臨床微生物檢驗基本技術(shù)標準操作規(guī)程

臨床微生物檢驗基本技術(shù)標準操作規(guī)程TOC\o"1-5"\h\z微生物檢驗實驗室標本處理標準操作規(guī)程 137微生物檢驗實驗室標本接種標準操作規(guī)程 138微生物檢驗實驗室細菌鑒定操作規(guī)程 139微生物檢驗實驗室不染色標本檢查法標準操作規(guī)程 140微生物檢驗實驗室革蘭染色標準操作規(guī)程 141微生物檢驗實驗室抗酸染色標準操作規(guī)程 142微生物檢驗實驗室墨汁染色標準操作規(guī)程 144微生物檢驗實驗室藥物敏感試驗標準操作規(guī)程 145XXX醫(yī)院檢驗科微生物檢驗實驗室作業(yè)指導書標本處理標準操作規(guī)程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-0562版本：20140601生效日期：20140615共1頁.目的規(guī)范標本處理標準操作規(guī)程。.范圍臨床微生物標本。.職責微生物檢驗人員嚴格執(zhí)行本程序。.程序血液標本、接收標本后，立即對標本進行編號、登記。門診病人要同時登記住址、聯(lián)系電話等信息。將血培養(yǎng)瓶置于全自動培養(yǎng)儀中培養(yǎng)。痰標本接收編號、登記后的痰標本，加入痰消化劑或無菌生理鹽水處理。用無菌棉簽挑取標本分別涂布于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，麥康凱平板的第一區(qū)，然后用接種環(huán)劃第二、第三區(qū) 同時做痰涂片鏡檢。咽拭子標本涂布于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱平板第一區(qū)，然后用接種環(huán)劃第二區(qū)、第三區(qū) 腦脊液、胸腹水等穿刺液床邊抽取體液標本1-2ml注入多功能體液培養(yǎng)瓶或需氧血培養(yǎng)瓶，即送實驗室。接收標本后，立即對標本進行編號、登記，置孵育箱培養(yǎng)。腦脊液標本需離心涂片檢查。糞便或肛拭標本接收標本后，立即對標本進行編號、登記，

取糞便膿血部位標本根據(jù)檢驗申請單要求選擇平板，立即接種。尿標本接收標本后，立即對標本進行編號、登記，將尿標本混勻，用10ul定量接種環(huán)立即接種血瓊脂平板、麥康凱平板，分離細菌和菌落計數(shù)。參考文獻[1]周庭銀編著.臨床微生物診斷與圖解.第二版.上海：上海科學技術(shù)出版社，2007[2]葉應嫵，王毓三，中子瑜主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程.第3版.南京：東南大學出版社，2006編寫人：AAA、BBB操作人：本室操作人員批準人： XXX醫(yī)院檢驗科

微生物檢驗實驗室標本接收標準操作規(guī)

程文件編號：XXX醫(yī)院檢驗科

微生物檢驗實驗室標本接收標準操作規(guī)

程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-0563作業(yè)指導書版本：20140601生效日期：20140615共1頁.目的規(guī)范標本接種標準操作規(guī)程，確保檢驗結(jié)果準確可靠。.范圍微生物所有標本的接種。.職責微生物檢驗人員嚴格執(zhí)行本程序。.程序分區(qū)劃線法此法多用于糞便等含菌量較多的標本。用接種環(huán)先將標本涂布在平板第一區(qū)并作數(shù)次劃線，再在二、三 區(qū)依次用接種環(huán)劃線。每劃一個區(qū)域，應將接種環(huán)燒灼1次，待冷卻后再劃下一個區(qū)域。每一個區(qū)域的劃線應接觸上一個區(qū)域的接種環(huán)2-3次，使菌量逐漸減少，以形成單個菌落。斜注平板法本法用于尿液等標本的細菌計數(shù)。將滅菌生理鹽水適量稀釋的標本1ml,置于滅菌平皿內(nèi)，注入已熔化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基15ml,混勻，待冷卻后，倒置。斜面接種法此法主要用于鑒定或保存菌種，或觀察細菌的某些生化特性和動力。用左手握住菌種管和斜面培養(yǎng)管底部，右手持接種環(huán)。用右手小指于手掌、小指于無名指分別拔出兩管的棉塞，將管口通過火焰滅菌。用接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)挑取移種之菌落。伸入斜面培養(yǎng)管內(nèi)，先從斜面底部到頂端拖一條接種線，再自下而上蜿蜒劃線，或直接自下而上蜿蜒劃線。將接種環(huán)垂直插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后穿刺線推出接種環(huán)。穿刺培養(yǎng)法此法用于保存菌種，觀察動力及某些生化反應。以接種環(huán)挑取細菌培養(yǎng)物，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種環(huán)。液體培養(yǎng)基接種法用滅菌接種環(huán)挑取菌落或標本。在試管內(nèi)壁于液面交界處研磨，使細菌混勻在液體培養(yǎng)基中。參考文獻[1]周庭銀編著.臨床微生物診斷與圖解.第二版.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2007[2]葉應嫵，王毓三，中子瑜主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程.第3版.南京：東南大學出版社，2006編寫人：AAA、BBB操作人：本室操作人員批準人： 文件編號：文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-0564版本：20140601生效日期：20140615共1頁XXX醫(yī)院檢驗科微生物檢驗實驗室作細菌鑒定操作規(guī)程業(yè)指導書1.目的規(guī)范細菌鑒定標準操作規(guī)程。2.適用范圍革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等。3.職責檢驗人員嚴格執(zhí)行本程序。4.程序觀察菌落大小、顏色、氣味、溶血、形態(tài)特征等，觀察內(nèi)容應記錄在《細菌鑒定流程表》。涂片，革蘭染色，觀察染色性及細菌形態(tài)、大小和排列，球菌、桿菌或螺形菌等，觀察內(nèi)容記錄在《細菌鑒定流程表》。初步生化反應根據(jù)菌落特征和涂片結(jié)果選擇初步生化反應，如氧化酶、觸酶、凝固酶（玻片法）等。制定細菌鑒定方案儀器鑒定方案（以VITEK2為例）革蘭陰性桿菌：選擇GN卡（陰性菌鑒定卡）。革蘭陽性球菌：選擇GP卡（陽性菌鑒定卡）。酵母菌：選擇YST卡（酵母菌鑒定卡）。需氧芽抱桿菌：選擇BBL卡（需氧芽抱桿菌卡）。手工細菌鑒定法氧化酶陽性革蘭陰性桿菌，選擇非發(fā)酵鑒定生化反應組合：葡萄糖O/F、木糖、麥芽糖、硝酸鹽、動力、七葉苷等生化反應。氧化酶陰性革蘭陰性桿菌，選擇腸桿菌科細菌鑒定生化反應組合:觸酶、硝酸鹽、葡萄糖O/F、動力、乳糖、VP、吲哚、甲基紅、枸椽酸鹽、精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸等生化反應。疑不動桿菌氧化酶陰性革蘭陰性桿菌，選擇非發(fā)酵鑒定生化反應組合。革蘭陽性球菌，選擇革蘭陽性球菌鑒定生化反應組合：觸酶、葡萄糖O/F、膽汁七葉苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸鹽、脲酶等。參考文獻[1]周庭銀編著.臨床微生物學診斷與圖解.第二版.上海：上海科學技術(shù)出版社，2007[2]王欽升，周正明，高屹主編實用醫(yī)學培養(yǎng)基手冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999編寫人：AAA、BBB 操作人：本室操作人員

批準人： XXX醫(yī)院檢驗科微生物檢驗實驗室作業(yè)指導書不染色標本檢查法標準操作規(guī)程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-0565版本：20140601生效日期：20140615共1頁.目的規(guī)范不染色標本檢查法標準操作規(guī)程。.范圍微生物不染色標本檢查。.職責微生物檢驗人員嚴格執(zhí)行本程序。.程序不然色標本檢查法主要用于檢查細菌的動力及運動狀況。有鞭毛的細菌，在顯微鏡下呈現(xiàn)活潑的運動，濕片法用接種環(huán)取細菌懸液或細菌培養(yǎng)液2環(huán)，置于清潔載玻片中央，輕輕覆上蓋玻片，于油鏡下觀察。制片時菌液要適量，不可有氣泡，不可外溢。懸滴法取潔凈的凹窩載玻片及蓋玻片各一塊，將凹孔四周的平面上涂薄薄一層凡士林，取1接種環(huán)菌液置蓋玻片中央，將凹窩載玻片的凹面向下，對準于蓋玻片的液滴蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)玻片，用小鑷子輕輕壓，使蓋玻片與凹孔邊緣粘緊，使凡士林密封其邊緣，菌液不致?lián)]發(fā)變干。鏡下觀察時，先用低倍鏡，調(diào)成暗光，對準焦距后以高倍鏡觀察，不可壓碎蓋玻片。有動力的細菌可見其從一處移動到另一處，無動力的細菌呈現(xiàn)布朗運動而無位置改變。螺旋體由于菌體纖細、透明，需用暗視野或位相顯微鏡觀察其形態(tài)、活動。毛細管法主要用于檢查厭氧菌的動力。以毛細管（長60?70mm,管徑0.5?1.0mm）接觸培養(yǎng)物，讓菌液吸入毛細管后，用火焰

將毛細管兩端熔封，將毛細管固定在載玻片上，鏡檢?？嘉墨I[1]周庭銀編著.臨床微生物學診斷與圖解.第二版.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2007[2]王欽升，周正明，高屹主編實用醫(yī)學培養(yǎng)基手冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999（周庭銀）編寫人：AAA、BBB操作人：本室操作人員批準人： XXX醫(yī)院檢驗科

微生物檢驗實驗室作革蘭染色標準操作規(guī)

程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-056XXX醫(yī)院檢驗科

微生物檢驗實驗室作革蘭染色標準操作規(guī)

程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-056業(yè)指導書6版本：20140601生效日期：20140615共1頁.目的規(guī)范革蘭染色標準操作規(guī)程。.原理細菌樣本先經(jīng)紫色草酸鹽結(jié)晶復合物染色，之后用Lugol-PVP媒染劑處理以促進燃料與革蘭染色陽性菌結(jié)合。經(jīng)酒精-丙酮的脫色作用，革蘭染色陰性菌中的結(jié)晶紫會被洗脫。番紅精則是作為復染劑：革蘭染色陰性的細菌呈現(xiàn)粉紅色，而革蘭染色陽性的細菌呈現(xiàn)紫色。。.試劑結(jié)晶紫草酸鹽溶液結(jié)晶紫2%；酒精20%；草酸銨0.8%。穩(wěn)定Lugol-PVP復合物碘1.3%；碘化鉀2%；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）10%。脫色劑95%酒精50%；丙酮50%。番紅精溶液番紅精0.25%；95%酒精10%。.質(zhì)控采用大腸埃希菌ATCC25922質(zhì)控菌株，每周1次，有室內(nèi)質(zhì)控記錄。采用金黃色葡萄球菌ATCC25923質(zhì)控菌株，每周1次，有室內(nèi)質(zhì)控記錄。。.操作步驟初染第一液初染劑（結(jié)晶紫）染色1分鐘，水洗。媒染第二液媒染液（碘液）染色1分鐘，水洗。脫色第三液脫色劑（95%酒精）用到無紫色脫落為止，水洗。復染第四液復染劑（石碳酸復紅或沙黃）染色30秒，水洗。自然干燥后鏡檢。.結(jié)果判斷革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色。.注意事項染色的結(jié)果常受操作者技術(shù)的影響，尤其是容易過度脫色，往往陽性染成陰性。在同一載玻片上，需用已知金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌作革蘭陽性及陰性對照。染色關(guān)鍵在于涂片和脫色，涂片不宜過厚，固定不宜過熱，脫色不宜過度。菌齡為18?24小時為佳。.臨床意義鑒定細菌可將細菌分為陽性和陰性兩大類，因而可以初步識別細菌，縮小范圍，有利于進一步鑒定。選擇藥物革蘭陽性菌與陰性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)有很大差別，因而抗菌藥物有差異。參考文獻[1]周庭銀編著.臨床微生物學診斷與圖解.第二版.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2007[2]王欽升，周正明，高屹主編實用醫(yī)學培養(yǎng)基手冊.北京：人民軍

醫(yī)出版社，1999（周庭銀）編寫人： AAA、BBB 操作人：本室操作人員批準人： XXX醫(yī)院檢驗科微生物檢驗實驗室作抗酸染色標準操作規(guī)程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-056

業(yè)指導書7版本：20140601生效日期：20140615共2頁.目的規(guī)范抗酸染色標準操作規(guī)程。.原理抗酸菌具有耐受酸性介質(zhì)脫色的生物狀，此類細菌在石碳酸（苯酚）的協(xié)同作用下，被復紅染色劑著色，能夠耐受酸性酒精脫色，顯微鏡觀察時保持紫色紅色；而其他脫落細胞或標本中的非抗酸菌被酸性酒精脫色，可被復染劑亞甲藍染為藍色。.試劑Kinyoun溶液。堿性品紅40g乙醇（95%）200ml石碳酸80ml蒸餾水1000ml3.2Gabett溶液亞甲藍10g無水酒精300ml硫酸200ml蒸餾水500ml.質(zhì)控每天用龜分支桿菌ATCC93326做陽性對照，大腸埃希菌ATCC25922做陰性對照。.操作步驟初染涂片上滴加石碳酸復紅液，用火焰加熱至產(chǎn)生蒸汽，約5分鐘，水洗。脫色第二液脫色約1分鐘，輕輕搖動玻片，無紅色脫色或略呈粉紅色時為止，水洗。復染第三液復染30秒，水洗。自然干燥后鏡檢。.結(jié)果判斷抗酸桿菌呈紅色。.注意事項每張玻片只能涂一份標本，禁止將2份或2份以上的標本涂在同一張載玻片上。為防止交叉感染，標本應先高壓滅菌后再涂片染色。在涂抹痰標本時，嚴禁對載玻片進行加熱。菌齡為18?24小時為佳。.臨床意義只針對用于結(jié)核病、麻風病等的細菌檢查，初步診斷。.安全防護措施操作人員要戴口罩、手套和穿隔離衣。涂片制備痰標本要高壓滅菌或者在標本中加入等量 0.5%“84”消毒液（含有效氯2500mg/L）后涂片。氣管刷片送檢的玻片，紫外線燈下照射30分鐘進行染色鏡檢。或者對于進行抗酸染色的痰標本（因使用的容器原因不能高壓滅菌）。鏡檢后的玻片均浸泡在含有效氯1000mg/L的消毒液中，高壓滅菌后處理。所有標本、污染物丟棄之前，都需經(jīng)高壓滅菌、焚燒或浸泡殺菌劑中。參考文獻[1]周庭銀編著.臨床微生物學診斷與圖解.第二版.上海：上海科學技術(shù)出版社，2007[2]王欽升，周正明，高屹主編實用醫(yī)學培養(yǎng)基手冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999（周庭銀）

業(yè)指導書68版本：20140601生效日期：20140615共1頁.目的規(guī)范墨汁染色標準操作規(guī)程。.原理墨汁染色（負染色法）：背景著色而菌體本身不著色的染色法稱負染色法。此法用以觀察細菌及某種真菌的莢膜等。.試劑印度墨汁。.質(zhì)控新型隱球菌ATCC32609為陽性，白念珠菌ATCC90038為陰性。.操作步驟腦脊液等其他標本離心取沉淀物或者挑取菌液1環(huán)涂于潔凈玻片上，然后加印度墨汁1環(huán)，覆以蓋玻片后鏡檢。鏡下背景呈黑褐色，菌體無色。.結(jié)果判斷新型隱球菌可呈寬闊透亮的厚莢膜，背景為纖細均勻的黑色，白細胞被染成黑色不透亮，但核形明顯。.注意事項不要使用過期的印度墨汁。墨汁應無污染、無顆粒等。.臨床意義主要用于新型隱球菌的鑒定。參考文獻[1]周庭銀編著.臨床微生物學診斷與圖解.第二版.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2007[2]王欽升，周正明，高屹主編實用醫(yī)學培養(yǎng)基手冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999（周庭銀）編寫人:批準人：AAA、BBB操作人：本室操作人員編寫人:批準人：AAA、BBB操作人：本室操作人員XXX醫(yī)院檢驗科

微生物檢驗實驗室作藥物敏感性試驗標

準操作規(guī)程文件編號：XXX-JY-CZ-WSW-056業(yè)指導書9版本：20140601生效日期：20140615共2頁.目的規(guī)范藥物敏感性試驗標準操作規(guī)程，確保藥敏結(jié)果準確。.原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會不斷的向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的濃度梯度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)待檢菌的生長被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映檢測菌對測定藥物的敏感程度，并與該待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。.試劑M-H培養(yǎng)基、無菌生理鹽水、藥敏紙片、無菌棉簽、35℃孵育箱、標準比濁管或比濁儀。.質(zhì)控常用細菌藥敏質(zhì)控標準菌株參見CLSI規(guī)定。質(zhì)控菌株每日隨臨床標本一起進行藥敏試驗，測定質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)。質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)在允許范圍之內(nèi)，說明結(jié)果可信。質(zhì)控的頻率由于紙片法藥敏試驗是很穩(wěn)定的，在不失控的時候，可以每周作1?2次質(zhì)控菌株的測定。如果發(fā)現(xiàn)有失控的情況，就必須每日做1次，尋找失控的原因并予以糾正。如果連續(xù)30日失控＜3次的，可以恢復每周1次。.操作步驟挑取4?5個純