木犀草素對急性肺損傷的干預(yù)和保護作用,藥學(xué)論文

木犀草素對急性肺損傷的干預(yù)和保護作用,藥學(xué)論文急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是由多種原因引起的以肺泡毛細(xì)血管膜通透性增高為特征的肺損傷，是臨床重癥監(jiān)護患者主要的死亡原因，病死率到達(dá)30%～50%［1－3］。ALI病因復(fù)雜，多種疾病可并發(fā)ALI，致病環(huán)節(jié)諸多，華而不實過度失控的炎性反響和促炎、抗炎反響失衡是該疾病的主要發(fā)病機制，炎性細(xì)胞因子和趨化因子間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控在啟動、放大和促進(jìn)病理進(jìn)程中起到重大作用［4］，迄今仍無有效治療ALI的方式方法和藥物。木犀草屬屬于黃酮類化合物，因最初從木犀草科木犀草屬草本植物木犀草的葉、莖、枝中分離出而得名，是一種天然色素組分，具有很高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)劑、抑菌等作用［5］。木犀草素的抗炎作用與抑制炎性介質(zhì)的釋放與核因子B(nuclearfactorB，NF-B)介導(dǎo)的基因表示出有關(guān)。本文旨在討論木犀草素對ALI能否有干涉和保衛(wèi)作用及其在體內(nèi)的可能作用機制。1材料與方式方法1．1動物健康雄性ICＲ小鼠，體重18～22g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號碼:SCXK(滬)2008-0016。飼養(yǎng)于室溫、充分給水和食物。1．2試劑及藥物脂多糖(LPS)(大腸桿菌O111:B4，Sigma公司，076K4020);木犀草素(Sigma公司);地塞米松磷酸鈉注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司，080201);戊巴比妥鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，WS20060401);小鼠白介素-1(IL-1)ELISA試劑盒(A6071384)、IL-6ELISA試劑盒(A6071377)、腫瘤壞死因子-(TNF-)ELISA試劑盒(A6071379)均購自Ｒ＆D公司;Braford蛋白含量檢測試劑盒、NF-Bp65Antibody、IB-Antibody、IB-(Phospho-ser32)Anti-body、內(nèi)參一抗(-Actin)、內(nèi)參一抗(LaminB)、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1．3主要儀器動物肺功能分析系統(tǒng)(AniＲes2005型，北京貝蘭博科技有限公司);酶標(biāo)儀(680型，美國BIO-ＲAD公司);低溫離心機(SH03014型，美國科俊儀器公司);超低溫冰箱(1500型，日本SANYO公司)，Western電泳儀(164-5051型，美國Bio-Ｒad公司)，分光光度計(UV-2540型，日本SHIMADZ公司)。1．4方式方法1．4．1實驗分組和模型的制備:96只小鼠隨機平均分為兩批，每批隨機平均分為6組，分別為正常組、模型組、木犀草素低劑量組、木犀草素中劑量組、木犀草素高劑量組及地塞米松組，每組8只。木犀草素低、中、高劑量組于造模前4d分別灌胃給予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg的木犀草素，正常組和模型組均灌胃給予一樣體積的0．9%氯化鈉溶液。小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(80mg/kg)后暴露氣管，除正常組外，其余組氣管內(nèi)緩慢注入5%的LPS溶液(5mg/kg)，造成小鼠急性肺損傷，正常組以一樣方式注入一樣體積的0．9%氯化鈉溶液。1．4．2肺功能相關(guān)指標(biāo)的檢測造模6h后，取一批小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(90mg/kg)深度麻醉，氣管插管，將小鼠置于體描箱中。設(shè)置呼吸機的頻率為90次/min，潮氣量為5ml/kg，呼吸比為15∶10。通過對動物氣道壓力(Press)、肺容積變化(Volume)的測量，計算出呼吸流速(Flow)、平均吸氣氣道阻力(Ｒi)、呼氣氣道阻力(Ｒe)、肺動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)，經(jīng)AniＲes2005軟件進(jìn)行分析，40min后取出小鼠。1．4．3支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞因子的測定:取另一批小鼠，造模3h后，結(jié)扎右肺，暴露氣管并插管，向左肺注入4℃0．9%氯化鈉溶液1ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，重復(fù)3次。收集肺泡灌洗液并混勻，于4℃、1500r/min離心15min。收集上清液，分裝后保存于－70℃超低溫冰箱中，ELISA試劑盒檢測檢測IL-1、IL-6和TNF-的濃度。1．4．4肺組織病理檢測:灌洗結(jié)束后，立即取右肺上葉以10%甲醛溶液固定，HE染色，制作常規(guī)石蠟病理切片。觀察肺泡壁有無增厚、充血、炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)有無炎癥、水腫，肺泡有無壞死、出血等情況。1．4．5Westernblot測定肺組織中p65、IB-、pIB-的表示出:將100mg右肺組織置于0．5ml冰預(yù)冷裂解緩沖液中，用十字勻漿器勻漿，充分裂解。4℃，13000g，離心10min，保存上清液。Braford法測定上清液中總蛋白濃度后，進(jìn)行SDS電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉并參加相應(yīng)的一抗(NF-Bp65抗體，1∶400;IB-抗體，1∶200;pIB-抗體，1∶200)4℃孵育過夜。PBST漂洗后，將膜與HＲP結(jié)合的二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，1∶5000)室溫下?lián)u蕩孵育1h。用PBST充分洗膜，然后將顯影液加于PVDF膜上，室溫放置1min。暗室中迅速曝光、顯影、洗像。1．5統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計軟件，計量資料以xs表示，采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2．1木犀草素對肺功能的影響造模6h后，6組小鼠的Ｒi、Ｒe隨時間的延長呈增長趨勢，華而不實模型組的增長百分比漲幅最大，正常組漲幅最小;6組小鼠的Cdyn隨時間的延長呈下降趨勢，華而不實模型組的下降百分比降幅最大，正常組降幅最小。木犀草素呈劑量依靠性的抑制Ｒi、Ｒe的增長和Cdyn的下降。地塞米松可以明顯抑制Ｒi、Ｒe的增長和Cdyn的下降。見圖1。2．2木犀草素對BALF中IL-1、IL-6和TNF-的影響與正常組相比，模型組的IL-1、IL-6和TNF-均明顯增加(P＜0．01)。和模型組相比，地塞米松和木犀草素較明顯的降低了IL-1、IL-6和TNF-等細(xì)胞因子的含量(均P＜0．01)，華而不實，木犀草素200mg/kg組作用效果更顯著。見表1。2．3木犀草素對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的保衛(wèi)作用在解剖經(jīng)過中發(fā)現(xiàn)，模型組肺部水腫嚴(yán)重，肺外表粗糙有出血點，且氣管內(nèi)有泡沫狀分泌物流出，正常組無這些異常感覺和狀態(tài)。組織病理切片可見，被感染的肺出現(xiàn)重度炎癥，大量的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤肺部。肺組織構(gòu)造發(fā)生改變，肺泡腔大面積消失，肺泡壁增厚。木犀草素200mg/kg組和地塞米松組病變較模型組有所改善，肺泡腔逐步清楚明晰，肺組織間炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。見圖2。2．4木犀草素對肺組織中p65、IB-、pIB-的表示出的影響NFB信號通路調(diào)控了諸多炎性細(xì)胞因子基因的表示出，NFBp65和IB-、pIB-的Westernblot結(jié)果顯示如此圖3。造模3h后，和正常組相比，模型組中P65的表示出量顯著提高;和模型組相比，木犀草素和地塞米松不同程度的降低了P65的表示出。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ALI模型組中啟動炎性反響的pIB-表示出量顯著增加，IB-表示出量顯著降低，而木犀草素和地塞米松卻抑制了pIB-的表示出，促進(jìn)了IB-的表示出。見圖3。3討論內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖(LPS)成分，可作為抗原激活機體的免疫應(yīng)答，激活白細(xì)胞，誘使TNF、IL-1、IL-6等炎性因子的釋放［6］。LPS直接作用于肺組織，毀壞肺泡引起出血、肺水腫，使壞死組織、炎性細(xì)胞堆積，促使肺泡巨噬細(xì)胞和炎性反響鏈的激活，導(dǎo)致肺內(nèi)炎性反響［7］。近年來，為研究吸入性急性肺損傷，動物模型大多數(shù)是用LPS氣道穿剌滴入造模。來源于革蘭陰性菌外壁的LPS滴注小鼠后，BALF中細(xì)胞因子含量顯著升高，毛細(xì)血管通透性增加和肺功能的變化等表示清楚ALI造模成功［8，9］。后兩項指標(biāo)的變化可間接表示清楚肺外表活性物質(zhì)的代謝發(fā)生改變。王旭光等［10］采用ELISA檢測木犀草素對PGE2生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木犀草素抑制LPS誘導(dǎo)的ＲAW264．7細(xì)胞(小鼠單核/巨噬細(xì)胞系)PGE2的生成，同時下調(diào)LPS誘導(dǎo)的ＲAW264．7細(xì)胞環(huán)氧合酶2(COX-2)及mPGES-1mＲNA和蛋白的表示出，這可能是木犀草素抗炎的機制之一。范文輝等［11，12］通過建立哮喘氣道重塑模型，分別使用地塞米松及木犀草素進(jìn)行干涉，觀察支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-5和干擾素水平的變化，得出結(jié)論木犀草素有顯著的抗氣道重塑作用。同時發(fā)現(xiàn)木犀草素抑制氣道重塑的作用機制為抑制氣道白細(xì)胞介質(zhì)13受體2(IL-13Ｒ2)的表示出。張毅等［13］研究木犀草素對LPS誘導(dǎo)的ＲAW264．7細(xì)胞核因子B(NF-B)和COX-2表示出及NF-BDNA結(jié)合活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木犀草素能顯著性抑制LPS誘導(dǎo)的ＲAW264．7細(xì)胞PGE2的生成，降低NF-B的DNA結(jié)合活性，下調(diào)LPS誘導(dǎo)的ＲAW264．7細(xì)胞COX-2mＲNA、NF-B和COX-2蛋白的表示出。這些研究結(jié)果提示，木犀草素可能對ALI具有保衛(wèi)作用。本研究結(jié)果顯示，木犀草素能明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的Ｒi、Ｒe增長和Cdyn降低，抑制BALF中IL-1、IL-6、TNF-的釋放，減輕了肺部病變，抑制了NFBp65和pIB-的活化。這表示清楚木犀草素對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有保衛(wèi)作用。TNF-和IL-1是ALI早期兩個重要的前炎性因子［14］。在炎性反響初期，TNF-除能發(fā)動血循環(huán)中的PMN向炎癥部位聚集外，還能發(fā)動骨髓白細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，同時激活內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞受TNF-刺激時，釋放E選素、L選擇素、細(xì)胞間黏附分子1和血管黏附因子1等黏附因子，進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-1、IL-6、IL-8、CSF等細(xì)胞因子的分泌，共同介入炎性反響。當(dāng)PMN被激活后，TNF-又能加強PMN的吞噬能力，促進(jìn)PMN脫顆粒和釋放溶酶體，加強PMN呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，毀壞毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，增加肺毛細(xì)血管的通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量組織因子，同時抑制纖溶活性，損害毛細(xì)血管的抗凝功能。這些促炎因子作為重要的信號因子，進(jìn)一步啟動、放大和延續(xù)全身或局部炎性反響，呈現(xiàn)級聯(lián)反響，最終導(dǎo)致炎癥失控。本研究表示清楚木犀草素能明顯的降低了TNF-、IL-1和IL-6等細(xì)胞因子的含量，其中200mg/kg作用效果更顯著。當(dāng)前研究證實，與炎癥和免疫反響關(guān)系密切的很多細(xì)胞因子、黏附分子基因啟動部位均含有核因子NF-B位點。NF-B對細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)具有廣泛的調(diào)控作用，能夠調(diào)控多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。NF-B的主要形式為p50和p65組成的二聚體，p50是與DNA結(jié)合的部位，p65介入基因轉(zhuǎn)錄的超始調(diào)節(jié)，p65是NF-B的主要活性形式，并可促進(jìn)p50與DNA結(jié)合，當(dāng)p65與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抑制蛋白IB結(jié)合，可掩蓋p50上核定位信號，僅有p65蛋白C末含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，能夠直接啟動基因的轉(zhuǎn)錄［15，16］。NF-B一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，同IB僅嚴(yán)密結(jié)合，卻不發(fā)揮作用。在IL-1、TNF、LPS等炎性介質(zhì)作用下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IB激酶被激活，導(dǎo)致IB被磷酸化，進(jìn)而由蛋白酶降解，使IB發(fā)生降解、磷酸化，多聚體上的IB分子的2個絲氨酸磷酸化、泛素化而降解，NF-B則從多聚體上釋放，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定靶B部位結(jié)合，調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄［17］。本研究提示木犀草素保衛(wèi)急性肺損傷中降低了P65的表示出同時抑制了pIB-的表示出，同時促進(jìn)了IB-的表示出。本研究講明木犀草素對NFB信號通路的調(diào)控在急性肺損傷的保衛(wèi)中起到了重要作用，能否和其他細(xì)胞信號通路有關(guān)當(dāng)前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。以下為參考文獻(xiàn)1MatthayMA，UchidaT，F(xiàn)angX．Clinicalacutelunginjuryandacutere-spiratorydistresssyndrome．CurrTreatOptionsCardiovascMed，2002，4:139-149．2