狂犬病的實驗室檢測與診斷技術

狂犬病的試驗室檢測與診斷技術嚴家爭論員一、狂犬病試驗室檢測與診斷技術的用途狂犬病人存活期內的試驗室診斷：目前尚無試驗室方法可確認處于埋伏期的狂犬病人。對可能感染狂犬病毒而尚未發(fā)病〔即處于埋伏期〕的人應盡快接種狂犬病疫苗，必要時還要同時接種抗血清。國外文獻上比較牢靠的爭論結果已證明，6年種疫苗都會有保護作用，補種疫苗可以說沒有時間限制。狂犬病人一旦發(fā)病，其死亡率為100%。病人在發(fā)病后最初幾天，檢測狂犬病毒的抗原一般是敏感的，?？稍谄渫僖骸⒔悄び∑?、尿液或皮膚中檢出病毒抗原。檢測抗原可用熒光抗體〔FA〕法檢查。但是，FA陽性標本在發(fā)病的后期更常見。皮膚活組織檢查最好從頸背部取含有末稍神經的帶有25-50%7—10天才消滅。但在國內護理條件下，狂犬7天以上。動物和人狂犬病的死后診斷：可用抗原檢測、病毒分別、病毒鑒定等方法進展死因確診和病毒來源、演化分析。測定狂犬病毒的抗體: 主要用于確定人或動物接種狂犬病疫苗是否成功。WHO狂犬病專家委員會認為大于或等于0.5IU/ml的抗體水平表示免疫接種成功，能得到有疫苗接種者主動要求在疫苗接種后測抗體的越來越多，這是可以理解的。但只要疫苗的質量和供貨渠道〔包括保存條件〕牢靠，通常并不要求每個接種者都檢測抗體。由于除非接種者本身可能有免疫功能方面的特別，合格疫苗的抗體陽轉率應為100%。二、狂犬病的試驗室檢測與診斷的必要性典型的狂犬病的臨床表現格外典型，但也有約40%的狂犬病例屬癱瘓型，其表現并不典型，很簡潔與其他疾病混淆，所以試驗室檢測手段對狂犬病確實診格外必要。一個國家要把握狂犬病，卻不能普遍應用狂犬病的試驗室檢測技術，甚至連一個特地的有權威的檢測中心都沒有，這是不行想象的。因此目前國內有關狂犬病的科研成果和相關產品以及各種相關統(tǒng)計資料在國外同行中的可信度不高，整個國家要制定科學的防治戰(zhàn)略也會失去牢靠的依據。為了進展狂犬病的流行病學調查和綜合防治，為了對狂犬病疫苗的質量和實際效果進展監(jiān)控，為了進展與狂犬病相關的根底和應用研究等，都迫切需要盡快建立和推廣狂犬病的試驗室檢測技術。以下再舉幾個具體例子進展說明。ＷＨＯ要求狂犬病病例的統(tǒng)計上報資料要注明診斷的依據。僅依據臨床病癥而不包括試驗室診斷依據的上報數字是不行靠的。在泰國進展的一項系統(tǒng)爭論證明，狂犬病的臨床表現只有約60%是典型的〔表現為狂躁、怕水、怕風等，另有約40的狂犬病的臨床表現是非典型的〔表現形式以癱于狂犬病的試驗室檢測，結果覺察，每10個經試驗室檢測證明是死于狂犬病的病人中，必有4人的死因原來僅依據臨床病癥而被錯誤地歸類于其他疾病，實際上報的狂犬病死亡人數只有6人。這就101710/17~0.20232023人，其中絕大多數都沒有試驗室診斷依據，而僅依據典型的狂犬病臨床表現。對同期其他因病死亡的人的精準病因的鑒定也根本不包括針對狂犬病的試驗室檢測。假設套用泰國的統(tǒng)計數字，考慮到由于缺少試驗室診斷依據，可能有40%的狂犬2023年狂犬病的實際死亡人數可能應推斷為3000人以上。目前國際上公認狂犬病的死亡率是100%，原則上不成認有狂犬病康復的可能，即狂犬病的發(fā)病率應與死亡率相等。國內報刊上常有死亡率小于100%均無試驗室診斷依據，不被國際學術界成認。沒有合格試驗室給出的診斷依據的康復病例應從狂犬病病例的統(tǒng)計數字中剔除?！翱袢』颊弑厮罒o疑，不死不算狂犬病”，要挑戰(zhàn)這個命題，必需供給精準、完整的病史和權威的試驗室診斷資料。目前國內報刊和相關學術界公認的一些結論，如國內安康犬中狂犬病毒的帶毒率高達17%甚至更高；國內的犬可長期帶毒甚至傳播狂犬病，而犬自身可長期不發(fā)病等，由于相關爭論資料都缺少嚴格的試驗室檢測、診斷的數據；或雖有試驗室數據，但所用試劑不合格，或方法不行靠，或試驗設計不合理，所得結果無法重復驗證，這些結果從未得到國際學術界的成認。國外學者依據狂犬病在世界各地流行規(guī)律的長期爭論建立的數學模型否認了中國的犬中存在如此高的帶毒率。國外學者堅持認為犬在具有傳播狂犬病的力氣〔唾液腺中可檢出狂犬病毒〕后10天內必定會發(fā)病〔開頭消滅狂犬病的病癥據。三、對安全操作的建議全部可能涉及活的狂犬病毒的操作均應在P2P3生物安全試驗室內進展。由于對血清1型以外的狂犬病相關病毒的致病性還不很了解，全部可能含有這些病毒的標本的操作均應在生物安全柜內進展。全部狂犬病試驗室工作人員務必進展狂犬病疫苗的暴露前免疫，這些人員的中和抗體應定期檢查，意外地暴露于感染時必需馬上報告負責人。WHO狂犬病專家委員會認為大于或等于0.5IU/ml的抗體水平表示免疫接種成功，能得到有效的保護。199WHMN和RFFI〔快速熒光灶抑制試驗,RapidFluorescentFocusInhibitionTest〕應作為其它方法的基準和參考。MNT是從上世紀3070年月初開頭，RFFIT漸漸成為國際上最廣泛承受的對MNTWHO專家委員會建議在可能時盡量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、價廉，且靈敏度與MNT一樣。小鼠中和試驗〔Mouseneutralizingtest,MNT〕原理：將確定量預先滴定好的攻擊病毒，與待滴定的系列稀釋血清混合均勻在37℃保溫1小時(進展體外中和反響)。反響完畢后，血清中的有效抗體效價越高，殘存的病毒越少(試驗中需設滴度的參照血清)。然后將殘存病毒/血清混和物顱內接種10-12克小白鼠，觀看并記錄小鼠發(fā)病及死亡狀況，計算死亡率和保護50%動物的血清稀釋度。特點：可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價。需特地技術培訓，操作較繁瑣。需14天出結果，耗時長，不利于快速診斷。需較多試驗小鼠，本錢高。動物間的個體差會影響試驗結果?？焖贌晒庠钜种圃囼灐睷apidFluorescentFocusInhibitionTestRFFIT〕根本試驗過程：將固定劑量的CVS病毒與系列稀釋的待測血清(包括滴度的參考血清)一起在96孔細胞培育板中37℃溫育1小時(體外中和反響)。病毒的最適劑量在預試驗中預先確定24小時溫育后能使80%的細胞感染(產生熒光包含體)的最高稀釋度。中和反響完畢后在每孔中參與等量敏感細胞(BSR)懸液。再經24小時溫育后,細胞單層用丙酮固定,用熒光標記的抗NP抗體染色,以檢測未被中和的剩余病毒的存在(熒光灶FFU),計算每種待測血清使固定量CVS病毒的熒光灶數目(FFU/ml)削減50%抗體滴度。以下顯示的是狂犬病毒在BSR細胞中形成的熒光灶：酶免疫吸附法〔ELISA〕：酶免疫吸附法是上世紀七十年月建立的方法，目前世界上用于檢測狂犬病毒抗體的酶免疫法根本上是承受間接ELISA法，其吸附抗原有全病毒顆粒、純化的狂犬病毒糖蛋白以及純化的狂犬病毒核衣殼蛋白〔RNP〕，并以過氧化物酶標記的抗抗體作為標記抗體，即可檢測人及不同動物血清中的抗狂犬病毒抗體。酶免疫吸附法原理示意圖顯色底物酶標抗人 IgG抗體待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體狂犬病毒抗原抗狂犬病毒單抗包被32酶免疫吸附法原理示意圖顯色底物酶標抗人 IgG抗體待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體狂犬病毒抗原抗狂犬病毒單抗包被32ELISA只需簡潔的試驗室設備，尤其適合檢測大量的血清樣品，且在很短的時間內即可出結果。ELIS法與MNELIS可視為MNT的替代方法。影響ELISA結果的一些可能因素：嚴格地講，ELISA試驗并不是測定真正的中和抗體，所測抗體為全部能與包被板上抗原結合的IgG抗體，包括一些非特異性抗體，所以其結果不用國際單位〔IU/ml〕表示，而是用等價單位〔EU/ml〕表示。試劑盒的質量和有效期：目前市面上的ELISA試劑盒，大局部尚未獲得國家批準文號，質量不過關或結果不穩(wěn)定。此類試劑盒對低溫保存的條件要求高，保存時間短，即使在標稱有效期內，結果也常會隨時間的推移有所降低。國內有些試劑盒所用的原料抗原來自國產疫苗的半成品，而且未經嚴格純化。特別是假設生產疫苗的細胞為地鼠腎細胞，生產試劑盒所用抗原含有地鼠腎細胞的抗原，則接種了這種用地鼠腎細胞生產的疫苗的病人用這種試劑盒測抗體會得到效價很高的結果，而事實上此人真正能中和狂犬病毒的抗體可能很低，ELISA結果所顯示的實際上可能大局部是針對地鼠腎細胞的抗體。值得留意的是，國內的乙腦等疫苗也是用地鼠腎細胞生產的，國內接種過這類疫苗的人很多，即使是很久以前接種過，體內也普遍存在針對地鼠腎細胞的免疫記憶效應，再次接種含地鼠腎細胞抗原的疫苗后，相應抗體很簡潔快速上升。由于上述緣由，用這樣的試劑盒去檢查高度純化的狂犬病疫苗〔如完全不含地鼠腎細胞抗原的維爾博疫苗〕接種者的抗體，結果可能反而會偏低。RFFIT0.1IU/ml,而即使是國外合格的ELISA0.5IU/ml。所以假設ELISA檢測的結果為陰性,一般需換用MNT或RFFIT進展檢測，而不能直接下結論。這通常僅發(fā)生在抗體偏低的狀況下〔但也可能剛剛超過WHO規(guī)定的0.5IU/ml的合格標準。由于合格狂犬病疫苗在全程接種后絕大多數狀況下抗體滴度都很高10IU/m，全格的ELISA在大多數狀況下能給出確定的結果。待檢血清的質量：如血清含較多溶血成分，或未在低溫保存，或反復凍融次數過多，都會影響檢測的結果。4.間接免疫熒光法〔IFA〕：以狂犬病毒感染細胞，制成細胞片，用間接免疫熒光法檢測人血清中狂犬病毒抗體。該方法只能作半定量測定抗狂犬病毒抗體，其靈敏度隨待測血清的稀釋度增加而降低，同時與細胞片制備過程中病毒接種的量及感染時間長短有關。各種狂犬病毒抗體測定方法所需時間方法方法時間定性/定量MNT21天RFFIT26小時定量ELISA4小時定量IFA2小時定性五、狂犬病毒抗原的檢測免疫熒光〔IF〕法檢測狂犬病毒抗原我室目前承受抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結合物，經法國巴斯德爭論所屢次試驗，分別檢測了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等動物來源的樣品〔如腦組織涂片〕，證明我們的熒光抗體具有非特異性小、靈敏度高的特點，質量優(yōu)于法國的產品。快速狂犬病酶免疫診斷法〔RapidRabiesEnzymeImmunodetection，RREID)技術特點：操作便利、快速靈敏，適于大量樣本的檢測。本試劑盒中酶標板包被后需馬上使用或保存于-20℃?zhèn)溆?。肉眼觀看：陽性比照顯黃顏色，陰性比照完全無色。全部顯黃色樣品，無論深淺均認為是陽性。這種肉眼觀看已足夠作出診斷，格外經濟，由于不需要昂貴的酶標儀，也最適合于作現場流行病學調查。酶標儀讀數：認真擦凈平板底面，用450nm濾光片讀數。福爾馬林固定的樣品不適宜作RREID。基因擴增(PCR)及檢測PCR技術于1990年首次用于檢測狂犬病毒RNA，近幾年來狂犬病毒分子流行病學爭論的進展都與該技術的應用有關。對原始樣品中的微量病毒RNA經逆轉錄(RT)產生cDNA后，再經PCR進展放大。對放大產物可依據診斷或分型的不同需要分別用不同方法進展分析，如凝膠電泳、斑點雜交、限制性片段長度分析(RFLP)、直接測序等。與傳統(tǒng)的病毒分別或免疫學檢測法相比，PCR在敏感性、特異性、特別是在能供給準確的序列資料等方面都要優(yōu)越得多，因此有期望更廣泛地用于狂犬病的常規(guī)檢測及分子流行病學爭論?？袢《綪CR診斷的目的應選基因組上的保守區(qū)。為分型及鑒別變異株應選易變區(qū)。PCRPCR產物的瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜50狂犬病毒G基因的序列測定和系統(tǒng)樹進化分析1981年測定了狂犬病毒G基因全序列，隨后幾年里，又對幾株狂犬病毒的局部或全部基因進展了測定。通過系統(tǒng)的序列分析，對各毒株之間的相互關系有了進一步了解，明確了狂犬病毒分類的分子根底。將狂犬病毒的核酸、氨基酸序列與的生物學和免疫學特性聯(lián)系起來，可以推想或確定病毒的抗原打算簇、病毒致病性的分子根底，以及打算病毒感染、復制和變異等重要功能的氨基酸區(qū)域。這些結果對研制狂犬病毒型疫苗及能抑制狂犬病毒感染和復制的藥物有重要的指導作用?？袢〉穆穹诘降啄苡卸嚅L？PCR技術應用于狂犬病毒來源鑒定的一個精彩例證：美國CDCSmith3名狂犬病死者分別的毒株的鑒定。死者均為移民，其一移民時間已達6年。由于在美國感染狂犬病的時機極少，而且PCR／序列分析的結果直接證明分別株分別與死者來源國家的狗中流行的毒株一樣，所以該作者以迄今最令人信服