手工提取基因組DNA

手工提取基因組DNA法本方法是一種簡單、快速的基因組DNA(GenomicDNA)提取方法，可以從動物組織、植物材料、各種微生物、培養(yǎng)細胞中提取基因組DNAo樣品在DNA裂解液中能夠充分被裂解,在加入乙醇后，會出現(xiàn)白色絮狀的基因組DNA沉淀，收集并洗滌沉淀即可得到基因組DNAo適用于各種樣品的基因組DNA提取。提取過程簡單、快速，整個操作可以在30分鐘內完成。本制品采用的是傳統(tǒng)的纏繞法提取DNA，所獲得的基因組DNA純度高、完整性好。(1)準備試劑無水乙醇和75%乙醇；8mMNaOHo低濃度NaOH溶液在空氣中很容易被C02中和，NaOH一般配制成2?4M的儲存液，使用時再稀釋，其保存時間不超過6個月，而8mMNaOH的保存期限不超過一個月。(2)實驗操作1.各種組織材料的DNAiso使用量及裂解方法如下。實驗材料種類DNAiso使用量裂解方法貼壁培養(yǎng)細胞1.0ml/10cm2培養(yǎng)皿移液槍輕輕吹打懸浮培養(yǎng)細胞1.0ml/1?3X107細胞移液槍輕輕吹打動物組織1.0ml/25?50mg組織勻漿器勻漿或液氮研磨少量動物軟組織(如脾臟和腦等)1.0ml/5?10mg組織移液槍輕輕吹打Yeast或革蘭氏陽性菌1.0ml/1?3X108細胞先用溶菌酶裂解細胞壁，再加DNAiso吹打裂解或使用液氮研磨革蘭氏陰性菌1.0ml/1X109細胞移液槍輕輕吹打2.實驗樣品的研磨和勻漿。貼壁培養(yǎng)細胞倒出培養(yǎng)液，用1XPBS清洗一次。每10cm2生長的培養(yǎng)細胞中加入1ml的DNAisoReagent,水平放置片刻，使裂解液均勻分布于細胞表面并輕輕晃動培養(yǎng)皿使細胞裂解，然后使用移液槍吹打細胞使其脫落(對于貼壁牢固的培養(yǎng)細胞可使用細胞刮勺剝離細胞)。將含有細胞的裂解液轉移至離心管中，用移液槍反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀。室溫靜置5分鐘。懸浮培養(yǎng)細胞（或革蘭氏陰性菌）將懸浮培養(yǎng)細胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000Xg4°C離心2分鐘，棄上清。加入1ml（IX107個懸浮培養(yǎng)細胞或IX109個革蘭氏陰性菌細胞的使用量）的DNAisoReagent。用移液槍反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀。室溫靜置5分鐘。動物組織將動物組織放入勻漿器中，每25?50mg組織中加入1mlDNAisoReagent。使用勻漿器反復勻漿，直至沒有明顯塊狀組織沉淀。對于特殊樣品，如心臟、肌肉及軟骨組織等，可以將其迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨徹底會影響DNA的收率和質量）。加入適量的DNAisoReagent,將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。對于量少的一些軟組織（5?10mg）,例如脾臟、腦等，可以直接剪成小塊放到離心管中加入DNAisoReagent,再使用移液槍反復吹打，使軟組織破碎，直至看不到明顯的沉淀為止。將裂解液轉移至離心管中。植物材料（或革蘭氏陽性菌）將植物材料（或革蘭氏陽性菌）稱重后，放入研缽中加入液氮速凍，用研杵將植物材料（或革蘭氏陽性菌）研磨成粉末狀。加入適量的DNAiso將粉末狀樣品完全覆蓋，室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。將裂解液轉移至離心管中。除雜質。離心：組織裂解液經(jīng)10,000Xg4C或室溫離心10分鐘，將上清轉移至新的離心管中。此步驟可以除去裂解液中大部分的組織碎片、RNA和多糖類成份。（對于大量的動物組織、植物材料以及其他纖維或RNA含量較多的材料，推薦使用此操作，其他材料可酌情省略。）本步驟選擇使用（僅在提取植物材料時使用，可以除去大量葉綠素）：向組織裂解液中加入等體積的氯仿，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12,000Xg室溫離心10分鐘，將上層溶液轉移至新的離心管中?；蚪MDNA的提取。向上述裂解液中加入DNAisoReagent1/2體積量的無水乙醇。反復顛倒混勻1?3分鐘，會出現(xiàn)云霧狀的DNA沉淀，使用槍頭將DNA纏繞出來轉移至新的離心管中，或者將上清液輕輕倒出，將DNA沉淀留在離心管底部。若沒有出現(xiàn)DNA沉淀或沉淀量較少且分散時，可以4,000Xg室溫離心2分鐘沉淀DNA。5?基因組DNA沉淀的清洗。緩慢地沿離心管壁加入1ml75％的乙醇（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000Xg4°C離心5分鐘后小心棄去乙醇（為了更好地控制DNA中的鹽離子含量，應盡量除凈乙醇）。6.基因組DNA的溶解。將除去乙醇后的基因組DNA沉淀在室溫下干燥5?15秒（如果基因組DNA在空氣中干燥時間過長，會很難溶解），緩慢加入適量的TEBuffer（pH8.0）或滅菌水溶解基因組DNA。一般從107個細胞或10?20mg動物組織中提取的基因組DNA加入200?300pl溶液溶解,濃度可以達到200?300ng/pl。從一些動物組織如肝臟、肌肉和植物中提取的基因組DNA通常會含有一些不溶的成份（多為多糖多酚類物質），可以通過12,000Xg離心10分鐘除去。7?使用8mMNaOH促進DNA完全溶解。當基因組DNA量較多時，在TEBuffer或滅菌水中不易完全溶解。此時可以使用8mMNaOH來溶解基因組DNA。經(jīng)8mMNaOH溶解的基因組DNA溶液因pH值較高，可能會影響長期儲存及后續(xù)