分子標記遺傳圖譜構建方法-完整

/15型，記為5。對于BC1、DH和RI群體，每個分離的基因座都只有兩種基因型，不論是共顯性標記還是顯性標記，兩種基因型都可以識別，加上缺失數(shù)據(jù)的情況，總共只有3種類型。因而用3個數(shù)字就可以將標記全部帶型數(shù)字化。在分析質量性狀基因與遺傳標記之間的連鎖關系時，也必須將有關的表型數(shù)字化，其方法與標記帶型的數(shù)字化相似。例如，假設在DH群體中，有一個主基因控制株高，那么就可以將株系按植株的高度分為高稈和矮稈兩大類，然后根據(jù)親本的表現(xiàn)分別給高稈和矮稈株系賦值，如1和2。將質量性狀經過這樣的數(shù)字化處理，就可以與DNA標記數(shù)據(jù)放在一起進行連鎖分析。DNA標記數(shù)據(jù)的收集和處理應注意以下問題：（1）應避免利用沒有把握的數(shù)據(jù)。由于分子多態(tài)性分析涉及許多實驗步驟，很難避免出現(xiàn)錯誤，經常會遇到所得試驗結果（如X-光片）不清楚等問題。如果硬性地利用這樣沒有把握的數(shù)據(jù)，不僅會嚴重影響該標記自身的定位，而且還會影響到其它標記的定位。因此，應刪除沒有把握的數(shù)據(jù)，寧可將其作為缺失數(shù)據(jù)處理，或重做試驗。（2）應注意親本基因型，對親本基因型的賦值（如P1型為1,P2型為2），在所有的標記座位上必須統(tǒng)一，千萬別混淆。如果已知某兩個座位是連鎖的，而所得結果表明二者是獨立分配的，這就有可能是把親本類型弄錯引起的。（3）當兩親本出現(xiàn)多條帶的差異時，應通過共分離分析鑒別這些帶是屬于同一座位還是分別屬于不同座位。如屬于不同座位，應逐帶記錄分離數(shù)據(jù)。二、遺傳圖距與物理距離對應關系的估計不同生物的1cM圖距所對應的實際物理距離（堿基對數(shù)量）存在很大差異。一般而言，生物越低等或越簡單，1cM圖距平均對應的堿基對數(shù)量就越少（表3.1）。表3.1中給出的各種生物中遺傳圖距與物理距離之間的對應關系只是一個大約的平均值，實際上它變化很大。在一條染色體上，由于不同區(qū)域上發(fā)生交換的頻率存在差異，因而遺傳圖距與物理距離之間的對應關系可以有很大的變化。例如，在著絲粒附近，染色體交換受到抑制，因而所估計的遺傳圖距小于平均對應的物理距離。在同一種生物中，兩個特定基因座之間的遺傳圖距會因遺傳背景的不同而改變，甚至有時由同一對親本所產生的遺傳背景相同的不同群體間也存在很大差異。表3.1不同生物中單位圖距所相當?shù)钠骄锢砭嚯x

物種基因組大?。╧b）遺傳圖距（cM）kb/cM嗜菌體T41.6X1028000.2大腸桿菌4.2X1031,7502.4酵母2.0X1044,2004.8真菌2.7X1041,00027.0線蟲8.0X104320250.0果蠅1.4X105280500.0水稻4.5X1051,500300.0小鼠3.0X1061,7001,800.0人類3.3X1063,3001,000.0玉米2.5X1062,5001,000.0三、構建DNA標記圖譜的計算機軟件遺傳圖譜的構建需要對大量標記之間的連鎖關系進行統(tǒng)計分析。隨著標記數(shù)目的增加，計算工作量常常呈指數(shù)形式增加，這是手工無法完成的。因此，必須借助計算機進行分析和處理。許多學者為構建遺傳圖譜設計了專用程序包,通過Internet網(wǎng)址/soft/list.html可以獲得各種專用程序的相關信息，如軟件的名稱及簡要介紹，源程序編碼語言、支持的操作系統(tǒng)、執(zhí)行程序的名稱、參考文獻以及獲取軟件的網(wǎng)址等。應用于植物遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構建的常用軟件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。LINKAGE軟件可通過/software/linkage獲得,該軟件是利用最大似然法估計兩座位或多座位間的重組率和LOD值;MAPMAKER/EXP可通過/distri-bution/software/mapmaker3獲得，該軟件可以應用于各種類型的實驗群體進行遺傳作圖，是目前應用最為廣泛的作圖軟件之一。第四節(jié)DNA標記連鎖圖譜的完善一、DNA標記連鎖群的染色體定位把分子標記所建立的連鎖群與經典遺傳圖譜聯(lián)系起來，并將其歸屬到相應的染色體上，是構建了一個比較飽和的分子圖譜之后十分重要的工作。通常根據(jù)分子標記與已知染色體位置的形態(tài)標記的連鎖關系來確定分子標記連鎖群屬于哪條染色體。還可以利用非整倍體或染色體結構變異材料，如水稻中利用三體、玉米中利用A/B易位系、小麥中利用缺體/四體染色體代換系等，將分子標記連鎖群歸屬到相應的染色體上。以水稻為例，目前已獲得全套12條染色體的初級三體（2n+1）。在水稻某種三體中，由于三體染色體有一式3份，其DNA含量為其它11條染色體的1.5倍。在DNA定量相當準確的條件下，用已知能檢測某一連鎖群的探針分別與12種三體的總DNA雜交。根據(jù)劑量效應，雜交強弱與同源序列的含量成正比，雜交后對應三體的DNA濾膜放射自顯影顯帶強度將明顯高于其它11種，由此可以判定該標記所對應的序列就在該三體染色體上。隨著技術的進步，原位分子雜交的靈敏度已可以揭示單拷貝序列的雜交位點，因此采用原位分子雜交可以容易地將連鎖群的分子標記定位到染色體上。要得到一個完整的遺傳圖譜，必須知道染色體上的標記與著絲粒之間的距離。一個完整的染色體具有以下幾個主要部分：著絲粒、縊痕、隨體及端粒，這些基本結構在生物染色體的運動與復制等方面起著重要的作用，其結構也是遺傳圖譜制作中不可忽視的重要部分。由于著絲粒并不是一個基因，不能從表型測知，因此采用常規(guī)的兩點、三點乃至多點分析方法是無法確定標記與著絲粒之間的關系的。在經典遺傳圖譜的構建中，一般采用近端著絲粒染色體來對基因與著絲之間的距離進行定位。近端著絲粒染色體是正常染色體在著絲粒附近斷裂形成的異常染色體。目前已獲得小麥全部42條染色體的近端著絲粒染色體。利用染色體易位材料也可以判斷著絲粒在染色體上的位置。一般易位點和著絲粒所在部分的交換被抑制，因而推算位于著絲粒兩旁的易位點與標記基因間的重組率時一般都偏小。利用這個現(xiàn)象可以推算連鎖圖上著絲粒的位置。在細胞學上，利用已知易位點的易位系統(tǒng)進行基因分析也可知道著絲粒的位置。早在1945年，在玉米中就利用易位分析的結果推測了全部染色體的著絲粒位置。染色體上的端粒是指染色體的自然末端。在遺傳圖譜的構建中，端粒位置的確定就意味著為染色體的全長設定界標。傳統(tǒng)的凝膠電泳方法由于分辨能力有限，大多數(shù)情況下無法將具有多態(tài)性的端粒片段區(qū)分開來。一般要借助具有高分辨率的脈沖場凝膠電泳（PFGE）才能將有差異的端粒片段分離開來。利用PFGE與切割位點稀少的限制性酶相結合，Wu和Tanksley（1993）研究了水稻端粒結構的特征，采用來自擬南芥的端粒探針，將三個水稻的端粒DNA電泳條帶分別定位在第8、9、11染色體上，并證實了多態(tài)性的端粒片段不僅在遺傳上而且在物理上與遺傳圖譜上最遠端的RFLP標記相連鎖。目前，在日本水稻基因組研究計劃所構建的包含2275個標記的水稻分子連鎖圖中，除第9染色體之外，其余11條染色體的著絲粒（區(qū)）都已定位（Harushimaetal.1998）。另外，該圖中的第5染色體短臂、第11染色體兩臂以及第12染色體短臂的端粒也已定位。二、飽和DNA標記連鎖圖的制作遺傳圖譜飽和度是指單位長度染色體上已定位的標記數(shù)或標記在染色體上的密度。一個基本的染色體連鎖框架圖大概要求在染色體上的標記平均間隔不大于20cM。如果構建連鎖圖譜的目的是為了進行主基因的定位，其平均間隔要求在10?20cM或更小。用于QTL定位的連鎖圖，其標記的平均間隔要求在10cM以下。如果構建的連鎖圖譜是為了進行基因克隆，則要求目標區(qū)域標記的平均間隔在1cM以下。不同生物基因組大小有極大差異，因此滿足上述要求所需的標記數(shù)是不同的。以人類和水稻為例，它們的基因組全長分別為3.3X106kb和4.5X105kb，如果構建一個平均圖距為0.5cM的分子圖譜,則所要定位的標記數(shù)就要分別達到6600和3000個。幾種生物不同圖譜飽和度下所需定位的標記數(shù)如表3.2所示。表3.2遺傳圖譜達到特定飽和度所需的標記數(shù)生物人類水稻玉米擬南芥番茄(kb)3.3X1064.5X1052.5X1067.0X1047.1X105基因組(cM)3300150025005001500大小kb/cM10003001000140473圖20cM165751252575譜10cM33015025050150飽5cM660300500100300和1cM3300150025005001500度0.5cM66003000500010003000Tanksley等(1988)以假設擁有12條染色體，每條長100cM，全長1200cM的生物為例，研究了所需標記數(shù)與圖譜飽和度之間的關系，發(fā)現(xiàn)影響所需標記數(shù)的主要因素有兩個。一個是標記間的平均距離，即圖譜總長度除以定位的標記數(shù)，它反映了標記圖譜的平均密度。對于染色體全長1200cM的生物，如果定位了120個標記，則標記間的平均距離為10cM。另一個因素是標記間的最大距離。標記在基因組上的分布是不均勻的。即使在一張平均密度很高的圖譜上，仍然可能存在較大的間隙區(qū)。例如，據(jù)理論推算，如果用于作圖的標記是隨機選擇的，則當標記平均距離為1cM時，仍有可能存在10cM的間距。而若要將最大可能間距從10cM減小到5cM，則需要另外增加1000個標記。因此，通過提高圖譜平均密度的方法來縮小最大標記間距是很困難的。在實際研究中，為了填補間隙，應有針對性地在間隙區(qū)上尋找標記，或尋找該間隙所在區(qū)域上有差異的親本構建作圖群體。沒有一種標記在基因組中分布是完全隨機的。如著絲粒區(qū)通常以重復序列為主，因而以單拷貝克隆為探針的RFLP標記就不可能不覆蓋這些染色體區(qū)域。從這一點考慮，利用特性上互補的不同DNA標記進行遺傳作圖，將有助于提高遺傳圖譜的飽和度。三、DNA標記連鎖圖與經典遺傳連鎖圖的整合從1987年報道玉米和番茄的RFLP遺傳圖譜以來，具有重要經濟價值的栽培植物幾乎都已構建了以RFLP為主的DNA標記遺傳圖譜，其中水稻分子圖譜上所定位的RFLP標記數(shù)已超過2000個(Harushimaetal.1998)。為了充分利用現(xiàn)有的分子和遺傳的信息，必須將分子遺傳圖譜與經典遺傳圖譜結合起來，成為一張綜合的遺傳圖譜。將兩類遺傳標記綜合到一張遺傳圖譜中去，不僅是重要經濟性狀準確定位的需要，也是以圖位克隆方法分離目的基因的需要。但是，由于兩類圖譜的構建是相互獨立的，使用的作圖群體是不同的，且它們之間缺乏共有的遺傳標記，因而整合起來并不容易。另外，經典遺傳圖譜本身就是一張依據(jù)許多由不同研究者利用不同作圖群體在不同條件下完成的實驗結果而繪制成的綜合圖譜，其中有的標記基因間的相對位置不一定十分精確，因此，在與分子圖譜整合時，不能簡單地根據(jù)標記間的相對圖距進行推論。鑒于上述原因，分子圖譜與經典圖譜的整合只能通過將傳統(tǒng)的遺傳標記基因一個一個地定位到分子圖譜中去的策略來進行。為此，可以選擇各種傳統(tǒng)的遺傳標記材料來建立作圖群體，并用適當?shù)姆椒焖俚卣业脚c傳統(tǒng)的遺傳標記緊密連鎖的分子標記(參見第四章)，再根據(jù)分子標記在分子圖譜上的位置來確定傳統(tǒng)遺傳標記的位置。在栽培植物中，水稻的經典連鎖圖譜和分子連鎖圖譜的整合工作進展較快，這主要受益于水稻在經典連鎖圖譜上的長期累積性工作，目前至少已將47個形態(tài)標記和11個同工酶標記定位到了分子連鎖圖上(Causse等1994)。第五節(jié)比較作圖比較作圖(ComparativeMapping)就是利用一種物種的DNA標記對另一物種進行遺傳或物理作圖。比較作圖的分子基礎就是物種間DNA序列尤其是編碼序列的保守性。通過比較作圖可揭示不同物種基因組或基因組區(qū)域同線性或共線性的存在，從而了解不同物種基因組結構的相似性及基因組進化的歷程。所謂同線性是指定位在一個物種的染色體上的兩個或多個標記又被定位于另一物種的同源染色體區(qū)域上，但這些標記間的相對排列順序可變化；而共線性則指定位在同源染色體區(qū)域上的標記，其標記間的相對排列順序是保守的。比較作圖始于人-鼠間的基因組同源性比較。至今許多植物之間也進行了比較作圖研究，如番茄、馬鈴薯和辣椒(Tanksleyetal.1988；1992)；水稻、小麥和玉米(Ahnetal.1993；1994)；小麥、大麥和黑麥(Devosetal.1993)；高粱和玉米(Pereiraetal.1994)；擬南芥和蕓苔屬(Kowalskietal.1994)以及大麥和水稻(Maroofetal.1996)等。Moor等(1995)對水稻、小麥、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6種主要禾本科物種的比較作圖研究表明，這些禾本科植物基因組的保守性可歸結到水稻基因組的19個連鎖區(qū)段上，由這19個區(qū)段可實現(xiàn)對所研究的全部禾谷類作物進行染色