jīng)纖維的鍍銀染色

3.其他的特殊染色，包括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細(xì)胞DNA和RNA的染色等上述的各種染色方法只能在細(xì)胞水平上顯示組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)改變。三、超微結(jié)構(gòu)的觀察光線波長的限制，光學(xué)顯微鏡的分辨率極限為0.2m

有效放大倍數(shù)最高不超過2000倍。電鏡的分辨率最佳可達(dá)0.14nm，放大倍率最高可達(dá)100萬倍。第三頁，共九十頁，2022年，8月28日

第二節(jié)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

Immunohistochemicaltechnique

該技術(shù)主要是用于研究和觀察細(xì)胞中的某些結(jié)構(gòu)或分子物質(zhì)和組織細(xì)胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為：

1.免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

3.免疫鐵蛋白技術(shù)

4.免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

5.免疫電子顯微鏡技術(shù)第四頁，共九十頁，2022年，8月28日一、免疫組織化學(xué)染色方法的原理抗原（antigen）

1.定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂袃煞N性能：（1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。（2）反應(yīng)原性（reactogenicity）指抗原分子與抗體或效應(yīng)T細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。第五頁，共九十頁，2022年，8月28日2.抗原的分類

完全抗原、半抗原免疫學(xué)分類胸腺依賴抗原與非依賴抗原外源性抗原：微生物、花粉等內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫瘤相關(guān)抗原等臨床分類同種異型抗原：人類白細(xì)胞抗原、血型抗原異嗜性抗原：人與其他動物、植物等之間存在的共同抗原第六頁，共九十頁，2022年，8月28日抗體（antibody）

1.定義：機(jī)體受到抗原刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白，稱為抗體。大部分抗體電泳后位于區(qū)帶，1972年國際免疫學(xué)聯(lián)合會正式將化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。

2.抗體的種類:

五類，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM

免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，使用的抗體主要是IgG，個別情況下使用IgG的亞型，多為IgG1。第七頁，共九十頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理及顯色原理

1.免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理

染色反應(yīng)的最基本原理是抗原抗體的反應(yīng)。

通過對針對標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種發(fā)色劑或酶類，再通過激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色以確定所要檢測的抗原是否存在。

通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測到所要研究的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。第八頁，共九十頁，2022年，8月28日2.免疫組織化學(xué)染色的顯色原理

(1)基本原理

熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標(biāo)抗體法應(yīng)用最為廣泛。

直接法：是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切片上待檢測的組織或細(xì)胞中抗原反應(yīng)，再用底物顯色，顯示出所檢測的目的抗原的部位。

間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。

間接法中所用的一抗是針對組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。第九頁，共九十頁，2022年，8月28日

第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來自同一種屬動物，與標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就能用來顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩。通過某種技術(shù)增加第二抗體上標(biāo)記酶的含量，可提高免疫組織化學(xué)染色的敏感度。

IHC技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用。（2）顯色的基本程序

1抗孵育切片或細(xì)胞涂片2抗（酶標(biāo)抗體）孵育切片發(fā)色劑顯色（核復(fù)染）第十頁，共九十頁，2022年，8月28日（3）酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑

辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

HRP+H2O2HRP·H2O2HRP·H2O2+DH2HRP+D+2H2O

HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異的，其余反應(yīng)是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應(yīng)的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如：

CN為藍(lán)色

TMB為深藍(lán)色

AEC為紅色

DAB為棕色第十一頁，共九十頁，2022年，8月28日堿性磷酸酶

(alkalinephosphatase,ALP)

以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸鹽）為底物，F(xiàn)B/FR(Fastblue/Fastred)為發(fā)色劑，生成藍(lán)色/紅色不容性沉淀物。

ALP標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的ICC染色。

由于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP，在顯色液中需加入終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶

(glucoseoxidase，GOD)

以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS(吩嗪硫酸甲酯,phenazinemethyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37oC孵育1小時，生成藍(lán)色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長期保存。

第十二頁，共九十頁，2022年，8月28日（4）核復(fù)染

在顯色后，特別是用DAB顯色后，切片可用蘇木素染料進(jìn)行核復(fù)染，經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的DAB棕色形成對比。但用AEC顯色后不能用蘇木素做核復(fù)染，因為配制蘇木素染料中使用酒精作為介質(zhì)，可使AEC的紅色終產(chǎn)物褪色，且AEC顯色后只能用水溶性封固劑封片。第十三頁，共九十頁，2022年，8月28日第三節(jié)免疫組織化學(xué)染色步驟（一）ABC或SP法進(jìn)行石蠟切片染色的主要步驟

1.組織材料的采??；

2.組織塊的固定；

3.組織塊的脫水、透明及石蠟包埋；

4.石蠟切片的制備；

5.石蠟切片的脫蠟及水化；

6.抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；

7.PBS洗滌切片；

8.抗原修復(fù)或蛋白酶消化切片，修復(fù)或暴露抗原；

9.PBS洗滌切片；第十四頁，共九十頁，2022年，8月28日10.用與二抗來源相同的動物非免疫正常血清（或同時加入BSA）孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11.用特異性一抗(單克隆、多克隆)孵育切片；12.PBS（可加入Tween20#，PBST）洗滌切片；13.用針對一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用PBS或PBST洗滌切片；15.滴加SP試劑或ABC試劑；16.PBS或PBST洗滌切片；17.DAB或AEC顯色；18.自來水洗滌切片，終止顯色；19.用蘇木素做核復(fù)染；20.切片脫水、透明，樹膠封片。第十五頁，共九十頁，2022年，8月28日（二）各染色步驟的具體操作及注意事項1.組織材料的采取

活檢組織組織標(biāo)本手術(shù)切除標(biāo)本尸檢標(biāo)本實驗組織或培養(yǎng)細(xì)胞活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織

體積小，因活檢鉗直接鉗取，常受壓過度而變性，因此，活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時應(yīng)采取主要的病灶區(qū)。

抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)考慮切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠(yuǎn)距病灶的正常區(qū)。第十六頁，共九十頁，2022年，8月28日尸檢組織

由于取材時一般均已超過死亡后2小時以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消失或有嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多在24小時以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴(yán)重，而影響染色結(jié)果。手術(shù)切除的組織較新鮮，取材后應(yīng)立即固定，以保存組織結(jié)構(gòu)和抗原。實驗動物標(biāo)本新鮮，可按需要取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織結(jié)構(gòu)和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學(xué)染色。取材標(biāo)本的大小尸檢組織材料大小以1cm1cm0.2cm為宜。實驗動物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標(biāo)本體積不宜過大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費試劑。第十七頁，共九十頁，2022年，8月28日

2.組織塊的固定、水洗（1）固定液：種類較多，常用的有以下2種：

4%甲醛/PBS(pH7.2-7.4)

配制方法：10ml40%甲醛(formalin)+90mlPBS

使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，還可形成甲酸，影響染色結(jié)果。(可以用粉筆溶)

4%多聚甲醛/PBS(pH7.2-7.4)

配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH7.2-7.4)，攪拌、加熱至60oC，同時滴入1NNaOH至溶液完全透明。冷卻后用1NHCl調(diào)PH值至，再用0.1mol/LPB將溶液加至1000ml。

?固定時間：一般根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定2-24小時。

?固定原理：甲醛通過使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反應(yīng)，并能保存脂類和類脂體。

?不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測的抗原決定簇被封閉，影響抗原抗體的結(jié)合。第十八頁，共九十頁，2022年，8月28日（2）水洗

沖洗時間與標(biāo)本的種類、組織塊的大小和固定時間長短有關(guān)。尸檢組織和大動物組織一般沖洗24

小時，小動物組織沖洗2-10小時。

新鮮標(biāo)本固定時間短，沖洗時間也相應(yīng)縮短，固定時間長的標(biāo)本，沖洗時間也需延長。

沖洗時組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎緊，防止組織塊漏出。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端接自來水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)⒔M織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。

對于過小組織或穿刺組織和小動物組織多次換水浸泡即可。第十九頁，共九十頁，2022年，8月28日3.組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋（1）脫水脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強(qiáng)，并可硬化組織。酒精對組織的穿透速度很快，對組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過度收縮，應(yīng)從低濃度開始，然后再依次增加其濃度。在常溫下或4

oC下進(jìn)行，以減少抗原的損失。

70%80%90%95%100%100%第二十頁，共九十頁，2022年，8月28日

（2）透明

為使石蠟?zāi)芙虢M織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟的溶劑。通過溶劑的媒介作用而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。

透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用二甲苯。

一般經(jīng)過2～3次純二甲苯溶液透明，每次10～15分鐘，同時應(yīng)根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二甲苯的新鮮程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬。第二十一頁，共九十頁，2022年，8月28日（3）浸蠟

組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟。

為使石蠟充分滲入組織只，常需經(jīng)過2-3次石蠟浸漬。

用于免疫組織化學(xué)染色的組織塊浸蠟應(yīng)使用低溫蠟，在60oC以下浸透。（4）包埋浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。第二十二頁，共九十頁，2022年，8月28日4.石蠟切片的制作（1）載玻片涂片的制作

防脫片劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane,APES）、多聚賴氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明膠。

APES

涂片的制作

原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易脫落，保留時間較久。

具體操作方法：

將載玻片用酸處理后，用95%酒精浸泡，再用綢布擦干，清除表面的污漬；

第二十三頁，共九十頁，2022年，8月28日將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)5min；將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑（1mlAPES+50ml丙酮）1-2次；純丙酮內(nèi)洗2次后，37oC過夜，干燥；用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，PLL）試劑配制：PLL0.5g+蒸餾水100ml

也可根據(jù)提供的方法配制。可于4oC或-20

oC保存?zhèn)溆?，可反?fù)凍存，效果無明顯影響。涂片前將其稀釋10-50倍，均勻涂在處理后干凈的載玻片上，37oC下干燥過夜。第二十四頁，共九十頁，2022年，8月28日甲醛-甘油明膠試劑：40%甲醛2.5ml，明膠0.5g，蒸餾水加至100ml。配制方法：用一部分蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至

100ml，混勻即可。粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復(fù)或酶消化后，有時易脫片。（2）制做切片切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)式或滑動式切片機(jī)。切片厚度：5-7m。展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展開切片（水浴鍋上加熱平皿）。撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。切片干燥：

37oC過夜，干燥。第二十五頁，共九十頁，2022年，8月28日5．石蠟切片的脫臘及水化

脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

各15分鐘脫臘，水化：100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各10分鐘、95%ALC5分鐘、90%ALC5分鐘、80%ALC5分鐘、70%ALC5分鐘，蒸餾水浸洗。6．清除內(nèi)源性過氧化物酶活性

由于常規(guī)免疫組織化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過氧化物酶

(horseradishperoxidase,HRP)和DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride)，而組織中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽性反應(yīng)和減少背景染色，需要先清除內(nèi)源性過氧化物酶活性。

第二十六頁，共九十頁，2022年，8月28日染色框第二十七頁，共九十頁，2022年，8月28日具體方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2液中20~30分鐘試劑：純甲醇99ml30%，H2O21ml充分混勻，使最后濃度為0.3%，或0.01mlPBS(pH7.2~7.4)99ml30%H2O21ml7．PBS洗滌切片經(jīng)甲醇-H2O2或PBS-H2O2處理后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用PBS洗5min×3次。

0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)的配制：

NaH2PO42H2O0.45gNa2HPO412H2O3.23gNaCl8.0g

蒸餾水加至1000ml為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，可在PBS中加入Tween20#，制成含0.1%Tween20#的PBS。Tween20#為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。第二十八頁，共九十頁，2022年，8月28日

8．抗原修復(fù)（antigenretrieval,AR）

某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋肌中的myoglobin(Mb)、actin、myosin、腦組織中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生長激素(growthhormone)、胰島素、波形蛋白(vimentin)、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗原物質(zhì)或檢測的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復(fù)或蛋白酶消化。目前機(jī)理清楚，但是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率，同時也會出現(xiàn)假陽性，現(xiàn)已廣泛用于技術(shù)中。尤其對原來僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，利用后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。第二十九頁，共九十頁，2022年，8月28日（1）抗原熱修復(fù)

方法①微波中96℃10~20min②直接加熱法100℃10min③高壓鍋/消毒鍋120℃10min

其他：水浴鍋100℃10min×2及真空加熱10min等。

熱修復(fù)的介質(zhì)

①0.01mol/LpH6.0檸檬酸緩沖液②0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH1~12)③0.01mol/LpH7.0PBS④2%硫酸鋁⑤2%硝酸鉛⑥生理鹽水⑦蒸餾水

溶液的摩爾濃度對修復(fù)效果無任何影響，而pH值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。

第三十頁，共九十頁，2022年，8月28日

溫度與修復(fù)時間的關(guān)系：許多的實驗結(jié)果表明：溫度高修復(fù)時間短，如Ki-67和P-gp的檢測，利用同一切片，達(dá)到相同染色結(jié)果需要：①100℃20min；②90℃30min；③80℃50min；④70℃20h

操作流程①微波處理：將切片插入25片塑料架上，在250ml塑盒內(nèi)加入200ml緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90℃+，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。②水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，首先調(diào)節(jié)水溫達(dá)

95℃左右，將切片置入內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入水浴鍋，溫度平衡后開始計算時間20min，取出容器后自然冷卻到室溫。③壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開始冒氣計時50min，關(guān)閉氣閥，使之加壓10min。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗10min，冷卻后取出切片，PBS洗。第三十一頁，共九十頁，2022年，8月28日

最佳修復(fù)方法的選擇

選擇最佳的修復(fù)方法設(shè)計表

檸檬酸BufferpH12pH6pH10-11Tris-HClBufferpH12pH7-8pH10-11微波100℃10min×2slide1slide2slide3壓力鍋120℃10minslide4slide5slide6微波或水浴90℃30minslide7slide8slide9slide10作對照，不作任何處理第三十二頁，共九十頁，2022年，8月28日

抗原熱修復(fù)應(yīng)注意的問題

有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示，對某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)。而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，因此，在使用該方法時一定要小心，對結(jié)果的判定也要做出客觀的分析，同時在操作過程中還注意以下問題：

第三十三頁，共九十頁，2022年，8月28日①熱處理后應(yīng)自然冷卻切片。②不能煮干修復(fù)液。③不要任何抗原的檢測都使用該方法。④一批抗原的檢測其溫度和時間應(yīng)保持一致。⑤一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞，但對細(xì)胞核的影響較大，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。⑥如果在常用的緩沖（修復(fù)）液中無法實現(xiàn)抗原修復(fù)，得不出好的染色結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或EGTA等可能取得較好的效果。第三十四頁，共九十頁，2022年，8月28日

（2）蛋白酶消化法原理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開而引起暴露抗原決定簇的作用，使第一抗體能與抗原部分結(jié)合，提高陽性檢測率。注意事項：用于IHC切片消化的酶有多種，所選擇酶的種類、使用的濃度、pH值、消化時間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，通過預(yù)實驗確定。第三十五頁，共九十頁，2022年，8月28日常用的消化酶類：胰蛋白酶和蛋白酶K：檢測細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化，如Keratin、CEA、GFAP等。

胃蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測切片的消化，如纖連蛋白(fibronectin)，各型膠原等。消化時間及溫度：一般消化時間與組織固定的長短呈正比。蛋白酶的消化時間5~10~20min，視切片固定時間的長短而定。第三十六頁，共九十頁，2022年，8月28日（3）酶消化液的配制

除了商業(yè)銷售的成品，可按說明書使用外，還可自行配制。

①0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶0.1g0.1%氯化鈣(pH7.8)100ml

配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后加入胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前將胰蛋白酶液過濾，并在水浴中預(yù)熱至37℃，室溫下消化時間5~30min，多用于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴露。。第三十七頁，共九十頁，2022年，8月28日②0.4%胃蛋白酶

胃蛋白酶400mg0.1NHCl100ml

多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化，37℃下消化時間約30min。③0.06%蛋白酶K

蛋白酶K0.06g0.05mol/LTris-HCl(PH7.5)100ml

用法同上。在免疫組化染色中，有時經(jīng)過度固定的標(biāo)本，影響一抗與抗原的結(jié)合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化時間應(yīng)根據(jù)不同組織而異。總之，在保持組織形態(tài)不破壞的前提下，宜盡量消化時間延長。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。第三十八頁，共九十頁，2022年，8月28日

9.經(jīng)熱修復(fù)抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進(jìn)行下一步。10.用與制備二抗相同的動物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。

組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色。最常見的原因是蛋白(第一抗體)吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體相同動物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合(在室溫下進(jìn)行)。

非免疫血清的稀釋度1:5~1:20，還可加入BSA(bovineserumalbumin)使稀釋后的非免疫血清中含0.1~6%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。第三十九頁，共九十頁，2022年，8月28日11．用特異性一抗孵育切片

研究組織細(xì)胞中的某種抗原是否存在，應(yīng)用免疫組化染色，就要選用針對這種抗原的特異性抗體?，F(xiàn)在國際上有許多公司生產(chǎn)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。

①一抗的種屬來源

一抗可來源于各種種屬的動物，常見是來自家兔、山羊或小鼠，偶見來自馬。一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗體，而來自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實驗動物或標(biāo)本種屬的不同，選擇針對大鼠、小鼠或人的抗體。第四十頁，共九十頁，2022年，8月28日

②抗體劑型及滴度檢驗

我國現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國外進(jìn)口，包括一抗和含二抗的試劑盒。國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是100-200g/ml，但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)行了分裝，如分成瓶等，也經(jīng)銷1ml/瓶抗體，價格各不相同。國內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進(jìn)口抗體進(jìn)行稀釋，銷售的品種又分為即用型和濃縮型(進(jìn)口原裝的抗體)兩種。在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋，直接在切片上滴加即可。濃縮型必須在稀釋后才能使用，因為濃縮型抗體濃度高，可引起嚴(yán)重的非特異性染色，因此，必須在正式染色前先用切片對不同滴度的抗體染色效果進(jìn)行評價，選擇濃度強(qiáng)度最好，非特異性反應(yīng)（背景染色）最低的抗體稀釋度來進(jìn)行正式染色。

第四十一頁，共九十頁，2022年，8月28日

一抗稀釋滴度的評價（摸索實驗條件時可以稀釋度跨度大一些試）切片編號slide1slide2slide3slide4slide5抗體稀釋度1:501:1001:2001:4001:800特異性染色+++++++++++++++背景染色+++++––

第四十二頁，共九十頁，2022年，8月28日③一抗體的稀釋

一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即，為進(jìn)一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應(yīng)加入制備二抗的同種動物的非免疫正常血清，有條件的還可加入BSA，兩者的濃度在1-2-5%即可。④一抗的孵育時間及條件

加入適當(dāng)稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37℃下保溫盒內(nèi)孵育。經(jīng)過正常二抗同種動物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵育時間：30-60分鐘或更長。如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于4℃冰箱內(nèi)過夜孵育，可達(dá)到滿意的效果。

第四十三頁，共九十頁，2022年，8月28日12．PBS洗滌切片

將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌3次，每次5min，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反應(yīng)。13．用針對一抗的生物素化二抗孵育切片

根據(jù)一抗的種屬來源，選擇相應(yīng)的二抗。如：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接使用。濃縮型者一般用PBS直接以1:200-400倍稀釋使用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60min。試劑盒：濃縮型或即用型SP試劑盒、ABC試劑盒試劑盒中包含：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑二抗的同種動物非免疫血清生物素標(biāo)記的抗IgG抗體（二抗）

SP試劑

[ABC試劑（單獨購買）]第四十四頁，共九十頁，2022年，8月28日14．PBS洗滌切片5min×3次15．滴加SP試劑或ABC試劑（1）生物素-抗生物素染色（SABC或SP法）的顯色原理

ABC法的染色原理

很早以前研究者就注意到給動物飼以大量的雞蛋白，會引起明顯的“維生素H缺乏癥”，也稱為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68kD，屬于糖蛋白，當(dāng)時命名為卵白素（avidin）。機(jī)體中還有一種物質(zhì)叫維生素H，又稱為生物素（biotin），是一種小分子的維生素，廣泛分布于動植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化酶反應(yīng)，分子量為244D。第四十五頁，共九十頁，2022年，8月28日

卵白素具有4個同VitaminH（生物素）親和力極高的結(jié)合點。給動物飼以大量的雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量維生素H結(jié)合所致。研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點，提出了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)。由于習(xí)慣上將維生素H稱為生物素，為便于理解，我國免疫細(xì)胞化學(xué)作者將卵白素稱為抗生物素或親和素，因此卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素-生物素免疫染色法。

生物素的另一特點是它可以和抗體IgG的Fc段結(jié)合，不影響IgG的活性。同時，生物素經(jīng)活化后還可同過氧化物酶或ALP等結(jié)合，而不影響酶的活性。根據(jù)上述這些抗生物素-生物素的反應(yīng)原理和特性，1981年許世明設(shè)計出了免疫組織化學(xué)染色的ABC法（avidin-biotinperoxidasecomplexmethod，

ABC

），并已制成了商品化的試劑盒。第四十六頁，共九十頁，2022年，8月28日

ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動物的非免疫血清、生物素標(biāo)記的二抗外，還包括：A試劑(抗生物素)和B試劑(生物素-過氧化物酶復(fù)合物)。在使用前半小時，將兩種試劑按說明書要求相互混合，形成復(fù)合物，一般是在5ml的PBS中加一滴A試劑(約50l)，混勻后再加一滴B試劑(約50l)，混勻，半小時后加至經(jīng)過生物素標(biāo)記的二抗孵育的切片上，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60分鐘。

SP法的染色原理基本原理與ABC法相似，但與ABC法稍有不同，是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。第四十七頁，共九十頁，2022年，8月28日BiotinylatedsecondantibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimaryantibodyIllustrationofABCmethodAvidin-biotin-peroxidasecomplex第四十八頁，共九十頁，2022年，8月28日AgAgBiotinStreptavidinEnzyme:HRPorAPPrimaryantibodyBiotinylatedsecondaryantibodyIllustrationofSPmethodSPcomplex第四十九頁，共九十頁，2022年，8月28日

SABC法的染色原理及特點

(1)基本原理

鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，分子量60kD，不含糖鏈，等電點PI6.0。與親和素相同也有四個生物素結(jié)合點，親和力極高。與親和素相比是一種更近于完美的生物素結(jié)合蛋白。鏈酶親和素同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物。這種復(fù)合物中至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位點，可以和各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合。這種復(fù)合物即是SABC(streptavidin-biotincomplex)。

(2)SABC的特點

高敏感性；低背景；簡便快速；結(jié)果穩(wěn)定第五十頁，共九十頁，2022年，8月28日

EnVison?系統(tǒng)染色原理與ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是將二抗與多聚螯合物酶（HRP或AP）通過化學(xué)方法連接在一起，形成多聚螯合物，在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗，因此，比ABC法、SP法和SABC法具有更顯著的放大作用，可高出幾十倍。由于多聚物在人或動物體內(nèi)不存在，因此，無非特異性染色，背景著色極輕。染色步驟簡便，在一抗反應(yīng)后，切片經(jīng)PBS洗滌后即可加入EnVison?系統(tǒng)試劑，再經(jīng)PBS洗滌后，可進(jìn)行顯色。第五十一頁，共九十頁，2022年，8月28日AgAgPrimaryantibodySecondaryantibodyEnzyme,APorHRPIllustrationofEnVisionmethod第五十二頁，共九十頁，2022年，8月28日16．PBS洗滌切片，5min×3。

17．DAB顯色或AEC顯色，或堿性磷酸酶標(biāo)記的NBT顯色。

（1）DAB顯色液配置

DAB20-50mg0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4)100ml

或0.05mol/LTris-HCl(pH7.6)30%H2O220-40μl

配置方法：先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30%H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中5-10-20min，應(yīng)閉光下反應(yīng)，并隨時在顯微鏡下觀察結(jié)果，隨時終止反應(yīng)，也可使用商品化的即用型DAB。陽性反應(yīng)部分為棕色，經(jīng)核復(fù)染后，脫水、透明、樹膠封片，但由于有致癌作用，配置時應(yīng)注意防護(hù)。第五十三頁，共九十頁，2022年，8月28日

（2）AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)顯色液

AEC20mg

二甲基甲酰胺(DMF)2.5ml0.05mol/L醋酸緩沖液(pH5.5)50ml30%H2O25μl

配置方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻過濾。臨顯色前加入H2O2,切片顯色時間5-20min，也可使用商品化的AEC顯色。該顯色液作用后，陽性部分為紅色，如以蘇木素或亮綠復(fù)染核后，效果更佳，但終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。第五十四頁，共九十頁，2022年，8月28日（3）堿性磷酸酶（AKP）標(biāo)記的NBT顯色液

預(yù)先配置以下試劑：

A液：5%NBT（Nitro-blue-tetrazolium）稱取0.5gNBT溶于10ml70%的DMF，充分混合，保存于4℃，也可分裝成小份，-20℃保存，用前復(fù)至室溫。

B液：5%BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）稱取BCIP0.5g，溶于10mlDMF內(nèi)，混勻，4℃成分裝，保存于-20℃，用前復(fù)至室溫。顯色液：取A液40μl，加入到裝有10ml的0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH9.5，含0.1mol/LNaCl，5mmol/LMgCl2）管內(nèi)充分混勻，再加入B液40mol，輕輕混勻即可，最好臨用前就配置，但在顯色液中需加入Levamisole（左旋咪唑）在顯微鏡下隨時觀察顯色反應(yīng)，陽性結(jié)果為藍(lán)色或紫色沉淀。上述所提及的各種顯色液目前均有以試劑盒形式出售，只要按說明操作即可，但價格較貴。第五十五頁，共九十頁，2022年，8月28日

18.自來水洗滌切片、核復(fù)染、脫水、透明、樹膠封片

經(jīng)顯色后，將切片放入自來水中，流水輕沖洗10分鐘，再經(jīng)蒸餾水洗后，放入蘇木素中做核復(fù)染（顯色切片）20s-1min，經(jīng)酒精-HCl分化后，在放入自來水中繼續(xù)分化細(xì)胞核至滿意為止。經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精脫水各5min，二甲苯透明后，用樹膠封片。第五十六頁，共九十頁，2022年，8月28日

第三節(jié)免疫組化染色的對照設(shè)置

在進(jìn)行免疫組化染色時，必須證實組織內(nèi)顯示的反應(yīng)產(chǎn)物，確實是抗原與相應(yīng)的特異性抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的。由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原、抗體和免疫反應(yīng)的因素很多，因此對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評價必須設(shè)置對照組才能做出正確的判斷。常用的對照組有以下幾種：

第五十七頁，共九十頁，2022年，8月28日

一、陽性對照

用已證實含用待測抗原的組織，與待檢標(biāo)本做同樣處理后，進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果應(yīng)為陽性，稱為陽性對照。每次實驗都應(yīng)做陽性對照，通過陽性對照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個步驟以及所用的試劑都合乎標(biāo)準(zhǔn)，染色方法可靠。特別是當(dāng)待檢的標(biāo)本為陰性結(jié)果時，陽性對照呈陽性反應(yīng)，可排除待檢標(biāo)本假陽性的可能。所以若預(yù)期染色結(jié)果是陰性時，就必須設(shè)陽性對照。第五十八頁，共九十頁，2022年，8月28日

二、陰性對照

用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結(jié)果為陰性。陰性對照可證實組織內(nèi)若不含靶抗原，就不應(yīng)染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的“假陽性”結(jié)果。三、空白對照

是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。第五十九頁，共九十頁，2022年，8月28日

四、替代對照

用與第一抗體來源的同一動物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對照中用非免疫性的正常兔IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對照染色。這可證明待檢切片中陽性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應(yīng)的結(jié)果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動物的免疫前血清做替代對照，也可用未經(jīng)免疫的同種動物血清，即非免疫血清替代一抗。第六十頁，共九十頁，2022年，8月28日

五、吸收試驗對照

用過量已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反應(yīng)，抗體結(jié)合點全部被抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應(yīng)，故再做免疫組化染色時，結(jié)果應(yīng)為陰性。

六、自身對照

用同一組織切片上與待檢抗原無關(guān)的其它結(jié)構(gòu)做對照。陰性反應(yīng)與陰性結(jié)構(gòu)同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應(yīng)的特異性對照。但進(jìn)行科研工作中，單純用這種對照是不科學(xué)的。必須增加如空白對照、替代對照等，才能使染色結(jié)果得到承認(rèn)?，F(xiàn)代國際上發(fā)表文章，在免疫組化染色的同時，還須有Westernblotting做相應(yīng)蛋白質(zhì)檢測的實驗結(jié)果加以證實。第六十一頁，共九十頁，2022年，8月28日

冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色

冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色也是常用的技術(shù)，但一般情況下不用，因為冰凍切片操作較復(fù)雜，不易操作，要求標(biāo)本必須是深低溫快速冷凍，標(biāo)本不如石蠟塊易保存等，但優(yōu)點是組織的各種抗原保存好。因此一般情況下，只有在應(yīng)用石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，包括經(jīng)過抗原熱修復(fù)或蛋白酶消化后，仍不能得到陽性染色結(jié)果時，才考慮使用冰凍切片染色。第六十二頁，共九十頁，2022年，8月28日第四節(jié)雙重免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法在同一張組織切片或細(xì)胞涂片上同時或先后顯示兩種抗原成分，即為雙重免疫標(biāo)記。光鏡下通過標(biāo)記物或其反應(yīng)生成物的顏色來標(biāo)記不同的抗原成分，以幫助研究者了解含有這些不同抗原的各類細(xì)胞、組織之間的相互關(guān)系?？赡苡龅降膯栴}是：后一種免疫染色所用的抗體系統(tǒng)可能與前一種染色所用的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)，從而造成疊加污染，失去雙重染色的準(zhǔn)確性和意義。為避免這種交叉反應(yīng)，研究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分為洗脫法和非洗脫法。第六十三頁，共九十頁，2022年，8月28日

一、洗脫法

1.基本原理：可選用同種動物產(chǎn)生的特異性抗體（如兔抗X和兔抗YIgG抗體）為一抗，另一種動物相應(yīng)的抗體（如生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）為二抗，用ABC、SP或SABC方法，或應(yīng)用EnVison方法進(jìn)行染色，用不同的酶和底物系統(tǒng)呈色。在完成第一種免疫組化染色后，將抗原抗體復(fù)合物洗脫，再做第二種染色。

2.洗脫液：

（1）甘氨酸-鹽酸溶液(pH2.2)：0.1mol/L鹽酸+0.757%（0.1mol/L）甘氨酸溶液95ml（0.1mol/L的氯化鈉溶液配制）。用該溶液洗切片2h，一般能夠消除第一種染色的抗體系統(tǒng)與下一種染色的交叉反應(yīng)，但保留顯色反應(yīng)所得的顏色。第六十四頁，共九十頁，2022年，8月28日

（2）高錳酸鉀-硫酸洗脫液：1ml2.5%KMnO4，1ml5%H2S04，加140ml蒸餾水混勻。

3.洗脫法的一般步驟

按常規(guī)做第一種免疫組化染色，可選用HRP為標(biāo)記物，顯色底物為4-氯萘酚，陽性部位反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色。開始第二種染色前，先將切片經(jīng)蒸餾水洗，再用酸性溶液洗脫。如用pH2.2的甘氨酸-鹽酸溶液須浸洗2h左右，如用高錳酸鉀-硫酸洗脫液則要5min左右，再將切片移入0.5%的焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）水溶液中還原30s，經(jīng)水洗10-20min，蒸餾水洗5min，

按常規(guī)進(jìn)行下一種免疫組化染色。第二種染色選用DAB為顯色底物，生成物呈棕褐色，與第一種染色中生成的藍(lán)色可形成比較鮮明的對比。第六十五頁，共九十頁，2022年，8月28日

二、非洗脫法

（一）直接法

如果采用不同種酶標(biāo)記在不同的第一抗體上，則只能用順序染色法。即先做第一種染色，用第一種底物與已定位的酶反應(yīng)呈色，再進(jìn)行第二種染色。（二）標(biāo)記雙抗原法

兩種一抗分別來自不同種動物，二抗分別來自另外兩種不同動物，且標(biāo)記兩種酶分別作為標(biāo)記物做雙重染色時，一般第一種染色選用HRP，而在第二種染色中可按需要選擇不同的酶。如選用ALP，還可用不同的底物呈現(xiàn)不同的顏色，如堅固藍(lán)呈現(xiàn)的藍(lán)色可與DAB的棕色形成良好的對比，堅固紅雖然與DAB的棕色對比相對較差，但也可選用。

第六十六頁，共九十頁，2022年，8月28日

（三）活性滅活法是一種新建立的方法，主要是根據(jù)通過在溶液中加熱滅活第一次染色中的抗原、抗體和酶活性后再進(jìn)行第二種染色的原理而設(shè)計的。用于滅活的溶液介質(zhì)一般是檸檬酸緩沖液（pH6.0），滅活的溫度一般是96℃左右。本法的優(yōu)點是用于染色的一抗、二抗可分別來自于同一種動物，方便了抗體的選擇，只是選用不同的顯色酶和底物。但缺點是所要顯示的第二種抗原必須耐熱。第六十七頁，共九十頁，2022年，8月28日免疫熒光染色及多重染色技術(shù)

Singleandmultipleimmunofluorescentlabeling◆原理：是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗體或抗原標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。◆方法：直接法、間接法。第六十八頁，共九十頁，2022年，8月28日檢測方法

一、直接法用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見抗原存在部位呈現(xiàn)的特異性熒光。此法特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。第六十九頁，共九十頁，2022年，8月28日

二、間接法是直接法的重要改進(jìn)，先用特異性第一抗體抗體與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用標(biāo)記熒光的第二抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性，與直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3～4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，適用于多種抗原的標(biāo)記顯示，是目前最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。第七十頁，共九十頁，2022年，8月28日間接法染色原理第七十一頁，共九十頁，2022年，8月28日標(biāo)記不同熒光發(fā)色劑的商品化二抗：1.AlexaFluor?555，顯示紅色熒光；吸收光譜峰值：555nm，激發(fā)光譜峰值：565nm。2.AlexaFluor?488，顯示綠色熒光；吸收光譜峰值：495nm，激發(fā)光譜峰值：519nm。3.AlexaFluor?350，顯示藍(lán)色熒光。吸收光譜峰值：346nm，激發(fā)光譜峰值：442nm。4.Hoechst33258，標(biāo)記細(xì)胞核，或細(xì)胞凋亡檢測，藍(lán)色。吸收光譜峰值：

346nm，激發(fā)光譜峰值：460nm第七十二頁，共九十頁，2022年，8月28日雙重或三重免疫熒光標(biāo)記法

Doubleandtripleimmunofluorescentlabeling目的：1.雙重染色：同時顯示細(xì)胞中的兩種抗原或一種抗原+標(biāo)記細(xì)胞種類；2.三重染色：同時顯示細(xì)胞中的三種抗原或兩種抗原+標(biāo)記細(xì)胞種類。方法：直接法、間接法第七十三頁，共九十頁，2022年，8月28日

直接法：將兩種或三種來自不同種屬，并標(biāo)記了可發(fā)出不同顏色熒光的抗體（如抗A、抗B、抗C）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用發(fā)黃綠色熒光素標(biāo)記，抗B抗體用發(fā)紅色熒光素標(biāo)記，抗C抗體用發(fā)藍(lán)色熒光素標(biāo)記明確顯示兩種或三種抗原的定位。第七十四頁，共九十頁，2022年，8月28日

間接法：將兩種或三種來自不同種屬的抗體（如抗A、抗B、抗C的IgG抗體）同時或分別孵育切片后，再選用標(biāo)記了可發(fā)出不同顏色熒光另外不同種屬的抗IgG抗體孵育切片，進(jìn)行雙重或三重免疫熒光染色，是目前常用的檢測技術(shù)。第七十五頁，共九十頁，2022年，8月28日免疫熒光染色注意事項

免疫熒光染色的基本程序近似于酶免疫組織化學(xué)染色，但應(yīng)注意以下問題：1.免疫熒光不需要用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2.二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。3.免疫熒光在封片時常使用專用封片劑或甘油（0.01MPBS1：1）。建議購買抗淬滅的封片液，使切片可以保存更久。4.熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。5.免疫熒光染色假陽性可能多，需分別設(shè)定陽性和陰性對照。6.熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，可能會使熒光提前衰退。

第七十六頁，共九十頁，2022年，8月28日

第五節(jié)

細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)

一、凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

細(xì)胞表面：偽足、微絨毛等消失

細(xì)胞體形態(tài)：細(xì)胞皺縮、變形，體積變小

細(xì)胞核：染色質(zhì)濃縮、早期染色質(zhì)聚集于核膜邊，呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂

細(xì)胞器：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴(kuò)張

細(xì)胞膜：完好，晚期包裹細(xì)胞器或核碎片，形成凋亡小體

在組織中表現(xiàn)：常常以單個細(xì)胞散在發(fā)生

周圍組織反應(yīng)：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞吞噬、降解，不發(fā)生炎癥反應(yīng)

發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷機(jī)制、小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)第七十七頁，共九十頁，2022年，8月28日

二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法（一）凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測

1．制片（1）常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)行脫蠟和水化。（2）培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片。由于凋亡細(xì)胞在制片中容易破碎，所以應(yīng)采用低速離心制片（250g，離心5min），并事先將載玻片用1%BSA處理，使細(xì)胞易于貼附。離心后涂片，稍經(jīng)空氣中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后轉(zhuǎn)入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20℃待用。第七十八頁，共九十頁，2022年，8月28日

2．染色方法可用多種方法進(jìn)行染色。（1）可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如Giemsa染色、HE染色或Mayer蘇木素染色。（2）采用熒光染料染色

Hoechst33258

。DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole;4,6-二脒基-2-苯基吲哚

）。

DAPI是含有特定AT序列DNA的一種嵌入劑，能像Hoechstdye一樣粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)。盡管DAPI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿透擾亂的細(xì)胞膜而對核染色。PI（propidiumiodide,碘化丙啶）

。第七十九頁，共九十頁，2022年，8月28日

3．結(jié)果觀察

典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積縮小及變形；核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu)，可見核染色質(zhì)呈新月形，或核碎裂成大小不等的核碎片；在組織切片上可見巨噬細(xì)胞或鄰近的上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞或凋亡小體。（二）凋亡細(xì)胞的電鏡觀察采用電鏡的常規(guī)方法固定、包埋和制片?？捎猛干潆婄R或掃描電鏡進(jìn)行觀察。

透射電鏡下，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、核膜消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，而細(xì)胞器如線粒體等形態(tài)仍保持良好，可見被膜結(jié)構(gòu)包繞的細(xì)胞器，即凋亡小體。掃描電鏡下，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如偽足、微絨毛等消失，細(xì)胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏。第八十頁，共九十頁，2022年，8月28日（三）凋亡細(xì)胞的原位末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（insituterminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-digoxigenin(biotin)nickend-labeling,TUNEL）

細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制作用的最終環(huán)節(jié)是細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴露出的3?羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT）或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。第八十一頁，共九十頁，2022年，8月28日1．試劑盒