基因工程31載體

第三章第一部分

基因克隆的載體VehiclesforGeneCloning:PlasmidsandBacteriophages基因克隆載體的要求1.最重要的：能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。產(chǎn)生出大量重組DNA分子的拷貝并傳遞給子代細(xì)胞。2.有相對(duì)較小的體積，理想情況下不超過10kb。因?yàn)榇蠓肿尤菀自诩兓^程中被折斷，同時(shí)也會(huì)給其他一些操作帶來困難。有兩種細(xì)菌中存在的DNA分子能夠滿足這些條件：質(zhì)粒和噬菌體染色體。2.1質(zhì)粒

質(zhì)粒的基本特性質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中獨(dú)立存在的一種環(huán)狀DNA分子(圖2-1)質(zhì)粒都帶有一個(gè)或多個(gè)基因，這些基因的表達(dá)常常賦予宿主細(xì)胞一些有用的特征。如，能夠存活在含有致死濃度的氯霉素和氨芐青霉素培養(yǎng)基中的細(xì)胞，是因?yàn)檫@些細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒中攜帶有相應(yīng)的抗生素耐藥性基因。實(shí)驗(yàn)室中，抗生素耐藥性通常作為一種選擇性標(biāo)記(selectablemarker)來確認(rèn)培養(yǎng)物中的細(xì)菌是否含有特定的質(zhì)粒(圖2-2)。所有的質(zhì)粒都至少含有一段可作為復(fù)制起點(diǎn)的DNA序列，因此能夠在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于宿主細(xì)胞本身的復(fù)制周期而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增[圖2-3(a)]。小一些的質(zhì)?？梢岳盟拗骷?xì)胞本身的DNA復(fù)制酶來對(duì)自身進(jìn)行拷貝，而一些較大的質(zhì)粒本身攜帶有能夠編碼自身質(zhì)粒復(fù)制所需的專一性酶的基因。非整合型質(zhì)粒整合型質(zhì)粒或游離型質(zhì)粒(episome)即：通過將自己插入到宿主細(xì)胞染色體中來進(jìn)行復(fù)制[圖2-3(b)]僅占一小部分；可以以這種形式穩(wěn)定存在于細(xì)胞中很多代，但也會(huì)在某些階段以獨(dú)立的成分存在。

質(zhì)粒大小和拷貝數(shù)質(zhì)粒大小和拷貝數(shù)對(duì)于基因克隆尤其重要。質(zhì)粒的大小范圍從1.0kb到250kb不等，因此只有很小一部分質(zhì)粒能夠在克隆試驗(yàn)中得到應(yīng)用?？截悢?shù):在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中通常能夠找到的某個(gè)質(zhì)粒的分子數(shù)。每個(gè)質(zhì)粒都具備一個(gè)特征性的拷貝數(shù)(1-50)，但控制拷貝數(shù)的因素不完全了解。一般來說，一個(gè)有用的克隆載體需要以大量拷貝的形式存在于細(xì)胞中，以獲得大量的重組DNA。2.1.3接合性與相容性質(zhì)?？煞譃閮纱箢悾航雍闲再|(zhì)粒和非接合性質(zhì)粒。接合性質(zhì)粒:能夠促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞間的有性接合，這種轉(zhuǎn)移過程是受一系列轉(zhuǎn)移基因所控制，這些轉(zhuǎn)移基因存在于接合性質(zhì)粒中。非接合性質(zhì)粒：沒有上述性質(zhì)和基因。但，一個(gè)非接合性質(zhì)?？梢栽谀承┉h(huán)境下，在與接合性質(zhì)粒共存于同一個(gè)細(xì)胞的情況下，發(fā)生協(xié)同轉(zhuǎn)移。同一細(xì)胞中具有不同種類的質(zhì)粒，必然包含一種接合性質(zhì)粒。最多7種質(zhì)粒同時(shí)存在一個(gè)細(xì)胞，質(zhì)粒間彼此相容。如果兩個(gè)質(zhì)粒不能相容，其中一個(gè)很快從細(xì)胞中消失。根據(jù)質(zhì)粒間是否具備相容性，劃分成不同的不相容群體。同一群體中的質(zhì)粒間經(jīng)常以各種方式相關(guān)聯(lián)。相容性可能與質(zhì)粒復(fù)制過程有關(guān)

質(zhì)粒的種類分類：基于質(zhì)粒的主要特征本質(zhì)是質(zhì)粒的基因質(zhì)粒分為以下5種：(1)致育(fertility)質(zhì)粒或稱F質(zhì)粒僅攜帶轉(zhuǎn)移基因，能促進(jìn)質(zhì)粒間有性接合轉(zhuǎn)移；不再具備其他的特征。如：大腸桿菌中的F質(zhì)粒(2)耐藥性(resistance)質(zhì)?；蚍Q“R”質(zhì)粒攜帶有能夠賦予宿主細(xì)菌對(duì)一種或多種抗菌藥的耐藥性的基因，如抗氯霉素、氨芐青霉素或水銀。R質(zhì)粒通過正常的繁殖而傳播,對(duì)細(xì)菌感染的治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，如RP4，通常在假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)，但也能夠在其他細(xì)菌中出現(xiàn)(3)Col質(zhì)粒編碼大腸桿菌素，一種能夠殺死其他細(xì)菌的蛋白，如大腸桿菌的ColE1質(zhì)粒。(4)降解質(zhì)粒使宿主菌能夠代謝一些通常情況下無法利用的分子，如甲苯和水楊酸，如假單胞菌中的TOL質(zhì)粒。(5)毒性質(zhì)粒賦予宿主菌致病性，比如根瘤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒，能夠在雙子葉植物中誘導(dǎo)冠癭瘤。

細(xì)菌外其他生物體中的質(zhì)粒質(zhì)粒：細(xì)菌中廣泛存在，其他生物體中不常見。最典型的真核狀態(tài)質(zhì)粒

—釀酒酵母菌株中觀察到的2μm質(zhì)粒可以根據(jù)2μm質(zhì)粒構(gòu)建載體來轉(zhuǎn)化酵母其他真核生物中對(duì)質(zhì)粒的研究令人失望2.2噬菌體2.2.1噬菌體的基本特征噬菌體：一類能夠特異性侵染細(xì)菌的病毒。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單①一個(gè)DNA(或RNA)分子，包括與噬菌體復(fù)制有關(guān)的基因；②DNA(RNA)分子的外面包繞著一層保護(hù)性的蛋白分子構(gòu)成的外衣或稱衣殼。

噬菌體侵染模式所有均相同，分為3步：(1)噬菌體顆粒附著到細(xì)菌的外表面，并將自身的DNA染色體注入被侵染的細(xì)胞。(2)噬菌體DNA分子被復(fù)制。通常是在噬菌體自身基因編碼的特異性復(fù)制酶催化下完成的。(3)其他的噬菌體基因合成構(gòu)成衣殼的蛋白成分，新的噬菌體被組裝起來并被從細(xì)菌中釋放出來。對(duì)于一些噬菌體來說，完成整個(gè)侵染循環(huán)是一個(gè)非常迅速的過程，可能不超過20min。這種快速侵染的過程稱作裂解周期，因在釋放新生成的噬菌體過程中同時(shí)伴隨有原細(xì)菌細(xì)胞的裂解而得名。溶解性噬菌體的標(biāo)志性特征：在噬菌體DNA的復(fù)制完成后立刻開始衣殼蛋白的合成，而且噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)永遠(yuǎn)都無法以穩(wěn)定的狀態(tài)存在.

溶源性噬菌體溶源侵染的標(biāo)志：噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞中能夠穩(wěn)定存在，可能在細(xì)菌細(xì)胞上千次分裂后仍然存在，如λ噬菌體。噬菌體DNA插入到細(xì)菌的基因組中，此時(shí)噬菌體DNA稱作前噬菌體，是不發(fā)揮侵染作用的靜止?fàn)顟B(tài)。一個(gè)攜帶有前噬菌體的細(xì)菌，通常從生理上無法與未被侵染的細(xì)菌細(xì)胞相區(qū)分。前噬菌體最終會(huì)被從宿主細(xì)胞基因組中釋放出來，且噬菌體恢復(fù)裂解形式，并裂解細(xì)胞釋放出子代噬菌體。另有很少一部分溶源性噬菌體是完全不同的侵染循環(huán)。當(dāng)M13或相關(guān)的噬菌體侵染大腸桿菌時(shí)，新的噬菌體顆粒連續(xù)的組裝并從宿主細(xì)胞中釋放出來。但M13DNA并沒有整合到細(xì)菌基因組中，因此也不會(huì)變成靜止?fàn)顟B(tài)。所以，細(xì)胞裂解永遠(yuǎn)都不會(huì)發(fā)生，被侵染細(xì)菌能夠持續(xù)生長(zhǎng)和分裂，但是以一種相對(duì)于未侵染細(xì)菌來說較慢的速度進(jìn)行。盡管噬菌體種類繁多，但只有λ和M13被發(fā)現(xiàn)可以用作克隆載體。

λDNA噬菌體λ：典型的頭-尾結(jié)構(gòu)噬菌體DNA：包含在多面體的頭部中尾部的作用：使噬菌體附著在細(xì)菌表面并將DNA注入細(xì)菌細(xì)胞中

基因簇集對(duì)于基因表達(dá)的意義：可以通過類似開關(guān)的原理控制一群基因的作用，而不是對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行控制；對(duì)以λ噬菌體為基礎(chǔ)的克隆載體的構(gòu)建中，也起非常重要作用。

線形λDNAλ噬菌體第二個(gè)重要特征：λDNA分子的結(jié)構(gòu)線形λDNA：兩個(gè)游離端線形分子由兩條互補(bǔ)DNA鏈組成，線形分子任意一端都有一段短的由12個(gè)核苷酸組成的單鏈序列，這兩個(gè)單鏈DNA片段是互補(bǔ)的，因此能夠相互實(shí)現(xiàn)堿基配對(duì)最終形成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，一條完全的雙鏈分子?；パa(bǔ)單鏈常被稱作黏末端，它們之間的堿基配對(duì)能夠?qū)⒁粭lDNA分子的兩個(gè)黏末端連接起來(也能夠發(fā)生在兩個(gè)不同DNA分子間)。λ噬菌體的黏末端被稱作COS位點(diǎn)，COS位點(diǎn)起兩種截然不同的作用：1.使已經(jīng)注入細(xì)胞的線形DNA分子閉合成環(huán)，這是使噬菌體DNA分子插入細(xì)菌基因組的必要先決條件。2.作為限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列前噬菌體被從宿主細(xì)胞切除后，大量新λ噬菌體DNA分子通過滾環(huán)復(fù)制模式被復(fù)制出來。形成一個(gè)包含一系列線形基因組的連環(huán)體，由COS位點(diǎn)連接在一起。該內(nèi)切核酸酶是λDNA中基因A的表達(dá)產(chǎn)物，能夠切開雙鏈DNA分子并形成單鏈的黏末端，并與其他一些蛋白相耦聯(lián)，在將每個(gè)λ基因組包裹入一個(gè)噬菌體頭部的過程中發(fā)揮作用。剪切和包裝過程僅僅依靠識(shí)別COS位點(diǎn)及其周圍的DNA序列因此，改變?chǔ)嘶蚪M內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如插入新基因，在整個(gè)λ基因組長(zhǎng)度不發(fā)生劇烈改變的前提下，一般不會(huì)對(duì)源基因組的功能產(chǎn)生顯著影響。M13-纖維狀噬菌體M13是纖維狀噬菌體的代表，在結(jié)構(gòu)上與λ噬菌體有很大不同。M13DNA分子：比λ噬菌體小得多，僅6407bp通常為環(huán)狀雙鏈，特殊為環(huán)狀單鏈M13DNA分子相對(duì)較小的長(zhǎng)度意味著它供外源DNA插入的空間要比λ基因組小得多?？赡茉颍?.M13的衣殼僅由3種不同蛋白的多拷貝組裝而成(僅需3個(gè)基因);

λ噬菌體頭尾結(jié)構(gòu)包含15種不同蛋白。2.M13侵染周期相對(duì)λ簡(jiǎn)單一些，不需要將基因插入到宿主基因組中。M13DNA分子經(jīng)纖毛注入大腸桿菌。一旦細(xì)胞內(nèi)新的單鏈DNA分子開始作為模板生成一條互補(bǔ)鏈時(shí)，就能夠形成正常的雙鏈DNA。這個(gè)雙鏈分子不會(huì)插入細(xì)菌基因組，但會(huì)持續(xù)復(fù)制直到細(xì)胞中的拷貝數(shù)超過100。當(dāng)細(xì)菌分裂時(shí)每個(gè)子細(xì)胞都得到一個(gè)或多個(gè)噬菌體基因組的拷貝，這些拷貝也能夠繼續(xù)復(fù)制，以保證每個(gè)細(xì)胞中的總拷貝數(shù)。新噬菌體顆粒持續(xù)組裝和釋放，每一個(gè)被侵染細(xì)胞在經(jīng)過一代復(fù)制后都能夠產(chǎn)生1000個(gè)新的噬菌體。M13作為克隆載體的吸引力1.基因組小于10kb：對(duì)一個(gè)載體來說恰好處于令人滿意的范圍。2.M13基因組的復(fù)制型：非常像質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)時(shí)也能夠像質(zhì)粒一樣被處理。3.M13基因組容易從大腸桿菌培養(yǎng)中獲得，也能夠通過轉(zhuǎn)染而重新引入。4.最重要的是，以M13為載體克隆基因，能夠得到單鏈形式的DNA。單鏈形式的克隆基因在一些技術(shù)中能夠發(fā)揮作用，尤其是DNA測(cè)序和體外突變。使