基因探針分子雜交技術

基因探針分子雜交技術第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日目錄簡介基本原理分類歷史及發(fā)展主要應用第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日基因探針基因探針，即核酸探針，是一段帶有檢測標記，且序列已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。FISH第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日基因探針分析的基本原理兩條不同來源的核酸單鏈如果在一定區(qū)段具有互補的堿基序列,或者說具有一定的同源性,就可以特異性結合,形成雙鏈雜種分子,這種結合稱為核酸分子雜交。如果用已知核酸(通常是DNA)片段作為探針,通過與未知核酸(DNA或RNA)樣品進行雜交試驗,根據(jù)兩者雜交狀況的分析,就可以確定它們同源性程度,檢測特定核苷酸序列在樣品中的存在及含量。這便是核酸探針分析的基本原理。第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日分子雜交技術的分類根據(jù)其檢測對象不同，可分為檢測對象探針Southern雜交DNA核酸Northern雜交RNA核酸Western雜交蛋白質抗體根據(jù)探針來源的不同，可分為來源基因組探針（genomicprobe）基因組cDNA探針（cDNAprobe）mRNA寡核苷酸探針（Oligonucleotides

Probe）人工合成第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日基本操作程序印跡（blotting）將樣品在凝膠上分離，然后將樣品通過“影印”的方式轉移到固相支持物上（如濾膜）。雜交將已印跡有樣品的濾膜與帶有放射性標記或其它標記的探針進行雜交。結果檢測通過放射自顯影或顯色反應，判斷樣品中是否有與探針同源的分子。第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日Southern雜交檢測樣品DNA的處理電泳分離及變性處理轉移并固定到濾膜上探針的制備及雜交檢測與分析第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日檢測樣品DNA的處理提取檢測樣品的基因組DNA用限制性內切酶對其進行酶切，至大小不同的DNA片段第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日電泳分離及變性處理瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段變性處理通常DNA變性的方法：熱變性、酸堿變性、化學試劑變性在0.4MNaOH堿性條件下變性凝膠0.4MNaOH第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日轉移并固定到濾膜上通過毛細管虹吸法，將凝膠上的DNA轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。最后通過紫外線照射將DNA固定在濾膜上。第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日轉移的方法毛細管虹吸法、電轉移法、真空轉移法第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日探針的制備一、探針的合成 PCR、化學合成等方法二、探針的標記 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、熒光素等第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日地高辛：可以與dCTP連接成地高辛-dCTP

原理：

地高辛+

抗地高辛抗體（帶有熒光素或酶的標記）第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日雜交預雜交：將結合了DNA分子的濾膜先與特定的預雜液進行預雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。雜交：在一定的溫度和溶液條件下，將標記的探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸在濾膜上。第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日

洗膜：經(jīng)過一定的洗滌程序將游離的探針分子除去。精確控制雜交及洗滌條件（如溫度及鹽濃度），在同源序列中即使有一對堿基錯配也可檢出。這技術已應用于遺傳病（基因?。┑呐R床診斷。安裝雜交管雜交爐第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日檢測與分析1、放射自顯影：適用于放射性同位素標記的探針2、比色或化學發(fā)光檢測：適于非同位素標記的探針通過放射自顯影或生化檢測，就可判斷濾膜上是否存在與探針同源的DNA分子及其分子量。

第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日Northern雜交1、檢測對象為RNA。2、與Southern雜交不同的是：1）不需要限制性核酸酶切；2）變性方法不是堿變性，而是采用化學試劑變性法。3、主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異mRNA的表達水平，或比較不同組織或細胞的同一基因的表達情況。第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日Western雜交1、基本原理和基本過程與Southern雜交基本相同2、檢測對象為蛋白質（或酶）3、SDS電泳分離4、用“抗體-抗原”免疫反應或“DNA-protein”結合反應鑒別濾膜上的蛋白質。第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日歷史及發(fā)展1969年，Gall和Pardue（YaleUniversity）等首次將同位素探針用于原位雜交實驗，獲得成功。1987年，染色體原位抑制雜交法的創(chuàng)建，使FISH技術得以迅速發(fā)展。隨后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰熒光素等非放射性物質標記探針，創(chuàng)立了雙色FISH技術。1990年，Nederlof等用3種熒光素成功探測出了3種以上的靶位DNA序列，從而宣告了多色FISH技術的問世。Southern印跡雜交（Southernblot）是1975年由英國愛丁堡大學的創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。蛋白質印跡的發(fā)明者一般認為是美國斯坦福大學的喬治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼爾·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化學》（AnalyticalBiochemistry）中首次被稱為WesternBlot。發(fā)展：基因芯片技術、生物傳感器等。第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日分子雜交技術的主要應用

1.基因工程和分子生物學研究

2.檢測病原微生物及寄生蟲3.普查和診斷遺傳性疾病

4.法醫(yī)物證學

第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日基因工程和分子生物學研究作為生物技術核心的基因工程(重組DNA技術)是

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0年代興起的、按人們意愿定向改造生物遺傳性狀的技術。 其主要步驟是取得目的DNA,與載體DNA體外重組,將重組DNA分子導入宿主細胞,篩選能夠表達重組DNA的細胞加以傳代擴增。這中間篩選步驟,就可以用DNA探針進行菌落或噬菌體原位雜交來完成。第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日基因工程和分子生物學研究分子生物學研究中凡涉及核酸的定位、定量及序列分析等方面的工作,諸如染色體基因定位,基因突變及不同種屬間基因變異的研究,細胞

中DNA的轉錄過程的研究,以及探討病毒、腫瘤基因和細胞癌變之間可能存在的關系等,都需要應用分子探針技術。第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日檢測病原微生物及寄生蟲對于人體或環(huán)境中存在的細菌、病毒微生物,現(xiàn)行檢測方法既費時又不夠準確。如果用特異的DNA探針檢測微生物包含的核酸片段,不但靈敏快速,而且特異性強,甚至可以分析同種異株間的區(qū)別。DNA探針推廣至微生物檢驗上,對于診斷傳染病、開展流行病學研究將有重要意義。第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日檢測病原微生物及寄生蟲 乙型肝炎是危害我國人民健康的大敵,現(xiàn)在已開發(fā)DNA探針法檢測乙肝病毒DNA的技術,比現(xiàn)行的免疫學檢驗結果更靈敏可靠,是普查乙肝傳染的強有力手段,該技術正在國內普及推廣。 此外,DNA探針還可以應用于對利什曼原蟲病、瘧原蟲病等寄生蟲感染疾病的診斷。

第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日普查和診斷遺傳性疾病 人類和動物的遺傳性疾病是由于基因DNA的缺陷經(jīng)遺傳引起的。目前已知的三千多種遺傳性疾病中,只有很少一部分可以通過檢測基因的表達產(chǎn)物(蛋白質或酶)的改變予以診斷。用DNA探針可以在DNA水平分析基因結構的缺陷,突破依靠基因的蛋白產(chǎn)物進行診斷的局限。第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日普查和診斷遺傳性疾病對于因為基因內點突變或基因部分缺失、重排或插入而引起的遺傳性疾病,可以用DNA探針進行Southern印漬雜交直接加以分析診斷。對于那些尚不明其原發(fā)的基因缺陷的遺傳性疾病,則需要用DNA探針技術分析限制性片段長度多態(tài)性,以此作為遺傳標志作出分析診斷?？傊?DNA探針技術有助于開展產(chǎn)前診斷或遺傳咨詢、攜帶者普查,為防治遺傳性疾病開辟了新路。第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日法醫(yī)物證學人類染色體中存在許多分散的具有串聯(lián)重復單位的微小衛(wèi)星區(qū)。利用人體衛(wèi)星區(qū)DNA作探針檢測不同個體的衛(wèi)星區(qū),產(chǎn)生相應的

DNA指紋圖譜,這是由Jeffeys等在1985