2馬心同-流式細(xì)胞儀使用簡介

儀器名稱：流式細(xì)胞儀生產(chǎn)廠家：美國貝克曼庫爾特有限企業(yè)使用方法：一．開機(jī)程序1．檢查穩(wěn)壓器電源，翻開電源，穩(wěn)定5分鐘。2．翻開儲液箱，倒掉廢液,并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。翻開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿（一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow），合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善布置。3．將FACSCalibur開關(guān)翻開，此時儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY，預(yù)熱5－10分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。4．如果需要打印，翻開打印機(jī)電源。5．翻開電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋果標(biāo)志。6．履行儀器PRIME功能一次，以清除Flowcell中的氣泡。7．剖析樣品時，先用FACAFlow或PBS進(jìn)行HIGHRUN約2分鐘。做過分選后，每次開機(jī)后需沖刷管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖刷。待自動停止后接通濃縮裝置，同上法沖刷一次。二．預(yù)設(shè)獲取模式文件(AcquisitionTemplateFiles)1．從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編寫一個獲取模式文件。2．選用屏幕左列畫圖工具中的Dotplot，繪出一個或多個DotPlots（點(diǎn)圖）。從DotPlot對話框中選用Acquisition作為圖形資料根源，并確定適合的x軸和y軸參數(shù)。3．選用屏幕左列畫圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram（直方圖）。4．將此視窗命名后儲藏于FACStationG3\BDApplications\CELLQuestFolder\EXP文件夾中，下次進(jìn)行相同實驗時可直接調(diào)用。本計算機(jī)中已設(shè)定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲藏于FACStationG3\BDApplications\CELLQuest\EXP文件夾中，ACQ用于細(xì)胞DNA檢測，EXP用于細(xì)胞表面標(biāo)志剖析。三．用CELLQuest進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整1．從蘋果畫面中選用CELLQuest，進(jìn)入CELLQuest后在File指令欄中翻開合適的獲取模式文件。2．從屏幕上方Acquire指令欄中，選用ConnecttoCytometer（快捷鍵：＋B）進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的AcquisitonControl對話框移至合適地點(diǎn)。3．從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也能夠用+1，2，3，4獲得此四個對話框。4．在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數(shù)選擇適合的倍增模式(amplifiermode)：線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原剖析如剖析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時，F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDMParam選擇FL2，而FL1,FL2與FL3則以對數(shù)模式Log測量；剖析細(xì)胞DNA含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進(jìn)行測量，且DDMParam選擇FL2；剖析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log進(jìn)行測量。5．放上待檢測的樣品，將流式細(xì)胞儀設(shè)定于RUN，流速可在HIGH或LOW上。6．在Acquisiton”。Control對話框中，選用Acquire，開始獲取細(xì)胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選用Pause，Restart以察看調(diào)整效果。未完全調(diào)整好從前不要去掉SETUP前的“7．在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMTvoltages（粗調(diào)）與AmpGains（細(xì)調(diào)），使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC點(diǎn)圖內(nèi),且三群細(xì)胞合理散布。8．在Threshold對話框中選擇適合的參數(shù)設(shè)定Threshold，并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號（細(xì)胞碎片）。一般做細(xì)胞表型時用FSC－H而做DNA時用FL2－H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改良畫面質(zhì)量。9．從屏幕左列畫圖工具中選用Region（地區(qū)），并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定地區(qū)線，即往常所說的門。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更加容易。10．在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整熒光檢測器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度。根據(jù)所用的熒歲月性比較樣品調(diào)整細(xì)胞群，使之散布在正確的地區(qū)內(nèi)。11．在Compensation對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色（或多色）熒光染色所需的熒光補(bǔ)償。比方應(yīng)當(dāng)為FL1+FL2-的細(xì)胞群卻散布在FL1FL2＋地區(qū)內(nèi)，則需調(diào)大FL2－？％FL1中的“？”，并從FL1-FL2點(diǎn)圖中察看新的調(diào)整是否適合為5mW；Lasercurrent:正常值為6Amps左右。13．調(diào)整好的儀器設(shè)定可在InstrumentSettings對話框中儲藏，下次進(jìn)行相同實驗時可調(diào)出使用，屆時只要微調(diào)即可。本計算機(jī)中已有三個名叫儲藏于FACStationG3\BDApplications\CELLQuestFolder\IMM-InstrSettings及FACStationG3\BDFiles\InstrumentSettingsFiles\CalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件，前二者可用于剖析人白細(xì)胞，后者用于剖析小鼠肥大細(xì)胞。四．經(jīng)過預(yù)設(shè)的獲取模式文件進(jìn)行樣品剖析1．從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQUEST，新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open，翻開預(yù)設(shè)的獲取模式文件。2．從屏幕上方Acquire指令欄中，選用ConnecttoCytometer進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的AcquisitonControl對話框移至合適地點(diǎn)。3．從Cytometer指令欄中選用InstrumentSettings，在其對話框中選擇Open以調(diào)出從前存儲的相同實驗的儀器設(shè)定，按Set確定。4．在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲藏的細(xì)胞數(shù)，參數(shù)，信號道數(shù)。其中Resolution在做細(xì)胞表面標(biāo)志時選擇256，做DNA時選擇1024。ParameterSaved則根據(jù)不同的檢測對象選擇不同的參數(shù)。5．在Acquire指令欄中，選擇ParameterDescription，以決定文件存儲地點(diǎn)(folder)，文件名稱(file)，樣品代號以及各樣參數(shù)的標(biāo)記(panel)，即安排tube1，2，3的檢測參數(shù)。一般本儀器獲取的數(shù)據(jù)按照檢測對象的不同分別儲藏于FACStationG3\BDApplications\CELLQuest\IMM和DNA文件夾中。文件根據(jù)日期命名。6．在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對話框移至合適地點(diǎn)，以便于隨時察看events計數(shù)。7．將樣品試管放至檢測區(qū)，在AcquireControl對話框中選用Acquire以啟動樣品剖析測定。8．微調(diào)儀器設(shè)定，待細(xì)胞群散布合適后選擇Abort,，”開始正式獲取信號，存儲數(shù)據(jù)。

AcquireControl對話框中去除Setup前的“

Pause,9．當(dāng)一定數(shù)目的細(xì)胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數(shù)據(jù)。重復(fù)步驟7，持續(xù)剖析下一個樣品，直到所有的樣品數(shù)據(jù)剖析完成。當(dāng)所有樣品剖析剖析完成，即換上三蒸水，并將流式細(xì)胞儀置于“STANDBY”狀態(tài)，以保護(hù)激光管。五．關(guān)機(jī)程序：1．從File中選擇Quit,退出軟件，選擇Don’tSave至蘋果屏幕。2．用4ml1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位（vacuumison），以外管吸去約2ml，在