釉成熟蛋白多肽多克隆抗體的制備及其功能,免疫學(xué)論文

釉成熟蛋白多肽多克隆抗體的制備及其功能,免疫學(xué)論文釉成熟蛋白〔amelotin〕是一種在人的成釉細(xì)胞特異性表示出的蛋白，在小鼠、豬、大鼠等物種中高度保守，相對分子質(zhì)量〔Mr〕21000~38000[1-3].小鼠amelotin全長cDNA序列為1022bp,編碼213個氨基酸，富含亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基，與人的amelotin高度同源[4-6].Amelotin家族成員在5端均具有16個氨基酸的信號肽序列[7],因此它們可能是一種分泌性的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，amelotin介入釉質(zhì)的發(fā)育、成熟經(jīng)過，其構(gòu)造和功能的改變與釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)疾病有密切關(guān)系[8-10].國外公司有商品化的抗體出售，價格昂貴，并且特異性不強，靈敏度不高，無法知足當(dāng)前的實驗要求。本課題組曾根據(jù)amelotin的全長氨基酸序列，應(yīng)用構(gòu)建重組融合蛋白的方式方法制備了amelotin多克隆抗體[11],但是該方式方法制備的抗體的特異性及效價已經(jīng)缺乏以知足我們的后續(xù)實驗需要；并且該方式方法制備抗體的經(jīng)過程序繁瑣，耗時較長，影響實驗進程。為進一步討論amelotin在釉質(zhì)的發(fā)育、成熟經(jīng)過中的功能，我們應(yīng)用設(shè)計合成多肽的方式方法制備了效價高、特異性好的amelotin多肽多克隆抗體，其辨別抗原表位的能力更強。1材料和方式方法1.1材料完全Freund佐劑〔completeFreundsadjuvant,CFA〕、不完全Freund佐劑〔incompleteFreundsadjuvant,IFA〕、丙烯酰胺購自Sigma公司；牛血清白蛋白〔bovineserumalbumin,BSA〕、多聚賴氨酸、辣根過氧化物酶〔horseradishperoxidase,HRP〕標(biāo)記的山羊抗兔IgG、ABC免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀技術(shù)〔radioimmunoprecipitationassay,RIPA〕裂解液、二辛可寧酸〔bicinchoninincacid,BCA〕蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司；聚偏二氟乙烯〔polyvinylidenefluoride,PVDF〕膜購自Roche公司；ECLPlus化學(xué)發(fā)光試劑盒購自SantaCruz公司。出生后3、7d昆明小鼠各2只，新西蘭大白兔2只〔3kg/只〕由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.2方式方法1.2.1Amelotin抗原表位的分析由GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲取amelotin蛋白氨基酸序列，利用在線蛋白分析工具ANTHEPROT5.0、DNAStar等進行親水性〔hydrophilicity〕、外表可及性〔surfaceaccessibility〕、柔韌性〔flexicity〕、抗原性和二級構(gòu)造等參數(shù)的綜合預(yù)測，并應(yīng)用Blast程序進行同源性和保守性分析，最終確定需要合成的多肽序列。1.2.2兔抗amelotin多肽抗體的制備Amelotin多肽由武漢三鷹生物有限公司合成，將合成的amelotin多肽肽鏈與鑰孔戚血藍素〔keyholelimpethemacyanin,KLH〕采用戊二醛連接法進行交聯(lián)[3],構(gòu)成amelotin-KLH偶聯(lián)物，此大分子物質(zhì)即為我們之后免疫動物所用的半抗原。取2mg〔1000L〕的多肽KLH偶聯(lián)物與等體積的CFA混合，充分乳化。在新西蘭大白兔背部選取4個注射點進行注射，每點約250L.4周后加強免疫1次，用IFA將劑量減半的多肽偶聯(lián)抗原充分乳化后進行背部注射。之后2周加強免疫1次。兔耳緣靜脈采血進行抗血清效價測定，達理想效價后，再次注射無佐劑的amelotin-KLH抗原250L/點，加強免疫1次，3d后頸動脈放血，收集并分離血清，無菌分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.3Amelotin多肽抗體的純化采用親和層析法進行多肽抗體純化。首先將1mgamelotin多肽與溴化氰〔cyanogenbromide,CNBr〕活化后的Sepharose4B偶聯(lián)，制備多肽親和層析凝膠。取20mL兔抗amelotin血清與1.6mL多肽偶聯(lián)凝膠，4℃旋轉(zhuǎn)混合6h,參加層析柱；PBS沖洗平衡凝膠，之后參加1mL0.1mol/LpH2.9甘氨酸緩沖液洗脫10次；用10支預(yù)先參加100LpH7.5Tris-HCl緩沖液的收集管收集洗脫液。為確保實驗效果，操作均在4℃下進行。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白質(zhì)進行定量，SDS,考馬斯亮藍染色了解純化效果。1.2.4間接ELISA測定抗血清效價以1mg/L多肽KLH偶聯(lián)物100L/孔包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。滴加5g/LBSA〔160L/孔〕37℃封閉2h.參加稀釋的純化多肽抗體、免抗血清或非免疫血清〔100L/孔〕，37℃孵育1h.滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG〔1∶3000〕，37℃孵育1h;TMB顯色液室溫避光顯色15min,2mol/L硫酸終止顯色，測定樣品在450nm的吸光度〔A〕值。以A抗血清/A陰性2.1作為陽性判定的根據(jù)1.2.5Westernblot法鑒定amelotin多肽抗體的特異性利用RIPA裂解液試劑盒制備成釉細(xì)胞總蛋白，用2SDS上樣緩沖液懸浮大腸桿菌中表示出的小鼠amelotin融合蛋白〔濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所實驗室制備儲存〕、含有活性amelotin的小鼠成釉細(xì)胞蛋白裂解液及KLH,95℃加熱7min后，冰上冷卻10min.以40g/孔的量進行上樣，經(jīng)SDS分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)50g/L脫脂奶粉室溫封閉1h后，滴加1∶1000稀釋的純化多肽抗體，室溫孵育2h.洗滌后，參加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG〔1∶5000〕，室溫孵育1h.ECLPlus化學(xué)發(fā)光試劑盒處理5min,于暗室曝光到X光膠片上。1.2.6制備的amelotin多肽抗體的應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察amelotin在小鼠下頜中的表示出。取出生后3、7d昆明小鼠下頜骨組織，置于100mL/L甲醛中，4℃固定16h;經(jīng)100g/LEDTA溶液4℃脫鈣6d,常規(guī)制作石蠟切片。組織切片脫蠟入水，將切片于pH6.0檸檬酸鈉緩沖液中，95℃40min進行抗原修復(fù)；50mL/LH2O2甲醇中15min去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加1∶50的正常羊血清37℃封閉30min;滴加純化兔抗amelotin多肽抗體〔1∶50〕，同時以商品化的amelotin抗體為對照，以非免疫血清為陰性對照，4℃孵育過夜，ABC免疫組織化學(xué)檢測試劑盒進行檢測。DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果，以棕黃色染色斷定為陽性結(jié)果。2結(jié)果2.1Amelotin的氨基酸序列分析用在線蛋白工具對amelotin的蛋白質(zhì)氨基酸序列進行分析，以避免制備的多肽抗體與其他同源蛋白之間的穿插反響，提高抗體的特異性。針對蛋白質(zhì)的親水性、柔韌性、二級構(gòu)造、抗原性及外表可及性等參數(shù)預(yù)測結(jié)果進行綜合研究，確定amelotin的第197~210位的14個氨基酸〔ATHTTEGTTIDPPN〕為需要合成的多肽序列〔圖1〕。2.2Amelotin抗血清效價的測定及多肽抗體的純化利用amelotin多肽KLH偶聯(lián)物為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗血清，親和層析法對amelotin抗血清進行純化，經(jīng)SDS后條帶單一，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測免疫2只大白兔獲得的抗體的濃度分別為300g/mL和450g/mL,選用高濃度抗體進行下一步實驗〔圖2〕。間接ELISA檢測表示清楚免疫獲得的抗血清的效價可到達1∶100000,純化后的amelotin抗體效價可達1∶1000000〔圖3〕。2.3Amelotin多肽抗體的特異性鑒定以制備的小鼠amelotin大腸桿菌融合表示出蛋白、含有活性amelotin的小鼠成釉細(xì)胞蛋白裂解液作為抗原，amelotin多肽抗體為一抗進行Westernblot法檢測，條帶1~2顯示多肽抗體與amelotin大腸桿菌融合表示出蛋白互相作用，出現(xiàn)1條清楚明晰的帶，與融合表示出蛋白amelotin的Mr大小相符；條帶3~5顯示與活性amelotin的成釉細(xì)胞蛋白裂解液互相作用，出現(xiàn)1條清楚明晰的目的條帶，與活性amelotin大小相符；而與KLH互相作用則無條帶出現(xiàn)〔圖4〕。講明所制備的抗體既可辨別含有半抗原的抗原表位蛋白，又能與天然的amelotin蛋白結(jié)合。2.4制備的多肽抗體檢測amelotin在小鼠下頜組織的表示出用純化的amelotin多肽抗體對3、7d小鼠的下頜組織進行免疫組織化學(xué)染色，在3、7d小鼠的磨牙釉質(zhì)全層觀察到強陽性信號帶〔圖5A、B〕。商品化amelotin抗體組僅在7d小鼠磨牙釉質(zhì)見到較弱的陽性信號，以非免疫血清代替一抗組未檢測到amelotin陽性表示出信號〔圖5C、D〕.另外，在7d小鼠下頜下腺的導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中還觀察到amelotin的表示出，而腺泡細(xì)胞則呈陰性反響，但3d小鼠的下頜下腺中未見amelotin的表示出〔圖5E、F〕。3討論Amelotin是近期發(fā)現(xiàn)的一種新的與牙釉質(zhì)的發(fā)育成熟有關(guān)的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，它定位于人的4號染色體q13.3區(qū)域與釉蛋白〔enamelin〕和成釉蛋白〔ameloblastin〕嚴(yán)密相連[12-14].Amelotin在釉質(zhì)分泌階段未見明顯表示出，隨著釉質(zhì)發(fā)育成熟amelotin在成釉細(xì)胞中的表示出逐步增加，可見此蛋白可能與牙釉質(zhì)礦化經(jīng)過有關(guān)聯(lián)[15-16].遺傳性釉質(zhì)發(fā)育不全〔amelogenesisimperfects,AI〕的致病基因定位于4q11-4q21區(qū)域，而amelotin可能與AI的發(fā)生密切相關(guān)[17-18].我們研究小組在2018年根據(jù)amelotin的全長氨基酸序列，構(gòu)建了pET32a-Amelotin原核融合表示出載體，根據(jù)重組融合蛋白制備了amelotin多克隆抗體[11],該方式方法制備的抗體特異性和效價已經(jīng)無法知足我們的實驗要求，為更好地研究amelotin的生理及病理特性，我們設(shè)計合成了amelotin多肽，之后制備了amelotin多肽多克隆抗體，經(jīng)實驗證明該抗體特異性強、靈敏度高，該方式方法的優(yōu)勢在于使用少量的多肽抗原即可獲得大量質(zhì)量均一的特異性amelotin蛋白，經(jīng)濟簡單。通過對amelotin氨基酸序列的親水性、外表可及性、柔韌性、二級構(gòu)造及抗原性等參數(shù)應(yīng)用軟件綜合評價預(yù)測結(jié)果的分析[18],我們最終確定amelotin的第197~210位區(qū)域14個氨基酸作為其抗原決定簇。同時在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，驗證其特異性。為增加合成的小分子多肽的免疫原性，我們設(shè)計多肽時在其C端加1個半胱氨酸，并與載體KLH偶聯(lián)。通過ELISA和Westernblot實驗，我們發(fā)現(xiàn)制備的amelotin多肽KLH具有很好的免疫原性，獲得的抗血清具有較高的效價，可到達1∶1000000,與我們以前制備的amelotin效價1∶12800相比[11],抗體效價明顯提高，能夠知足后續(xù)的實驗應(yīng)用。并且制備的amelotin多肽抗體既能特異辨別融合的蛋白，又能辨別天然構(gòu)象的蛋白，這表示清楚我們利用所設(shè)計和合成的多肽制備的抗體是成功的。利用制備的多肽抗體進行的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示amelotin在出生3、7d小鼠的磨牙牙釉質(zhì)中高表示出，與我們之前利用重組融合蛋白的方式方法制備amelotin抗體的檢測結(jié)果一致[11],與商品化的amelotin抗體相比，特異性更高層次。另外，還在7d小鼠下頜下腺的導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中觀察到amelotin的表示出，但3d小鼠中未見表示出。作為介入釉質(zhì)發(fā)育成熟的特異性蛋白，為何在腺體中有所表示出，并且表示出量呈現(xiàn)時空特異性，能否amelotin也與腺體的發(fā)生分化及發(fā)育異常有關(guān)，還有待于進一步研究。以上實驗證明我們成功設(shè)計和合成了amelotin多肽片段，制備的多肽抗體效價高、特異性好，符合實驗要求。Amelotin合成多肽及其抗體的成功制備，為下一步進行amelotin的分子功能及蛋白