狂犬病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與診斷技術(shù)

狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)與診斷技術(shù)嚴(yán)家爭(zhēng)論員一、狂犬病試驗(yàn)室檢測(cè)與診斷技術(shù)的用途狂犬病人存活期內(nèi)的試驗(yàn)室診斷：目前尚無(wú)試驗(yàn)室方法可確認(rèn)處于埋伏期的狂犬病人。對(duì)可能感染狂犬病毒而尚未發(fā)病〔即處于埋伏期〕的人應(yīng)盡快接種狂犬病疫苗，必要時(shí)還要同時(shí)接種抗血清。國(guó)外文獻(xiàn)上比較牢靠的爭(zhēng)論結(jié)果已證明，6年種疫苗都會(huì)有保護(hù)作用，補(bǔ)種疫苗可以說(shuō)沒(méi)有時(shí)間限制?？袢∪艘坏┌l(fā)病，其死亡率為100%。病人在發(fā)病后最初幾天，檢測(cè)狂犬病毒的抗原一般是敏感的，?？稍谄渫僖?、角膜印片、尿液或皮膚中檢出病毒抗原。檢測(cè)抗原可用熒光抗體〔FA〕法檢查。但是，F(xiàn)A陽(yáng)性標(biāo)本在發(fā)病的后期更常見(jiàn)。皮膚活組織檢查最好從頸背部取含有末稍神經(jīng)的帶有25-50%7—10天才消滅。但在國(guó)內(nèi)護(hù)理?xiàng)l件下，狂犬7天以上。動(dòng)物和人狂犬病的死后診斷：可用抗原檢測(cè)、病毒分別、病毒鑒定等方法進(jìn)展死因確診和病毒來(lái)源、演化分析。測(cè)定狂犬病毒的抗體: 主要用于確定人或動(dòng)物接種狂犬病疫苗是否成功。WHO狂犬病專(zhuān)家委員會(huì)認(rèn)為大于或等于0.5IU/ml的抗體水平表示免疫接種成功，能得到有疫苗接種者主動(dòng)要求在疫苗接種后測(cè)抗體的越來(lái)越多，這是可以理解的。但只要疫苗的質(zhì)量和供貨渠道〔包括保存條件〕牢靠，通常并不要求每個(gè)接種者都檢測(cè)抗體。由于除非接種者本身可能有免疫功能方面的特別，合格疫苗的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率應(yīng)為100%。二、狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)與診斷的必要性典型的狂犬病的臨床表現(xiàn)格外典型，但也有約40%的狂犬病例屬癱瘓型，其表現(xiàn)并不典型，很簡(jiǎn)潔與其他疾病混淆，所以試驗(yàn)室檢測(cè)手段對(duì)狂犬病確實(shí)診格外必要。一個(gè)國(guó)家要把握狂犬病，卻不能普遍應(yīng)用狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，甚至連一個(gè)特地的有權(quán)威的檢測(cè)中心都沒(méi)有，這是不行想象的。因此目前國(guó)內(nèi)有關(guān)狂犬病的科研成果和相關(guān)產(chǎn)品以及各種相關(guān)統(tǒng)計(jì)資料在國(guó)外同行中的可信度不高，整個(gè)國(guó)家要制定科學(xué)的防治戰(zhàn)略也會(huì)失去牢靠的依據(jù)。為了進(jìn)展狂犬病的流行病學(xué)調(diào)查和綜合防治，為了對(duì)狂犬病疫苗的質(zhì)量和實(shí)際效果進(jìn)展監(jiān)控，為了進(jìn)展與狂犬病相關(guān)的根底和應(yīng)用研究等，都迫切需要盡快建立和推廣狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)。以下再舉幾個(gè)具體例子進(jìn)展說(shuō)明。ＷＨＯ要求狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)上報(bào)資料要注明診斷的依據(jù)。僅依據(jù)臨床病癥而不包括試驗(yàn)室診斷依據(jù)的上報(bào)數(shù)字是不行靠的。在泰國(guó)進(jìn)展的一項(xiàng)系統(tǒng)爭(zhēng)論證明，狂犬病的臨床表現(xiàn)只有約60%是典型的〔表現(xiàn)為狂躁、怕水、怕風(fēng)等，另有約40的狂犬病的臨床表現(xiàn)是非典型的〔表現(xiàn)形式以癱于狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)，結(jié)果覺(jué)察，每10個(gè)經(jīng)試驗(yàn)室檢測(cè)證明是死于狂犬病的病人中，必有4人的死因原來(lái)僅依據(jù)臨床病癥而被錯(cuò)誤地歸類(lèi)于其他疾病，實(shí)際上報(bào)的狂犬病死亡人數(shù)只有6人。這就101710/17~0.20232023人，其中絕大多數(shù)都沒(méi)有試驗(yàn)室診斷依據(jù)，而僅依據(jù)典型的狂犬病臨床表現(xiàn)。對(duì)同期其他因病死亡的人的精準(zhǔn)病因的鑒定也根本不包括針對(duì)狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)。假設(shè)套用泰國(guó)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，考慮到由于缺少試驗(yàn)室診斷依據(jù)，可能有40%的狂犬2023年狂犬病的實(shí)際死亡人數(shù)可能應(yīng)推斷為3000人以上。目前國(guó)際上公認(rèn)狂犬病的死亡率是100%，原則上不成認(rèn)有狂犬病康復(fù)的可能，即狂犬病的發(fā)病率應(yīng)與死亡率相等。國(guó)內(nèi)報(bào)刊上常有死亡率小于100%均無(wú)試驗(yàn)室診斷依據(jù)，不被國(guó)際學(xué)術(shù)界成認(rèn)。沒(méi)有合格試驗(yàn)室給出的診斷依據(jù)的康復(fù)病例應(yīng)從狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)數(shù)字中剔除?！翱袢』颊弑厮罒o(wú)疑，不死不算狂犬病”，要挑戰(zhàn)這個(gè)命題，必需供給精準(zhǔn)、完整的病史和權(quán)威的試驗(yàn)室診斷資料。目前國(guó)內(nèi)報(bào)刊和相關(guān)學(xué)術(shù)界公認(rèn)的一些結(jié)論，如國(guó)內(nèi)安康犬中狂犬病毒的帶毒率高達(dá)17%甚至更高；國(guó)內(nèi)的犬可長(zhǎng)期帶毒甚至傳播狂犬病，而犬自身可長(zhǎng)期不發(fā)病等，由于相關(guān)爭(zhēng)論資料都缺少?lài)?yán)格的試驗(yàn)室檢測(cè)、診斷的數(shù)據(jù)；或雖有試驗(yàn)室數(shù)據(jù)，但所用試劑不合格，或方法不行靠，或試驗(yàn)設(shè)計(jì)不合理，所得結(jié)果無(wú)法重復(fù)驗(yàn)證，這些結(jié)果從未得到國(guó)際學(xué)術(shù)界的成認(rèn)。國(guó)外學(xué)者依據(jù)狂犬病在世界各地流行規(guī)律的長(zhǎng)期爭(zhēng)論建立的數(shù)學(xué)模型否認(rèn)了中國(guó)的犬中存在如此高的帶毒率。國(guó)外學(xué)者堅(jiān)持認(rèn)為犬在具有傳播狂犬病的力氣〔唾液腺中可檢出狂犬病毒〕后10天內(nèi)必定會(huì)發(fā)病〔開(kāi)頭消滅狂犬病的病癥據(jù)。三、對(duì)安全操作的建議全部可能涉及活的狂犬病毒的操作均應(yīng)在P2P3生物安全試驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)展。由于對(duì)血清1型以外的狂犬病相關(guān)病毒的致病性還不很了解，全部可能含有這些病毒的標(biāo)本的操作均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)展。全部狂犬病試驗(yàn)室工作人員務(wù)必進(jìn)展狂犬病疫苗的暴露前免疫，這些人員的中和抗體應(yīng)定期檢查，意外地暴露于感染時(shí)必需馬上報(bào)告負(fù)責(zé)人。WHO狂犬病專(zhuān)家委員會(huì)認(rèn)為大于或等于0.5IU/ml的抗體水平表示免疫接種成功，能得到有效的保護(hù)。199WHMN和RFFI〔快速熒光灶抑制試驗(yàn),RapidFluorescentFocusInhibitionTest〕應(yīng)作為其它方法的基準(zhǔn)和參考。MNT是從上世紀(jì)3070年月初開(kāi)頭，RFFIT漸漸成為國(guó)際上最廣泛承受的對(duì)MNTWHO專(zhuān)家委員會(huì)建議在可能時(shí)盡量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、價(jià)廉，且靈敏度與MNT一樣。小鼠中和試驗(yàn)〔Mouseneutralizingtest,MNT〕原理：將確定量預(yù)先滴定好的攻擊病毒，與待滴定的系列稀釋血清混合均勻在37℃保溫1小時(shí)(進(jìn)展體外中和反響)。反響完畢后，血清中的有效抗體效價(jià)越高，殘存的病毒越少(試驗(yàn)中需設(shè)滴度的參照血清)。然后將殘存病毒/血清混和物顱內(nèi)接種10-12克小白鼠，觀看并記錄小鼠發(fā)病及死亡狀況，計(jì)算死亡率和保護(hù)50%動(dòng)物的血清稀釋度。特點(diǎn)：可定量檢測(cè)狂犬病毒中和抗體效價(jià)。需特地技術(shù)培訓(xùn)，操作較繁瑣。需14天出結(jié)果，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于快速診斷。需較多試驗(yàn)小鼠，本錢(qián)高。動(dòng)物間的個(gè)體差會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果?？焖贌晒庠钜种圃囼?yàn)〔RapidFluorescentFocusInhibitionTestRFFIT〕根本試驗(yàn)過(guò)程：將固定劑量的CVS病毒與系列稀釋的待測(cè)血清(包括滴度的參考血清)一起在96孔細(xì)胞培育板中37℃溫育1小時(shí)(體外中和反響)。病毒的最適劑量在預(yù)試驗(yàn)中預(yù)先確定24小時(shí)溫育后能使80%的細(xì)胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)的最高稀釋度。中和反響完畢后在每孔中參與等量敏感細(xì)胞(BSR)懸液。再經(jīng)24小時(shí)溫育后,細(xì)胞單層用丙酮固定,用熒光標(biāo)記的抗NP抗體染色,以檢測(cè)未被中和的剩余病毒的存在(熒光灶FFU),計(jì)算每種待測(cè)血清使固定量CVS病毒的熒光灶數(shù)目(FFU/ml)削減50%抗體滴度。以下顯示的是狂犬病毒在BSR細(xì)胞中形成的熒光灶：酶免疫吸附法〔ELISA〕：酶免疫吸附法是上世紀(jì)七十年月建立的方法，目前世界上用于檢測(cè)狂犬病毒抗體的酶免疫法根本上是承受間接ELISA法，其吸附抗原有全病毒顆粒、純化的狂犬病毒糖蛋白以及純化的狂犬病毒核衣殼蛋白〔RNP〕，并以過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗抗體作為標(biāo)記抗體，即可檢測(cè)人及不同動(dòng)物血清中的抗狂犬病毒抗體。酶免疫吸附法原理示意圖顯色底物酶標(biāo)抗人 IgG抗體待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體狂犬病毒抗原抗狂犬病毒單抗包被32酶免疫吸附法原理示意圖顯色底物酶標(biāo)抗人 IgG抗體待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體狂犬病毒抗原抗狂犬病毒單抗包被32ELISA只需簡(jiǎn)潔的試驗(yàn)室設(shè)備，尤其適合檢測(cè)大量的血清樣品，且在很短的時(shí)間內(nèi)即可出結(jié)果。ELIS法與MNELIS可視為MNT的替代方法。影響ELISA結(jié)果的一些可能因素：嚴(yán)格地講，ELISA試驗(yàn)并不是測(cè)定真正的中和抗體，所測(cè)抗體為全部能與包被板上抗原結(jié)合的IgG抗體，包括一些非特異性抗體，所以其結(jié)果不用國(guó)際單位〔IU/ml〕表示，而是用等價(jià)單位〔EU/ml〕表示。試劑盒的質(zhì)量和有效期：目前市面上的ELISA試劑盒，大局部尚未獲得國(guó)家批準(zhǔn)文號(hào)，質(zhì)量不過(guò)關(guān)或結(jié)果不穩(wěn)定。此類(lèi)試劑盒對(duì)低溫保存的條件要求高，保存時(shí)間短，即使在標(biāo)稱(chēng)有效期內(nèi)，結(jié)果也常會(huì)隨時(shí)間的推移有所降低。國(guó)內(nèi)有些試劑盒所用的原料抗原來(lái)自國(guó)產(chǎn)疫苗的半成品，而且未經(jīng)嚴(yán)格純化。特別是假設(shè)生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞為地鼠腎細(xì)胞，生產(chǎn)試劑盒所用抗原含有地鼠腎細(xì)胞的抗原，則接種了這種用地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗的病人用這種試劑盒測(cè)抗體會(huì)得到效價(jià)很高的結(jié)果，而事實(shí)上此人真正能中和狂犬病毒的抗體可能很低，ELISA結(jié)果所顯示的實(shí)際上可能大局部是針對(duì)地鼠腎細(xì)胞的抗體。值得留意的是，國(guó)內(nèi)的乙腦等疫苗也是用地鼠腎細(xì)胞生產(chǎn)的，國(guó)內(nèi)接種過(guò)這類(lèi)疫苗的人很多，即使是很久以前接種過(guò)，體內(nèi)也普遍存在針對(duì)地鼠腎細(xì)胞的免疫記憶效應(yīng)，再次接種含地鼠腎細(xì)胞抗原的疫苗后，相應(yīng)抗體很簡(jiǎn)潔快速上升。由于上述緣由，用這樣的試劑盒去檢查高度純化的狂犬病疫苗〔如完全不含地鼠腎細(xì)胞抗原的維爾博疫苗〕接種者的抗體，結(jié)果可能反而會(huì)偏低。RFFIT0.1IU/ml,而即使是國(guó)外合格的ELISA0.5IU/ml。所以假設(shè)ELISA檢測(cè)的結(jié)果為陰性,一般需換用MNT或RFFIT進(jìn)展檢測(cè)，而不能直接下結(jié)論。這通常僅發(fā)生在抗體偏低的狀況下〔但也可能剛剛超過(guò)WHO規(guī)定的0.5IU/ml的合格標(biāo)準(zhǔn)。由于合格狂犬病疫苗在全程接種后絕大多數(shù)狀況下抗體滴度都很高10IU/m，全格的ELISA在大多數(shù)狀況下能給出確定的結(jié)果。待檢血清的質(zhì)量：如血清含較多溶血成分，或未在低溫保存，或反復(fù)凍融次數(shù)過(guò)多，都會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果。4.間接免疫熒光法〔IFA〕：以狂犬病毒感染細(xì)胞，制成細(xì)胞片，用間接免疫熒光法檢測(cè)人血清中狂犬病毒抗體。該方法只能作半定量測(cè)定抗狂犬病毒抗體，其靈敏度隨待測(cè)血清的稀釋度增加而降低，同時(shí)與細(xì)胞片制備過(guò)程中病毒接種的量及感染時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。各種狂犬病毒抗體測(cè)定方法所需時(shí)間方法方法時(shí)間定性/定量MNT21天RFFIT26小時(shí)定量ELISA4小時(shí)定量IFA2小時(shí)定性五、狂犬病毒抗原的檢測(cè)免疫熒光〔IF〕法檢測(cè)狂犬病毒抗原我室目前承受抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結(jié)合物，經(jīng)法國(guó)巴斯德?tīng)?zhēng)論所屢次試驗(yàn)，分別檢測(cè)了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等動(dòng)物來(lái)源的樣品〔如腦組織涂片〕，證明我們的熒光抗體具有非特異性小、靈敏度高的特點(diǎn)，質(zhì)量?jī)?yōu)于法國(guó)的產(chǎn)品?？焖倏袢∶该庖咴\斷法〔RapidRabiesEnzymeImmunodetection，RREID)技術(shù)特點(diǎn)：操作便利、快速靈敏，適于大量樣本的檢測(cè)。本試劑盒中酶標(biāo)板包被后需馬上使用或保存于-20℃?zhèn)溆?。肉眼觀看：陽(yáng)性比照顯黃顏色，陰性比照完全無(wú)色。全部顯黃色樣品，無(wú)論深淺均認(rèn)為是陽(yáng)性。這種肉眼觀看已足夠作出診斷，格外經(jīng)濟(jì)，由于不需要昂貴的酶標(biāo)儀，也最適合于作現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。酶標(biāo)儀讀數(shù)：認(rèn)真擦凈平板底面，用450nm濾光片讀數(shù)。福爾馬林固定的樣品不適宜作RREID。基因擴(kuò)增(PCR)及檢測(cè)PCR技術(shù)于1990年首次用于檢測(cè)狂犬病毒RNA，近幾年來(lái)狂犬病毒分子流行病學(xué)爭(zhēng)論的進(jìn)展都與該技術(shù)的應(yīng)用有關(guān)。對(duì)原始樣品中的微量病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)生cDNA后，再經(jīng)PCR進(jìn)展放大。對(duì)放大產(chǎn)物可依據(jù)診斷或分型的不同需要分別用不同方法進(jìn)展分析，如凝膠電泳、斑點(diǎn)雜交、限制性片段長(zhǎng)度分析(RFLP)、直接測(cè)序等。與傳統(tǒng)的病毒分別或免疫學(xué)檢測(cè)法相比，PCR在敏感性、特異性、特別是在能供給準(zhǔn)確的序列資料等方面都要優(yōu)越得多，因此有期望更廣泛地用于狂犬病的常規(guī)檢測(cè)及分子流行病學(xué)爭(zhēng)論?？袢《綪CR診斷的目的應(yīng)選基因組上的保守區(qū)。為分型及鑒別變異株應(yīng)選易變區(qū)。PCRPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜50狂犬病毒G基因的序列測(cè)定和系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)化分析1981年測(cè)定了狂犬病毒G基因全序列，隨后幾年里，又對(duì)幾株狂犬病毒的局部或全部基因進(jìn)展了測(cè)定。通過(guò)系統(tǒng)的序列分析，對(duì)各毒株之間的相互關(guān)系有了進(jìn)一步了解，明確了狂犬病毒分類(lèi)的分子根底。將狂犬病毒的核酸、氨基酸序列與的生物學(xué)和免疫學(xué)特性聯(lián)系起來(lái)，可以推想或確定病毒的抗原打算簇、病毒致病性的分子根底，以及打算病毒感染、復(fù)制和變異等重要功能的氨基酸區(qū)域。這些結(jié)果對(duì)研制狂犬病毒型疫苗及能抑制狂犬病毒感染和復(fù)制的藥物有重要的指導(dǎo)作用?？袢〉穆穹诘降啄苡卸嚅L(zhǎng)？PCR技術(shù)應(yīng)用于狂犬病毒來(lái)源鑒定的一個(gè)精彩例證：美國(guó)CDCSmith3名狂犬病死者分別的毒株的鑒定。死者均為移民，其一移民時(shí)間已達(dá)6年。由于在美國(guó)感染狂犬病的時(shí)機(jī)極少，而且PCR／序列分析的結(jié)果直接證明分別株分別與死者來(lái)源國(guó)家的狗中流行的毒株一樣，所以該作者以迄今最令人信服