分光光度計優(yōu)秀課件

分光光度計第一頁，共四十四頁，2022年，8月28日BasicUV-VisTheoryandApplications

分光光度計的原理與應(yīng)用第二頁，共四十四頁，2022年，8月28日一、基本原理利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計。分光光度計靈敏度高，測定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學研究工作中必不可少的基本手段之一。因此我們重點討論紫外/可見分光光度法的基本原理、儀器構(gòu)造及其在生化領(lǐng)域中的應(yīng)用等。第三頁，共四十四頁，2022年，8月28日電磁輻射的波長第四頁，共四十四頁，2022年，8月28日電磁波波長的范圍Region Wavelength(nm)Farultraviolet 10-200Nearultraviolet 200-380Visible 380-780Nearinfrared 780-3000Middleinfrared 3000-30,000Farinfrared 3×104-3×105Microwave 3×105-1×109第五頁，共四十四頁，2022年，8月28日Relationshipbetweenlightabsorptionandcolor第六頁，共四十四頁，2022年，8月28日電子躍遷類型與紫外吸收波長(nm)關(guān)系電子躍遷類型例子 紫外吸收波長范圍σ→σ*C－H 100～150nmπ→π*(非共軛)C＝O ＜200nmπ→π*(共軛)＝C－C＝ 200～300nmn→π*C＝O ～300nm第七頁，共四十四頁，2022年，8月28日Examplesoftransitionsandresultingλmax第八頁，共四十四頁，2022年，8月28日π→π*躍遷：此類躍遷所需能量較小，吸收波長在紫外區(qū)的200～300nm，不飽和烴、共軛烯烴及芳香烴均可發(fā)生這類躍遷，氨基酸、蛋白質(zhì)與核酸均含有大量共軛雙鍵，因而200～300nm的紫外吸收測定，在生化實驗技術(shù)中有極廣泛的用途。第九頁，共四十四頁，2022年，8月28日Commonlyusedsolventsandtheir'cut-off'wavelengthsSolvent 溶劑 Cut-off(nm)Iso-octane辛烷 202Ethylalcohol乙醇 205Cyclohexane環(huán)己烷 200Acetone丙酮 325Tetrachloroethylene四氯乙烯 290Benzene苯 280Carbontetrachloride四氯化碳 265Chloroform氯仿 245Ethylether乙醚 220Isopropylalcohol異丙醇 210Methylalcohol甲醇 210第十頁，共四十四頁，2022年，8月28日不同溶劑對酚紫外檢測的影響第十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日若逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長，并測定物質(zhì)對各種波長光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波長λ作橫坐標，“A”或“T”為縱座標，畫出連續(xù)的“A~λ”或“T~λ”曲線，即為該物質(zhì)的吸收光譜曲線。第十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日吸收峰的命名曲線上“A”處稱最大吸收峰，它所對應(yīng)的波長稱最大吸收波長，以λmax表示。曲線上“B”處有一谷，稱最小吸收，它所對應(yīng)的波長，所對應(yīng)的波長，稱最小吸收波長，以λmin表示。曲線上在最大吸收峰旁邊有一小峰“C”，稱肩峰。在吸收曲線的波長最短的一端，曲線上“D”處，吸收相當強，但不成峰形，此處稱為末端吸收。第十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日λmax是化合物中電子能級躍遷時吸收的特征波長，不同物質(zhì)有不同的最大吸收峰，所以它對鑒定化合物極為重要。吸收光譜中，λmax、λmin、-肩峰以及整個吸收光譜的形狀決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而異，所以是物質(zhì)定性的依據(jù)。測定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標準的紫外光譜圖相對照，對照時須注意測定的條件，如溶劑、濃度等。第十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜有許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進行化合物定性鑒定時，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團或基團，因此在鑒定時應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。由于電子躍遷的同時也引起分子的轉(zhuǎn)動和振動光譜，要把電子躍遷和分子振動、轉(zhuǎn)動的躍遷完全分開是不可能的，因此我們常見的紫外吸收光譜是由一個或幾個寬的吸收譜帶所組成。第十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日紫外光譜中常用的術(shù)語發(fā)色團、助色團、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。發(fā)色團：凡是與飽和碳氫化合物連接能引起n→π*、π→π*、n→σ*等電子躍遷的基團稱為發(fā)色團。例如：C＝C、C＝O等。助色團：助色團是一些具有非共價鍵的基團（如OH、NH2、SH等）。這些基團在波長＞200nm處沒有吸收，當它與發(fā)色團相連接時，使發(fā)色團的吸收帶向長波移動，稱為紅移（或淺色效應(yīng)），紅移的同時吸收帶的強度增加。若助色團與發(fā)色團相連接，產(chǎn)生n→π*躍遷，使吸收波長向短波移動，稱為蘭移（或深色效應(yīng)）。第十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日增色效應(yīng)（hyperchromiceffect）核酸變性或降解，使得DNA或RNA溶液對紫外光的吸收明顯增加，即ε值（吸光系數(shù)或稱消光系數(shù)）顯著升高，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。此效應(yīng)是由于堿基之間電子相互作用的改變所致，通常在260nm處測量。第十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日減色效應(yīng)（hypochromiceffect）在一定的條件下，變性的核酸又可以復(fù)性，此時ε值又明顯減少，回復(fù)到原來的核酸分子ε值較低的水平，即此時DNA或RNA溶液的紫外光吸收顯著降低，此現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)，此效應(yīng)也是由于堿基之間電子相互作用的變化所引起的，通常在260nm條件下測量。第十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日光吸收定律朗伯——比爾（Lambert－beer）光吸收定律：

A＝-lgT＝εbcA——吸光度，又稱光密度“O.D”。T——透光度，T＝I/I。，I?！獮檎丈涞轿粘厣系墓鈴姡琁——為透過吸收池的光強。ε——摩爾吸光系數(shù)（L·mol-1·cm-1）。b——樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收池，b=1cm。C——樣品濃度（mol/L）。吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。第十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日檢測計算溶液的摩爾濃度例如：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2×103M-1cm-1（M＝mol/L)?！逜＝εbC∵A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C=7.1×10-5mol/L第二十頁，共四十四頁，2022年，8月28日二、分光光度計的組成和構(gòu)造組成：各種型號的紫外/可見分光度計，不論是何種型式，基本上都由五部分組成：光源：鎢燈和氘(dao)燈單色器（包括產(chǎn)生平行光和把光引向檢測器的光學系統(tǒng)）；樣品室；接收檢測放大系統(tǒng)；顯示或記錄器。第二十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日⑴光源理想光源的條件是：①能提供連續(xù)的輻射；②光強度足夠大；③在整個光譜區(qū)內(nèi)光譜強度不隨波長有明顯變化；④光譜范圍寬；⑤使用壽命長，價格低。用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長范圍是320～1100nm。由于能量輸出的波動為電壓波動的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuteriumlamp），適用波長范圍是195～400nm，由于氘燈壽命有限，國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時左右，要注意節(jié)約燈時。第二十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日鎢燈燈絲溫度和波長的關(guān)系第二十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日⑵單色器單色器是分光光度計的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是：①入射狹縫——限制雜散光進入。②色散元件——即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。③準直鏡——把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平等光，并把來自色散元件的平等光聚焦于出射狹縫上。④出射狹縫——只讓額定波長的光射出單色器轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵的波長盤，可以改變單色器出射光束的波長；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。光柵：光柵有透射光柵和反射光柵，實際應(yīng)用的都是反射光柵，它又可分為平面反射光柵（即通稱的反射光柵或閃爍光柵）和凹面反射光柵兩類，凹面反射光柵可以起色散元件和準直鏡兩個作用，使色散后的光束聚焦于出射狹縫，得到銳線光譜。第二十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日狹縫、光譜頻帶寬度和分辨率出射狹縫的寬度通常有兩種表示方法：一為狹縫的實際寬度，以毫米（mm）表示，另一種為光譜頻帶寬度，即指由出射狹縫射出光束的光譜寬度，以毫微米nm表示。例如，出射狹縫的寬度是6nm，并不是說出射狹縫的寬度是6nm，而是指由此狹縫射出的光具有6nm的光譜帶寬。第二十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日純粹的單色光只是一種理想情況，分光光度計所能得到的“單色光”，實際上只是具有一定波長范圍的譜帶，狹縫越寬，所包括的波長范圍也愈寬。對單色光純度來說，狹縫是愈窄愈好，但光的強度也就越弱，因此狹縫不能無限制地小，狹縫的最小寬度取決于檢測器能準確地進行測量的最小光能量。目前達到的最小寬度為0.1nm。由于光柵分光其色散是線性的，所以只用一種狹縫寬度對各種波長的光的測量，其分辨率都相同，即狹縫寬度不必經(jīng)常調(diào)節(jié)。只要光強能達到要求，應(yīng)使用盡可能小的狹縫寬度，以提高分辨率。第二十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日⑶樣品室包括池架、吸收池（即比色杯）以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為0.1℃，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達0.05℃。吸收池有光學玻璃杯和石英玻璃杯兩種。光學玻璃杯因為普通光學玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長范圍是400nm～2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm～3000nm。第二十七頁，共四十四頁，2022年，8月28日吸收池使用注意事項要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時可放在1％洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可用綢布絲線或軟塑料制作小刷子清洗。嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。吸收池的校正：要固定參比杯和樣品杯，可在杯的毛玻璃面上寫上記號。用盛有參比液的參比杯和樣品杯測定吸光度“A0”，樣品杯換上樣品液后測定的吸光度為“A1”，則校正后的實際吸光度A為：A=A1－A0第二十八頁，共四十四頁，2022年，8月28日⑷檢測器檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。光電二極管：原理是硅二極管受紫外～近紅外輻射照射時，其導(dǎo)電性增強的大小與光強成正比。近年來分光光度計使用光電二極管作檢測器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長，價格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計都在使用它作檢測器。尤其值得注意的是由于計算機技術(shù)的飛速發(fā)展，使用光電二極管的二極管陣列分光光度計有了很大發(fā)展，二極管數(shù)目已達1024個，明顯提高了分辨率。這種新型分光光度計的特點是“后分光”，即氘燈發(fā)射的光經(jīng)透鏡聚焦后穿過樣品吸收池，經(jīng)全息光柵色散后被二極管陣列的各個二極管接收，信號由計算機進行處理和存儲，因而掃描速度極快，約10ms就可完成全波段掃描，繪出吸光度、波長和時間的三維立體色譜圖，可以最方便快速地得到任一波長的吸收數(shù)據(jù)，它最適宜用于動力學測定，也是高效液相色譜儀最理想的檢測器。第二十九頁，共四十四頁，2022年，8月28日顯示輸出裝置低檔分光光度計現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機?，F(xiàn)代高性能分光光度計均可以連接微機，而且有的主機還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機。有的還帶有標準軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便（例如SPECORD200）。第三十頁，共四十四頁，2022年，8月28日分光光度計光路原理圖光源切換鏡石英鹵素燈氘燈濾色盤場鏡入口球面反光鏡基準轉(zhuǎn)換鏡旋轉(zhuǎn)鏡電機螺環(huán)鏡樣品室凹形全息光柵出口第三十一頁，共四十四頁，2022年，8月28日分光光度法在生化實驗中的應(yīng)用分光光度計除用于常規(guī)的吸光度測定和吸收光譜的掃描外，常用的分光光度法還有導(dǎo)數(shù)分光光度法、催化動力學分光光度法和差示分光光度法等。在生化實驗中主要用于氨基酸含量的測定、蛋白質(zhì)含量的測定、核酸的測定、酶活力測定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動力學的研究等。相對濃度、分子構(gòu)象、反應(yīng)過程記錄等等。第三十二頁，共四十四頁，2022年，8月28日NAD和NADH吸收光譜的對比第三十三頁，共四十四頁，2022年，8月28日三、Helios儀器特點采用全息母光柵（不是復(fù)制光柵），可獲得優(yōu)異的光學性能和耐久性，即使在高吸光度3A下也能保持線性。采用步進馬達單色器，配合HattenModulator調(diào)制器，使得無論是高速掃描還是低速掃描，其掃描曲線完全重合（沒有峰值）。真正的雙光束，光束能量比為樣品/參比=80/20，可獲得良好的信噪比。標準軟盤，存取方便，方便計算機的應(yīng)用。第三十四頁，共四十四頁，2022年，8月28日主機功能SCAN：測定吸收值和吸收峰FIXED：在一固定波長下的吸收值QUANT：濃度測定（以一標準作參照）RATE：一定時間范圍內(nèi)吸收值的變化曲線。存盤第三十五頁，共四十四頁，2022年，8月28日配件功能連續(xù)進樣分析：加流動池配件（SUPPERSIPPER）打?。号浯蛴C計算機控制：配計算機核酸解鏈分析：配核酸解鏈配件（水浴+溫控）酶動力學：溫控裝置。第三十六頁，共四十四頁，2022年，8月28日操作步驟開機預(yù)熱：電源在機器后面。在HOME主頁上選擇功能，用箭頭（機子右下角）選擇，確定后按ENTER，再進一步用箭頭，光標和ENTER選，直到所有功能（參數(shù)）確定。調(diào)零