色譜基礎原理

研究植物葉子的組成時，他將植物色素的石油醚浸取液通過填充有碳酸鈣的直立玻璃管，再用純凈的石油醚自上而下淋洗，隨著淋洗的進行，發(fā)現(xiàn)不同色素向下移動的速度不同，最后色素中各組分互相分離，形成不同顏色的譜帶。

1906年由俄國植物學家Tswett創(chuàng)立色譜柱流動相固定相石油醚色譜原型裝置玻璃管碳酸鈣譜帶色譜法的起源2023/1/3011968年前后高效液相色譜法1975年離子色譜法80年代初超臨界流體色譜法80年代中后期毛細管電泳法90年代后期毛細管電色譜法目前手性分離色譜、高分辨色譜、多維色譜1935年離子交換柱色譜法1941年液液分配柱色譜法1944年紙色譜法1952年氣相色譜法1956年薄層色譜法1959年凝膠柱色譜法色譜方法的發(fā)展歷史2023/1/302色譜發(fā)展初期，Martin等人借助分餾中的塔板概念，把色譜柱設想為由許多塔板組成的分餾塔，把色譜分離過程比擬作分餾過程，提出了表達柱效能模式的塔板理論。012345LH色譜柱ΔVL:色譜柱柱長;H:

理論塔板高度;ΔV：樣品體積（1）塔板理論2023/1/303

塔板理論的假設：

(1)每一個平衡過程間隔內，平衡可以迅速達到；

(2)將載氣看作成脈動（間歇）過程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴散可忽略；

(4)每次分配的分配系數(shù)相同。

1.塔板理論（platetheory）

半經驗理論；將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復。色譜理論：塔板理論-柱分離效能指標2023/1/304

色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關系為保留時間包含死時間，在死時間內不參與分配!理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關系為：

n=L/H色譜峰的方差與柱長或保留時間的關系為：色譜理論：塔板理論-柱分離效能指標2023/1/305色譜興起之后，科學家們在實際研究中發(fā)現(xiàn)得到的色譜峰往往是展寬的圖形，塔板理論無法解釋這種現(xiàn)象。為此，荷蘭學者VanDeemter等人于1956年提出了速率理論。該理論吸收了塔板理論中理論塔板高度的概念，并同時考慮影響理論塔板高度的動力學因素（渦流擴散、分子擴散、傳質阻力、載氣流速等

），研究色譜分離過程中的動力學因素對峰展寬的影響，對色譜分離條件的選擇具有指導意義。

速率理論為色譜法的實踐提供了理論指導，同時為高效液相色譜法的創(chuàng)建提供了啟迪和依據(jù)。（2）速率理論2023/1/3061.速率方程（也稱范·弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，

u：載氣的線速率(cm/s)。

減小A、B、C三項可提高柱效。存在著最佳流速。

A，B，C三項各與哪些因素有關？色譜理論：速率理論-影響柱效的因素2023/1/307載氣流速高時：傳質阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效載氣流速低時：分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速,柱效

H-u曲線與最佳流速：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應載氣流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。載氣流速與柱效——最佳流速2023/1/308

(1)組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散、傳質阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達到等是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。

(2)通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。

(3)為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。

(4)各種因素相互制約：載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。速率理論的要點：2023/1/309隨著色譜工作的發(fā)展，通過化學反應將固定液鍵合到載體表面，這種采用化學鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜法(4)流動相固定相類型液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜

液相色譜LC

氣相色譜GC(1)(2)(3)SFC超臨界流體色譜超臨界流體1、按流動相和固定相的狀態(tài)分類2023/1/3010柱色譜平面色譜固定相裝在管柱內固定相呈平面狀填充柱色譜毛細管柱色譜按照管柱的粗細和固定相的填充方式高分子薄膜色譜薄層色譜紙色譜按平面材料的不同2、按固定相的操作形式分類2023/1/3011色譜法氣相色譜法液相色譜法超臨界流體色譜法填充柱色譜法毛細管柱色譜法平面色譜法柱色譜法經典液相柱色譜法高效液相色譜法薄層色譜法紙色譜法高分子薄膜色譜法3、色譜法的簡單分類2023/1/3012吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法尺寸排阻色譜法親和色譜法生物色譜法4、按色譜過程的分離機制分類2023/1/3013（1）

吸附色譜法：用固體吸附劑作固定相，根據(jù)樣品中不同組分在吸附劑上的物理吸附性能的差異進行分離。如氣固色譜法、液固色譜法。（2）分配色譜法：用液體做固定相，根據(jù)不同組分在固定相（液體）和流動相之間分配系數(shù)的不同進行分離。如氣液色譜法、液液色譜法。4、按色譜過程的分離機制分類2023/1/3014（3）離子交換色譜法：固定相是離子交換劑，依據(jù)離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團進行可逆性離子交換能力的差別進行分離。（4）尺寸排阻色譜法：又叫凝膠色譜法或空間排阻色譜法，用多孔性凝膠作固定相，根據(jù)不同大小的組分分子在多孔性凝膠中的選擇性滲透進行分離。4、按色譜過程的分離機制分類2023/1/3015（5）親和色譜法：以在不同基體上鍵合多種不同特征的配體作固定相（稱固定化分子），根據(jù)不同組分與固定相的高專屬性親和力進行分離。（6）生物色譜法：采用各種具有生物活性的材料（例如：酶、載體蛋白、細胞膜、活細胞等）作固定相，利用固定相與各種生物活性物質的選擇性結合進行分離。4、按色譜過程的分離機制分類2023/1/3016正相色譜離子色譜反相色譜HILICSFC常用的液相色譜技術2023/1/3017增加容量因子κ增加柱效N增加分離因子α兩個組分分離峰對于色譜而言，影響分離度的三個因素中，分離因子最為重要。影響分離因子的因素固定相類型固定相生產商-不同品牌的相同固定相，也有很大的選擇性差別pH值流動相-甲醇，乙腈，THF以及不同比例的混合物。影響色譜分離度的因素2023/1/3018

組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、解吸，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。分配系數(shù)(

partitioncoefficient)K2023/1/3019

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時，K主要取決于固定相性質；每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎；某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。分配系數(shù)K

的討論：2023/1/3020△Go------相對于標準狀態(tài)的組分自由能R---------氣體常數(shù)Tc--------柱溫一般，溫度上升20℃，K值約下降一半。分配系數(shù)與柱溫的關系

2023/1/3021一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質量比。

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學性質有關的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。

2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。

3.分配比可以由實驗測得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)和容量比(capacityradio)；3.分配比（partitionradio）k2023/1/3022(二)分配系數(shù)和容量因子與保留時間的關系設流動相的線速度為u，組分的速度為v，將二者之比稱為保留比：分配系數(shù)和容量因子的關系3.分配比（partitionradio）k

2023/1/30233.分配比(partitionradio)k

2023/1/3024輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)高效液相色譜儀組成2023/1/302526高效液相色譜組成2023/1/301.在線脫氣機(G1322A/G1379A)2.四元／二元/單元泵(G1311A/G1312A/G1310A)3.自動進樣器(G1313A)4.二極管陣列檢測器(G1315B)5.可變波長紫外檢測器（G1314A)1100HPLCMaintenance&Troubleshooting2023/1/3027Agilent1100系列HPLC2023/1/3028在線脫氣機(G1322A/G1379A)Agilent1100在線脫氣機2023/1/3029工作原理Agilent1100在線脫氣機2023/1/3030何時需要使用Agilent1100在線脫氣機Agilent1100在線脫氣機2023/1/3031脫氣機的操作：操作泵之前，用至少兩個體積（標準脫氣機30ml，對微脫氣機10ml）沖洗真空脫氣機，特別是當泵關閉了一段時間后（如過夜），以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時。標準脫氣機（G1322A).

標準脫氣機每個通道體積為12ml建議排液操作：5ml/min排液6min以上。微脫氣機（G1379A).微脫每個通道體積為1ml建議排液操作：2ml/min排液5min。切勿用5ml/min流速去排液。Agilent1100在線脫氣機-在線脫氣機(G1322A/G1379A)2023/1/303233使用Agilent1100在線脫氣機須知溶劑

用棕色玻璃瓶裝水溶液，可以避免藻類的生長。

過濾溶劑以免其中微粒永久性阻塞毛細管。避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑：堿金屬鹵化物及其酸溶液(如：碘化鋰、氯化鉀等)。

高濃度無機酸，如硝酸、硫酸.

可能含有過氧化物的色譜純醚(如THF、二氧六環(huán)、二丙基乙醚)。這些在使用前必須用干燥氧化鋁過濾除去過氧化物。

含強絡合劑的溶液(如EDTA，乙二胺四乙酸)。

四氯化碳與2-異丙醇或四氫呋喃的混合液。Agilent1100在線脫氣機2023/1/3033防止堵塞溶劑過濾器及真空腔污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵的運行。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH

4至7)中尤其如此。下列建議將會延長溶劑過濾器的使用壽命并維持泵的運行。使用滅過菌的溶劑瓶來減緩藻類生長。使用新鮮配制的流動相，特別是水溶劑或鹽緩沖液（建議不超過兩天）。如果應用許可，在溶劑中加人0.0001－0.001

M的疊氮化鈉。避免溶劑瓶暴露在直射陽光下。用氬氣置換流動相上層的空氣。長期不用時用水清洗水溶液通道并置換為甲醇Agilent1100在線脫氣機日常維護,故障診斷2023/1/3034檢查溶劑過濾器－擰開脫氣機出口或比例閥入口管線，并使液面高于出口30cm此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。－查看過濾器是否變色．－臨時取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常．清潔溶劑過濾器將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下。先用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃硝酸（35％）的燒杯里浸一小時。用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器。建議不使用超聲波清洗機清洗。將過濾器重新裝好。建議定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶，每三個月至少清洗一次。注意：不要使用沒有安裝溶劑過濾器的系統(tǒng)．可能會嚴重堵塞系統(tǒng)Agilent1100在線脫氣機日常維護,故障診斷2023/1/3035Question?1.如何簡單判斷脫氣機脫氣是否正常？打開Purge閥，設定泵的流速2ml/min，提起當前所使用溶劑瓶內的溶劑過濾頭，使之脫離液面一小段時間，此時溶劑傳送管內會產生一小段氣泡，放下過濾頭，讓此段氣泡通過脫氣機，如果脫氣機正常，氣泡應消失或縮小。2.如何簡單判斷脫氣機腔體或溶劑過濾頭是否堵塞？

關閉泵，擰開脫氣機出口或比例閥入口管線,此時溶劑會因為重力流出，脫氣機或溶劑過濾頭堵塞時，溶劑會流出不暢或不流出。Agilent1100在線脫氣機日常維護2023/1/3036Agilent1100四元泵(G1311A)2023/1/3037Agilent1100四元泵工作原理2023/1/3038Agilent1100泵頭(PumpHead)結構圖Agilent1100泵2023/1/3039Agilent1100系列泵使用須知Agilent四元／二元/單元泵日常維護2023/1/3040多通道梯度閥（MCGV）操作要點當鹽溶液和有機溶劑混合時，鹽溶液可能與有機溶劑完全混溶，而不會出現(xiàn)沉淀。但是在梯度閥的混合點，重力作用有可能使鹽顆粒沉淀下來。通常，閥的A通道用于水相/鹽溶液，而泵的B通道用于有機溶劑。如果使用的是這樣的配置，鹽將落回到鹽溶液中，并被溶解。當泵使用的不同配置（例如，D-鹽溶液，A-有機溶劑）時，鹽可能會落到有機溶劑中，從而出現(xiàn)問題。Agilent1100四元泵中使用鹽溶液和有機溶劑時，建議將鹽溶液接到下面的口上，有機溶劑接到上面的梯度閥口上。有機溶劑通道最好直接在鹽溶液通道的上面。建議定期用水沖洗所有MCGV通道，以去除在閥口上可能出現(xiàn)的鹽沉淀。

Agilent四元／二元/單元泵日常維護2023/1/3041更好地使用四元泵

將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面(或較高處)。當在四元泵上使用鹽溶液或有機溶劑時，建議將鹽溶液接在底部得梯度閥口上，將有機溶劑接在上面得梯度閥口上。有機通道最好在鹽溶液通道得上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出得鹽結晶。操作泵之前，用至少兩個體積（標準脫氣機30ml，對微脫氣機10ml）沖洗真空脫氣機，特別是當泵關閉了一段時間后（例如，過夜），以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時。防止溶劑過濾器堵塞及長菌。當慮器表面有黑色或黃色污染層說明慮器發(fā)生了堵塞，請立即清洗或更換之。定期檢查排液閥的慮芯。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動相，流速5ml/min，若壓力大于10bar,則須立即更換。

Agilent四元／二元/單元泵日常維護2023/1/3042更好地使用泵當使用低流速時（不高于0.2

ml/min）檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏（用壓力測試或漏液測試）。每當更換泵密封圈時排液閥慮芯也應更換。更換活塞密封墊時檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應盡早更換有劃痕的活塞。使用緩沖溶液時，關泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當需要長時間使用0.1摩爾或更高濃度得緩沖液時，最好選用密封墊清洗附件，以減少對密封墊及活塞桿的磨損。更換活塞密封墊后應按照密封墊安裝步驟對其進行磨合，但磨合不適用于正相密封墊。Agilent1100系列泵的使用須知2023/1/3043

更好地使用泵

當泵頭安裝有沖洗附件時，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增加活塞桿運動時的阻力。所以開泵前一定要用10％異丙醇，并將其流速調至約20滴/分鐘使這溶液流過沖洗裝置。10％異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。最好不要用其它溶劑代替。

當泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10％異丙醇，會使密封墊及活塞桿的壽命減短。Agilent1100系列泵的使用須知2023/1/3044密封墊磨合操作：1.以異丙醇作為溶劑并將其管道直接連接到主動閥(四元泵需一接頭，部件號0100－1847）。2.連接阻尼管（部件號5022－2159）于排液閥的出口，阻尼管的另一端置于廢液瓶中。3.打開排液閥，并用異丙醇以2ml/min的流速沖洗系統(tǒng)10分鐘。4.關閉排液閥，設置流速使壓力達到350bar，并使系統(tǒng)在此壓力下保持15分鐘。5.關閉泵，緩慢打開排液閥釋放壓力，重新連接管路，然后沖洗系統(tǒng)中的異丙醇。注意，只有反相密封墊（5063－6589）才需此操作而正相密封墊（0905－1420）因其最高只耐受200bar,所以此操作會損害它。Agilent1100系列泵的使用須知2023/1/30451.更換排液閥慮芯2.清洗,更換主動閥閥芯3.清洗球形單向閥4.更換密封墊，活塞桿Agilent四元／二元/單元泵日常維護2023/1/3046Question?1.如何簡單判斷比例閥是否內漏？

設定泵使用一個單獨通路（A），打開Purge閥，流速5ml/min，提起其他溶劑瓶內的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路（B、C、D）內的溶劑是否隨著流動，正常時均不應流動。2.何時應該更換Purge閥內的過濾白頭？

使用純水作流動相，打開Purge閥，流速5ml/min，觀察系統(tǒng)壓力，如果超過10bar，應該更換。3.泵壓力不正?？赡苡赡切┰蛞穑?/p>

氣泡，主動閥故障，出口閥故障，密封墊或柱塞桿磨損，滲漏或堵塞，比例閥故障，傳感器故障，使用比例閥混合時鹽濃度太高Agilent1100系列泵的日常維護2023/1/3047Agilent1100自動進樣器(G1313A)2023/1/3048Agilent1100自動進樣器工作原理2023/1/3049Agilent1100自動進樣器工作原理2023/1/3050Agilent1100自動進樣器使用須知2023/1/3051更換轉子密封圈更換針及針座Agilent1100自動進樣器日常維護2023/1/3052Agilent1100柱溫箱器使用注意事項及日常維護2023/1/3053連接的管路盡量短，防止熱擴散及峰增寬。如果使用小體積分析柱以及流速小于0.2ml/min時建議使用左邊的柱溫箱(左邊體積較少,3ul).除非特殊應用，建議將兩邊溫度設置一樣。并確保關好前蓋。Agilent1100柱溫箱器使用注意事項及日常維護2023/1/3054Agilent1100二極管陣列檢測器(G1315B)2023/1/3055Agilent1100二極管陣列檢測器工作原理2023/1/3056可變的光進口狹縫系統(tǒng)這一微型狹縫系統(tǒng)是利用硅的機械性能和總體布局微型加工技術以及精確的制作功能加工而成，它把所需的光學性能－狹縫和光柵－集中組合到一起，成為一個簡單、緊湊的元件。狹縫寬度直接由儀器上的微處理器來控制，并可用為設定分析方法的一個實驗參數(shù)。光柵用一個凹面全息光柵來實現(xiàn)分光和光譜成像，光柵把入射光束全部分散成組成它的波長，然后把它反射到二極管陣列上。二極管陣列二極管陣列由1024個光電二極管和一個位于陶瓷基座上的電路組成，在190

---950

nm范圍內取樣間隔<

1

nm。Agilent1100二極管陣列檢測器工作原理2023/1/3057燈紫外區(qū)域采用有通光狹縫的氘燈作光源，低壓氘氣體的等離子體能發(fā)出190nm到大約800

nm的光?？梢姽猓╒IS）和近紅外光采用