基因工程第八章基因工程

第八章基因工程基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重組、DNA克隆、分子克隆克?。╟lone）無性繁殖應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物。基因克隆示意圖基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國轉(zhuǎn)基因魚

1993

基因工程西紅柿在美國上市1997英國羅斯林研究所多莉羊1999.9中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測定人類基因組全部序列的1%科學(xué)家公布人類基因組工作草圖公布人類基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程胰島素人生長激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長激素促生長素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組基因重組(geneticrecombination)——整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間,甚至不同物種間進(jìn)行交換,并能在新的位置上復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和翻譯自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無目的基因工程有目的結(jié)合作用質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)化作用transformation

通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過程轉(zhuǎn)導(dǎo)作用transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑；溶原菌途徑基因工程工具酶載體重組DNA技術(shù)的基本過程真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染克隆基因的表達(dá)工具酶酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的的工具具酶：：一把特特殊的的剪刀刀——限制性性內(nèi)切切酶的的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)阿爾伯伯(Arber)、史密密斯(Smith)和內(nèi)森森斯(Nathans)，獲1978年年諾貝貝爾生生理學(xué)學(xué)和醫(yī)醫(yī)學(xué)獎獎1953年年，Arber研究究噬菌菌體與與細(xì)菌菌（A、B）的的關(guān)系系。發(fā)現(xiàn)100-200個(gè)子子代噬噬菌體體中，，只有有1個(gè)個(gè)可感感染B，即即其他他的噬噬菌體體在B中受受到限限制，，唯有有這一一個(gè)受受到修修飾（（甲基基化））后感感染成成功。。細(xì)菌B：在在缺甲甲硫氨氨酸的的培養(yǎng)養(yǎng)基中中，細(xì)細(xì)菌死死亡。。原因：：細(xì)菌菌無法法對自自己的的DNA進(jìn)進(jìn)行修修飾。。假設(shè)：：限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶與修修飾酶酶。1967年年，Smith，分分析限制性性內(nèi)切酶的的識別和切切割序列，，認(rèn)為它由由5-6個(gè)個(gè)堿基組成成原因：限制制性酶將T7DNA切成成平均長度度為1000堿基的的片段。識別和切割割序列：中中心對稱的的回文結(jié)構(gòu)構(gòu)。限制性酶：：HindⅡNathans：用用限制性酶酶切割猴子子SV40DNA，DNA測序序。限制性核酸酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)識別雙鏈DNA內(nèi)部部特異位點(diǎn)點(diǎn)并裂解磷磷酸二酯鍵鍵分類：Ⅰ型型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：：發(fā)現(xiàn)次序序)識別和切割割位點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)4～～6bp出現(xiàn)兩種末末端粘性末端粘端平頭末端平端同工異源酶酶：來源不同，，但能識別別和切割同同一位點(diǎn)同尾酶：識別序列不不同，但產(chǎn)產(chǎn)生相同的的粘性末端端粘性末端與與平頭末端端修飾酶DNA聚合合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)T4DNA連接接酶(T4ligase)堿性磷酸酶酶(alkalinephosphatase)末端脫氧核核苷酰轉(zhuǎn)移移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合合酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠⅠ)的活活性5′至3′′的聚合活活性5′→3′方向核酸外切切酶活性5′→3′外切酶酶活性3′→5′外切酶酶活性polⅠⅠ經(jīng)枯草桿桿菌蛋白酶酶裂解可得得大、小兩兩個(gè)片段大片段（（Klenow片段）：聚合活活性、3′→5′外切活活性常用的工具具酶核酸外切酶酶活性3′→5′′外切酶活活性5′→3′′外切酶活活性末端脫氧核核苷酰轉(zhuǎn)移移酶(TDT)載體vectorDNA，，能在宿主主細(xì)胞中進(jìn)進(jìn)行自我復(fù)復(fù)制和表達(dá)達(dá)克隆載體、、表達(dá)載體體原核載體：質(zhì)粒(pBR322,pUC…）噬噬菌體體（λ，M13）等等真核載體：動物病毒毒載體pLXSN等等常用的克隆隆載體質(zhì)粒(plasmid)—存在于細(xì)細(xì)菌染色體體外的小型型環(huán)狀雙鏈鏈DNA分分子理想的質(zhì)粒?？截悢?shù)多;兩三個(gè)遺傳傳標(biāo)志，如如抗藥性基基因：抗氨芐青霉霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基基因(terr)；β-半乳糖苷酶酶基因(lacZ)篩選標(biāo)志多個(gè)限制酶酶的單一切切點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)常用的克隆隆載體λ噬菌體(λphage)基因組分三三個(gè)區(qū)域：：左側(cè)區(qū)、、中間區(qū)（非必需區(qū)區(qū)）、右側(cè)側(cè)區(qū)DNA，替替換型載體體，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系系列、λλgt系系列、charon系列粘性質(zhì)粒(cosmid)：：λDNA的cos區(qū)+質(zhì)粒，雙雙鏈環(huán)狀DNA，克克隆容量：：40~50kbM13噬菌菌體最大優(yōu)點(diǎn)：：產(chǎn)生單鏈鏈DNAcos:cohesive-endsite特點(diǎn)點(diǎn)：：RFDNA:replicationalformDNA優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)：：表達(dá)達(dá)載載體體(expressingvector)特點(diǎn)點(diǎn)：：帶帶表表達(dá)達(dá)構(gòu)構(gòu)件件——轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄和和翻翻譯譯所所需需的的DNA序序列列大腸腸桿桿菌菌表表達(dá)達(dá)載載體體：：含含啟啟動動子子——核核糖糖體體結(jié)結(jié)合合位位點(diǎn)點(diǎn)——克克隆隆位位點(diǎn)點(diǎn)——轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄終終止止信信號號啟動子子：trp-lac(tac)啟啟動子子、λλ噬菌菌體PL啟動子子、T7噬噬菌體體啟動動子核糖體體結(jié)合合位點(diǎn)點(diǎn)(ribosome-bindingsite,RBS)：：起始始密碼碼子(ATG)和SD序序列轉(zhuǎn)錄終終止序序列哺乳動動物表表達(dá)載載體真核表表達(dá)元元件：：啟動動子/增強(qiáng)強(qiáng)子——克隆隆位點(diǎn)點(diǎn)—終終止信信號和和加poly(A)信號號重組DNA技術(shù)的基基本過程目的基因因的制備備載體的選選擇和制制備DNA分分子的體體外連接接將外源DNA導(dǎo)導(dǎo)入宿主主細(xì)胞目的基因因的篩選選和鑒定定目的基因因(targetDNA)的制備目的基因因（外源源基因））制備基因因組DNA基因文庫庫(genomiclibrary)—存在于于轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)菌中、、克隆載載體攜帶帶的所有有基因組組DNA的集合合制備cDNAcDNA文庫(cDNAlibrary)制備用于于表達(dá)的的基因片片段：PCR技技術(shù)、化化學(xué)合成成載體的選選擇和制制備：λ噬菌體體、粘性性質(zhì)粒、、pUC系列列、M13噬菌菌體DNA分分子的體體外連接接（DNA連接接酶）粘性末端端連接連接效率率高相同酶切切末端平端連接接連接效率率低人工接頭頭(linker)法法同聚物接接尾法同聚物接接尾法將外源DNA導(dǎo)導(dǎo)入宿主主細(xì)胞基因工程程菌HB101,JM109轉(zhuǎn)化(transformation)制備感受態(tài)細(xì)細(xì)胞冷的氯化化鈣處理理，細(xì)胞胞處于最最適攝取取和容忍忍外來DNA的的生理狀狀態(tài)感染(infaction)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌菌體和細(xì)胞病病毒介導(dǎo)的遺遺傳信息轉(zhuǎn)移移過程轉(zhuǎn)染(transfection)：真核細(xì)胞胞主動攝取或或被動導(dǎo)入外外源DNA片片段而獲得新新的表型的過過程。目的基因的篩篩選和鑒定(screening/selection)遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertioninactivation):抗藥性標(biāo)志選選擇標(biāo)志補(bǔ)救表達(dá)產(chǎn)物與營營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)補(bǔ)α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選免疫學(xué)方法分子雜交探針原位雜交PCR限制性酶切圖圖譜IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ββ-D-半乳乳糖苷)bp—1534—994—695—515—377—237ABCM克隆基因的表表達(dá)載體有轉(zhuǎn)錄、、翻譯的元件件；密碼子子通用原核表達(dá)體系系原核表達(dá)載體體的標(biāo)準(zhǔn)合適適的的篩篩選選標(biāo)標(biāo)志志強(qiáng)啟啟動動子子翻譯譯控控制制序序列列多克克隆隆位位點(diǎn)點(diǎn)融合合蛋蛋白白（（fusionprotein,包包涵涵體體））表達(dá)達(dá)的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)或或多多肽肽的的N末末端端由由原原核核DNA編編碼碼，，C末末斷斷由由克克隆隆的的真真核核DNA編編目目。。大腸腸桿桿菌菌表表達(dá)達(dá)體體系系的的不不足足缺乏乏轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄后后加加工工機(jī)機(jī)制制，，只只能能表表達(dá)達(dá)cDNA缺乏乏翻翻譯譯后后加加工工機(jī)機(jī)制制，，不不能能折折疊疊和和糖糖基基化化融合合蛋蛋白白形形成成包包涵涵體體，，復(fù)復(fù)性性后后才才有有活活性性很難難表表達(dá)達(dá)大大量量的的可可溶溶性性蛋蛋白白真核核表表達(dá)達(dá)體體系系轉(zhuǎn)染染方方法法磷酸鈣鈣沉淀淀DEAE葡葡聚糖糖介導(dǎo)導(dǎo)轉(zhuǎn)染染電穿孔孔脂質(zhì)體體轉(zhuǎn)染染；人人造膜膜顯微注注射篩選標(biāo)標(biāo)志tk-NeorG418瞬時(shí)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染目的基基因不不整合合進(jìn)宿宿主基基因組組穩(wěn)定轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染目的基基因整整合進(jìn)進(jìn)宿主主基因因組tk-細(xì)胞突突變株株篩選選轉(zhuǎn)染染細(xì)胞胞胸苷激激酶（（tk）TTP：從從頭合合成（（氨甲甲喋呤呤阻斷斷），，補(bǔ)救救合成成HAT選擇擇（H：次次黃嘌嘌呤；；A：：氨甲甲喋呤呤；T：胸胸苷））tk+：生長長tk-+帶tk基基