分子印跡漬與分子雜交技術(shù)

分子印跡漬與分子雜交技術(shù)第一頁，共五十九頁，2022年，8月28日固相支持物應(yīng)具備的特點(diǎn)：1)具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力（>10μg/

cm2

）2)與核酸結(jié)合后，不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)。3)與核酸穩(wěn)定牢固結(jié)合，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作過程。4)非特異性吸附少，洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫掉。5)具有良好的機(jī)械性能，如柔軟性，柔韌性。第二頁，共五十九頁，2022年，8月28日幾種常用固相支持物1)硝酸纖維素慮膜（nitrocellulosefiltermembrane）具有較強(qiáng)吸附單鏈DNA和RNA的能力（高鹽下達(dá)80μg/

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～100μg/

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）。真空烘干后，依靠疏水性相互作用。雜交本底較低。－－不易反復(fù)雜交和洗膜（結(jié)合力）－－質(zhì)地較脆，烘烤后更甚，小心操作－－與核酸結(jié)合依賴高鹽，低鹽結(jié)合不佳，不易核酸電轉(zhuǎn)第三頁，共五十九頁，2022年，8月28日2)

尼龍膜（nylonmembrane）結(jié)合單鏈DNA和RNA的能力比NC膜強(qiáng)（達(dá)350μg/

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～500μg/

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）。真空烘干后或紫外線照射可強(qiáng)化結(jié)合（短波UV照射后,

部分嘧啶堿基與其氨基交聯(lián)，更加牢固）。微波處理和堿處理也可促結(jié)合，從而使細(xì)菌裂解、DNA

變性與固定一步完成（菌落原位雜交）。韌性較強(qiáng)，操作方便。能結(jié)合小分子核酸。低鹽也能很好結(jié)合（可用于核酸電轉(zhuǎn)移）。可反復(fù)雜交和洗膜。－－雜交本底較高第四頁，共五十九頁，2022年，8月28日3)

化學(xué)活化膜（chemicalactivatedmembrane）將慮膜用一定的化學(xué)物質(zhì)處理后即形成化學(xué)活化膜（如ABM和APT纖維素膜），這種化學(xué)活化膜經(jīng)特殊處理而活化，產(chǎn)生活化基團(tuán)（重氮鹽）與DNA或RNA分子共價(jià)結(jié)合。

DNA與膜共價(jià)結(jié)合，反復(fù)多次使用不會(huì)損耗太多。對(duì)不同大小的核酸片段都具有同等的結(jié)合能力（NC、NL不具備)－－結(jié)合能力較NC膜低－－活化過程較復(fù)雜4)

濾紙結(jié)合能力較弱，但經(jīng)濟(jì)（基因文庫(kù)粗篩的菌落原位雜交）第五頁，共五十九頁，2022年，8月28日

是指將核酸,蛋白質(zhì)等生物大分子固定在纖維膜上的過程。將核酸或蛋白質(zhì)從電泳后的凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上或直接將核酸點(diǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜（1）物理吸印方法（毛細(xì)虹吸真空抽吸）（2）電轉(zhuǎn)印方法第六頁，共五十九頁，2022年，8月28日第七頁，共五十九頁，2022年，8月28日印跡（漬）技術(shù)SouthernBlot－－DNA（由EdwinMellorSouthern

等人首次應(yīng)用）（1975年，Southren創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進(jìn)行雜交的方法，被稱為Southren印跡法。）NorthernBlot－－RNA

（Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡。）WesternBlot－－Protein（immunoblotting)

（1979年Towbin等設(shè)計(jì)了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再與相應(yīng)的抗體等配體反應(yīng)，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓完成轉(zhuǎn)移。）第八頁，共五十九頁，2022年，8月28日EasternBlot（1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上，稱Eastern印跡。）

DotBlotInsituhybridization

第九頁，共五十九頁，2022年，8月28日固相核酸印跡雜交類型Southern印跡雜交（southernblot）Northern印跡雜交（Northernblot）斑點(diǎn)雜交（Dotblot）菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置第十頁，共五十九頁，2022年，8月28日

流程1.將核酸分子酶切成為多個(gè)片段2.變性電泳（或者電泳之后變性），使各片段分離3.將凝膠中的核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上4.預(yù)雜交雜交5.洗膜6.檢測(cè)第十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日第十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日

流程1.將核酸分子酶切成為多個(gè)片段2.變性電泳（或者電泳之后變性），使各片段分離3.將凝膠中的核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上4.預(yù)雜交雜交5.洗膜6.檢測(cè)第十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日固相核酸分子雜交類型Southern印跡雜交（southernblot）Northern印跡雜交（Northernblot）斑點(diǎn)雜交（Dotblot）菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置第十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日斑點(diǎn)雜交（Dotblot）斑點(diǎn)雜交法是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot(Bio–Rad)和Hybri–Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。第十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日第十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日（1）DNA斑點(diǎn)雜交①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置，將DNA點(diǎn)樣于膜上。每個(gè)樣品一般點(diǎn)50μl（2～10μgDNA）。④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆?。第十七頁，共五十九頁?022年，8月28日RNA斑點(diǎn)雜交：1）與上法類似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化）。2）將RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l甲醛）使RNA變性。3）然后取5～8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。第十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日一種簡(jiǎn)化的提取和純化RNA的方法用含0.5%NonidetP40（諾乃洗滌劑）的低滲緩沖液對(duì)動(dòng)物細(xì)胞作簡(jiǎn)單處理，離心去掉細(xì)胞核和細(xì)胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細(xì)胞質(zhì)提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點(diǎn)到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測(cè)大量標(biāo)本，而只需極少量的細(xì)胞（5×104）或組織。整個(gè)RNA實(shí)驗(yàn)中，要防止激活內(nèi)源性Rnase。第十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日固相核酸分子雜交類型Southern印跡雜交（southernblot）Northern印跡雜交（Northernblot）斑點(diǎn)雜交（Dotblot）菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置第二十頁，共五十九頁，2022年，8月28日菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）第二十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟如下：①將濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1～2mm大小的菌落。③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面上在，注意防止在濾膜底面存有氣泡。④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/lNaCl,0.5mol/LTris·NaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/lNaCl,0.5mol/LTris·HCl，pH8.0）浸濕的濾紙上，放置10min。重復(fù)中和1次。⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/LNaH2PO4(PH7.4),20mmol/LEDTA(pH7.4)。⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。第二十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日固相核酸分子雜交類型Southern印跡雜交（southernblot）Northern印跡雜交（Northernblot）斑點(diǎn)雜交（Dotblot）菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置第二十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日

組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此,原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）第二十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日

原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/lHCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進(jìn)一步完善和提高用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針的長(zhǎng)度以100～400nt為宜，過長(zhǎng)則雜交效率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針。因此，寡核苷酸探針和不對(duì)稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。第二十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日

(FISH)fluorescentinsituhybridization第二十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日WESTERNBLOT第二十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日其基本過程為：（1）首先做蛋白質(zhì)的SDS電泳。（2）然后將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印到固相膜上。（3）在膜上以相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原／抗體反應(yīng)。（4）顯色。本方法結(jié)合了凝膠電泳分辨率高和免疫檢測(cè)靈敏特異的特點(diǎn)，能從混雜的蛋白質(zhì)中檢測(cè)出特定的抗原。第二十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日第二十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)膜Protein

HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、顯色第三十頁，共五十九頁，2022年，8月28日mRNA=messengerRNA

ECD=extracellulardomain

ELISA=enzyme-linkedimmunosorbentassay

IHC=immunohistochemistry

CISH=chromogenicinsituhybridization

PCR=polymerasechainreaction

FISH=fluorescenceinsituhybridization第三十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日1.ExtractDNAfromcellExtractRNAfromcellExtractproteinfromcell

Southernblot

Northernblot

Westernblot2.Cutwithrestrictionenzyme3.Runongel(usuallyagarose)Runongel(usuallyagarose)Runongel(usuallypoly-acrylamide–calledPAGE)4.DenaturewithalkaliDenaturewithformaldahydeDenaturewithSDS5.Transferbycapillaryactionbycapillaryactionbyelectrophoresis6.BlockwithexcessDNABlockwithexcessRNA

Blockwithexcessprotein7.HybridizewithlabeledHybridizewithlabeledHybridizewithlabeled

DNAprobe

DNAprobeAntibodyprobe8.Washoffunboundprobe9.AutoradiographAutoradiographAutoradiographordevelopwithchromogenicsubstrate第三十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日分子雜交技術(shù)

Hybridizationtechnique

（在DNA與DNA，DNA與RNA之間，存在著堿基互補(bǔ)的關(guān)系，在加熱或加入變性劑等條件下，DNA雙鏈之間的氫鍵被破壞，雙鏈解開成為單鏈，此時(shí)加入有互補(bǔ)序列的DNA或RNA，在一定離子強(qiáng)度和溫度下保溫，則加入的DNA或RNA可與模板鏈形成穩(wěn)定的DNA-DNA或DNA-RNA異源雙鏈，此過程稱為雜交。）核酸分子雜交的基礎(chǔ)不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈

第三十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日堿基堿基糖磷酸基第三十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日堿基互補(bǔ)第三十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日核酸分子雜交的原理第三十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日分子雜交技術(shù)的發(fā)展1961年，Hall等探針與靶序列在溶液中雜交1962年，Bolton等設(shè)計(jì)DNA-瓊脂技術(shù)60年代中期Nygaard等研究應(yīng)用硝酸纖維素（NC）膜70年代到80年代早期，隨分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展，核酸雜交技術(shù)有了突破性進(jìn)展應(yīng)用：目前核酸雜交技術(shù)與其它技術(shù)相結(jié)合廣泛應(yīng)用于特定基因的表達(dá)、基因定位、遺傳病的檢測(cè)、組織病理學(xué)的研究、生物分類方面。第三十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針探針的分類根據(jù)核酸分子探針的來源及其性質(zhì)可以分為第三十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。②DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。cDNA探針用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點(diǎn)有下面三點(diǎn)：

第三十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日RNA探針的主要優(yōu)點(diǎn)有①RNA/RNA和RNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性較DNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性高，雜交反應(yīng)可以在更為嚴(yán)格的條件下進(jìn)行（雜交溫度可提高10℃

左右），因而雜交的特異性更高。②單鏈RNA分子由于不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，其與待測(cè)核酸順序雜交的效率較高。③RNA中不存在高度重復(fù)序列，因此非特異性雜交也較少。④雜交后可用Rnase將未雜交的游離探針消化掉，從而使本底降低。mRNA中存在的多聚腺苷酸尾，有時(shí)會(huì)影響雜交的特異性，此缺點(diǎn)可以通過在雜交液中加入poly（A)將待測(cè)核酸序列中可能存在的poly（dT)或poly（U)封閉而加以克服。

第四十頁，共五十九頁，2022年，8月28日①由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短。②寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基的錯(cuò)配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg），使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過細(xì)心篩選序列和/或選擇相對(duì)長(zhǎng)的序列（＞30nt）亦可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18～40個(gè)堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。下面是篩選寡核苷酸針的一些原則：

寡核苷酸探針第四十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日理想的寡核苷酸探針應(yīng)具備的條件長(zhǎng)18－50nt,較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量低；較短探針特異性會(huì)差些堿基成分：G＋C含量為40％－60％，超出此范圍則會(huì)增加非特異性雜交探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)），如－GGGGG一旦選下某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將該序列與核酸庫(kù)中序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70％或有連續(xù)8個(gè)或更多堿基的同源，否則，該探針不能用第四十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日未知序列的基因探針（可以從蛋白質(zhì)多肽序列推測(cè)寡核苷酸序列）其遵循的原則有：1）要盡量選擇那些只有一種編碼的氨基酸（如色氨酸UGG和甲硫氨酸AUG）的多肽作為合成寡核苷酸探針的參照。2）盡管同一氨基酸可由多種密碼子編碼，但其使用頻率是不一樣的，因此應(yīng)優(yōu)先考慮使用頻率最高的密碼子。第四十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日3）前一個(gè)氨基酸的密碼子也會(huì)影響下一個(gè)氨基酸密碼子的使用，在真核基因中，極少有5’-CG-3’序列出現(xiàn)。在密碼子內(nèi)部凡是存在CG序列的密碼子其使用頻率也較低。在兩個(gè)密碼子間的情況也是同樣。因此在設(shè)計(jì)寡核苷酸探針時(shí)，當(dāng)兩個(gè)相鄰的氨基酸的最高頻率密碼子相鄰會(huì)導(dǎo)致CG序列出現(xiàn)時(shí)，應(yīng)將其中一個(gè)氨基酸的密碼子換為次高頻率密碼子。通常是將前一個(gè)密碼子NNC換為NNT。（甘氨酸GGC(GGA)和蘇氨酸ACC(ACA)除外）。4）參考同一基因家族的基因序列，對(duì)于密碼子的正確選擇也是有所幫助的。5)為盡可能減少假陰性結(jié)果，可合成各種可能的寡核苷酸探針分別或混合進(jìn)行探測(cè)。混合雜交探測(cè)時(shí)，由于各探針的（G+C）%含量不同，因此需分別在不同的溫度下進(jìn)行探測(cè)。第四十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日人腫瘤壞死因子中第104~116位氨基酸的順序：glu谷-thr蘇-pro脯-glu谷-gly甘-ala丙-glu谷-ala丙-lys賴-pro脯-trp色-tyr酪-glu谷1）選擇最高頻密碼子，堿基序列為：2）修改CG序列，堿基序列為：5’-GAGACCCCTGAGGGAGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAG-3’實(shí)際序列（95%）：5’-GAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAG-3’5’-GAGACCCCCGAGGGCGCCGAGGCCAAGCCCTGGTACGAG-3’第四十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端標(biāo)記隨機(jī)引物法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法化學(xué)標(biāo)記技術(shù):直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上探針的制備

第四十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日缺口平移

該技術(shù)由Kelly等于1970年創(chuàng)立。其原理是首先用DNA酶在雙鏈DNA探針分子的一條鏈上制造一些缺口（nick）,缺口處會(huì)形成3’—羥基末端，這時(shí)再在大腸桿菌DNA聚合酶I的催化下將核苷酸殘基加在3’－羥基上，同時(shí)，根據(jù)大腸桿菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶將缺口5’側(cè)核苷酸依次切除。其結(jié)果是在缺口平移。根據(jù)這個(gè)原理，如果用高強(qiáng)度的放射性核苷酸（通常為α-32PdATP）置換先前存在的核苷酸。用缺口平移法標(biāo)記的DNA探針能滿足大多數(shù)雜交要求。

第四十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日第四十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日探針的標(biāo)記缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端標(biāo)記隨機(jī)引物法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法化學(xué)標(biāo)記技術(shù):直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上第四十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日隨機(jī)引物延伸

這是以單鏈DNA或RNA模板合成高比活性32P標(biāo)記探針?biāo)x用的方法。原理是使長(zhǎng)6～8nt的寡核苷酸片段與變性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以每一個(gè)退火到模板上的寡核苷酸片段為引物引發(fā)DNA鏈的合成，在反應(yīng)時(shí)將[α-32P]dNTP摻入合成鏈，即得到標(biāo)記。變性處理后，新合成鏈（探針片段）與模板解離，即得到無數(shù)各種大小的探針DNA。因?yàn)樗霉押塑账崞魏芏?，在低溫條件下可與模板DNA隨機(jī)發(fā)生退火反應(yīng)，因此被稱為隨機(jī)引物（randomprimer）。這種隨機(jī)引物可用小牛胸腺DNA或魚精DNA制備。第五十頁，共五十九頁，2022年，8月28日第五十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日探針的標(biāo)記缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端標(biāo)記隨機(jī)引物法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法化學(xué)標(biāo)記技術(shù):直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上第五十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日聚合酶鏈反應(yīng)

PCR技術(shù)有許多重要用途，其中之一便是可用來標(biāo)記高比活性DNA探針。PCR技術(shù)具有很高的特異性，可在1～2h之內(nèi)大量合成探針DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它標(biāo)記的dNTP，則探針DNA合成過程中可得到很好的標(biāo)記，標(biāo)記物的摻入率可高達(dá)70%～80%。因此，PCR標(biāo)記技術(shù)特別適用于大規(guī)模檢測(cè)和非放射性標(biāo)記。該法的缺點(diǎn)是要合成一對(duì)特異性PCR引物。使用從探針DNA上制備的小片段作引物也能取得較好的標(biāo)記效果。第五十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日探針的標(biāo)記缺口平移法(nicktranslation)DNA快速末端標(biāo)記隨機(jī)引物法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法化學(xué)標(biāo)記技術(shù):直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上第五十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日探針標(biāo)記物應(yīng)具備的條件

(探針（probe)是指能與特定的靶分子發(fā)生特異性結(jié)合并能以特殊的方法被探知的分子.)

高度靈敏性標(biāo)記物與探針的結(jié)合不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針分子的主要理化特性esp.Tm值用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時(shí)酶的活性應(yīng)不受影響檢測(cè)應(yīng)具有特異