大腸桿菌、質(zhì)粒和噬菌體

一、大腸桿菌：概述

應(yīng)用基本操作二、質(zhì)粒：常見質(zhì)粒質(zhì)粒的分離純化感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)化三、噬菌體：λ噬菌體及其載體

M13噬菌體及其載體四、分子克隆主要內(nèi)容第一頁，共九十四頁。大腸桿菌

第二頁，共九十四頁。大腸桿菌第三頁，共九十四頁。大腸桿菌一般特征◆原核生物，G-棒狀桿菌(紅色)◆有鞭毛，無芽孢，能運(yùn)動，有的有莢膜◆長度大約2um，寬0.8um◆DNA長度約為體長的1000倍染色體是長約30kb的環(huán)狀dsDNA

◆兼性厭氧，生長需求非常簡單，在僅含碳水化合物和少量氮源及無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上即可生長◆主要寄生于大腸內(nèi)，約占腸道菌1%，正常棲居條件下不致病第四頁，共九十四頁。大腸桿菌水分

70%蛋白質(zhì)

15%碳水化合物3%RNA 6%DNA 1%礦物離子1%其他成分 4%第五頁，共九十四頁。Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)E.coli，廣泛存在于人和溫血動物腸道中，44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。最初認(rèn)為是非致病菌。20世紀(jì)中葉，認(rèn)識到一些特殊血清型E.coli對人和動物致病，引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥。根據(jù)不同生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌分為6類：腸致病性大腸桿菌（EPEC）腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）腸出血性大腸桿菌（EHEC）腸黏附性大腸桿菌（EAEC）彌散粘附性大腸桿菌（DAEC）大腸桿菌第六頁，共九十四頁。大腸桿菌在分子生物學(xué)中的應(yīng)用生物工程用菌株：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株系一般稱為“工程菌”。大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛最成功的首選高效表達(dá)體系；美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物?！锉尘扒宄喝蚪M測序，共有4405個ORF。遺傳背景清楚，并經(jīng)過一系列突變篩選，使外源DNA在胞內(nèi)不易發(fā)生重組或修飾，更適于基因操作?！锷锇踩荷锕こ逃镁晔窃诓粩嗪Y選后被挑選出的，在自然條件下無法生長，甚至普通的清潔劑都可以輕易殺滅。即便由于操作不慎導(dǎo)致活菌從實驗室流出，也可避免對自然界造成危害?！锞昊騼?yōu)化：生物工程用的菌株基因組都被優(yōu)化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆實驗。★操作簡便，表達(dá)量高：大腸桿菌操作和培養(yǎng)條件簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵。表達(dá)的外源基因蛋白量甚至可以達(dá)到細(xì)菌總蛋白的80%。

第七頁，共九十四頁。大腸桿菌在分子生物學(xué)實驗中的應(yīng)用缺點：★基因結(jié)構(gòu)差異：大多數(shù)真核基因含有內(nèi)含子，細(xì)菌中沒有除去內(nèi)含子機(jī)制，外源基因編碼區(qū)必須是連續(xù)的，刪除真核基因的內(nèi)含子和5’非編碼區(qū)原核：CDNA真核：DNA★轉(zhuǎn)錄信號不同：真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子不具有結(jié)合細(xì)菌核糖體所必須的SD序列細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子

SD序列（Shine-Dalgarnosequence）：細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游10個堿基處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16SrRNA3’端識別，結(jié)合原核生物核糖體，幫助從起始AUG處開始翻譯。

第八頁，共九十四頁。大腸桿菌在分子生物學(xué)實驗中的應(yīng)用

★

mRNA的分子結(jié)構(gòu)差異：絕大多數(shù)真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一個帽結(jié)構(gòu)。真核mRNA不能結(jié)合到細(xì)菌核糖上?！锶狈φ婧松锏鞍踪|(zhì)的修飾加工系統(tǒng)：表達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行糖基化、磷酸化修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)想折疊，因而蛋白質(zhì)沒有足夠的生物學(xué)活性（缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能）?！锎竽c桿菌中的表達(dá)不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，表達(dá)的蛋白經(jīng)常是不溶的，表達(dá)蛋白量超過菌體總蛋白10%時，容易形成包涵體。★細(xì)胞周質(zhì)中有種類繁多的內(nèi)毒素很難除去，細(xì)菌的蛋白酶可以識別降解真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。第九頁，共九十四頁。加拿大人FrederickBanting和CharlesBest于1921年首先發(fā)現(xiàn)胰島素，1922年開始用于臨床，1923年或諾貝爾獎。1965年9月17日，中國科學(xué)家第一個在實驗室中人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素。人的胰島素基因在大腸桿菌里指揮著大腸桿菌生產(chǎn)出了人的胰島素。隨著細(xì)菌的繁殖，胰島素基因也一代代傳了下去，后代的大腸桿菌也能生產(chǎn)胰島素。這種帶上了人工給予的新的遺傳性狀的細(xì)菌，被稱為基因工程菌。應(yīng)用實例胰島素由A、B兩個肽鏈組成。A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共51個氨基酸組成。其中A7-B7、A20-B19四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B鏈連接起來。A鏈中A6與A11之間也存在二硫鍵。

第十頁，共九十四頁。大腸桿菌的培養(yǎng)與保存

LB培養(yǎng)基是大腸桿菌最常用的培養(yǎng)基。其它培養(yǎng)基都是在此基礎(chǔ)上有所加減。LB一般被解釋為Luria-Bertani培養(yǎng)基，其發(fā)明人GiuseppeBertani認(rèn)為這個名字來源于英語的lysogenybroth，即溶菌肉湯。

酵母提取物：碳源，能源，磷酸鹽蛋白胨：氮源氯化鈉：無機(jī)鹽●液體LB培養(yǎng)基：每升含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，高壓滅菌15磅30分鐘?！窆腆wLB培養(yǎng)基：基本同上，加瓊脂15克/升。高壓滅菌后，冷卻至50℃左右，可根據(jù)需要加入適當(dāng)?shù)目咕鼗蚱渌噭?，混勻后倒入平皿中?！癜牍腆wLB培養(yǎng)基：基本同上，瓊脂濃度為6克/升。高壓后室溫保存?zhèn)溆?。使用前在水浴或微波爐溶化。常用培養(yǎng)基第十一頁，共九十四頁。▲準(zhǔn)備：取2-5毫升液體LB培養(yǎng)基，到無菌培養(yǎng)管中；▲挑菌：用接種環(huán)從培養(yǎng)板上挑取單個菌落，接種到培養(yǎng)基中。要先蘸取少許液體在管壁將菌落研磨開，再輕搖試管使細(xì)菌均勻分散到培養(yǎng)基中；▲培養(yǎng)：蓋上蓋子，保證通氣。37℃搖床60rpm，培養(yǎng)過夜;▲轉(zhuǎn)接:1:100轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)瓶中，通常250ml培養(yǎng)瓶中加培養(yǎng)液不超過100ml。37℃搖床（250rpm）培養(yǎng)，直至細(xì)菌生長到所需密度。大腸桿菌的培養(yǎng)與保存大腸桿菌的液體培養(yǎng)第十二頁，共九十四頁。將一定數(shù)量的細(xì)菌，接種于適宜的液體培養(yǎng)基中，在適溫下培養(yǎng)，定時取樣測數(shù)，以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，生長時間為橫坐標(biāo)，作出的曲線稱為生長曲線。該曲線表明細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下群體生長與繁殖的規(guī)律。一般分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個時期，各時期的長短同菌種本身特征、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不同而異。大腸桿菌生長曲線第十三頁，共九十四頁。

用接種環(huán)蘸取少許細(xì)菌培養(yǎng)液，或從固體培養(yǎng)平板的菌落上蘸取少許細(xì)菌，從平板的一側(cè)開始劃線；

消毒接種環(huán)，從剛劃過的部位帶過并在旁邊繼續(xù)劃線；

如上重復(fù)3～4次，直至劃滿平板。這樣可以確保分離出單個菌落。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)與保存第十四頁，共九十四頁?！鲈谛〔Ａ炕蛟嚬苤屑尤肴种w積的LB半固體培養(yǎng)基；■用接種針從固體培養(yǎng)板上挑取單個菌落，反復(fù)刺入瓊脂中；■置37℃培養(yǎng)8-12小時，直至可看到細(xì)菌生長呈霧狀；■擰緊蓋子，置15-22℃暗處保存。一般可保存數(shù)年；■復(fù)蘇時用接種環(huán)蘸取少許帶菌瓊脂，劃線到LB平板上。菌株的保存與復(fù)蘇穿刺保存第十五頁，共九十四頁。■取新鮮飽和的或生長到對數(shù)生長中期的細(xì)菌培養(yǎng)液，加入滅菌的甘油至終濃度15%（或7%DMSO），混合均勻?！龇盅b到凍存管中，保存在-70℃。如條件所限，亦可保存在-20℃，但保存時間較短?！鰪?fù)蘇時，用接種環(huán)從上面刮取少許菌液，注意要避免反復(fù)凍融。然后劃線到LB平板上。菌株的保存與復(fù)蘇冷凍保存第十六頁，共九十四頁。

質(zhì)粒（plasmid）是染色體以外能自主復(fù)制的遺傳因子

不具有胞外期

對寄主細(xì)胞來說是非必需的質(zhì)粒概述符合這三條標(biāo)準(zhǔn)的染色體外DNA或RNA分子都可以稱為質(zhì)粒。狹義的質(zhì)粒：一般是指細(xì)菌染色體外的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒的命名：一個小寫字母p加2-3個大寫字母和數(shù)字，如pBV220，pET30。第十七頁，共九十四頁。

質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：

SC型共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA）

OC型開環(huán)DNA（ocDNA）

L型線性DNA（LDNA）質(zhì)粒概述LSCOC第十八頁，共九十四頁。

常見質(zhì)粒種類：細(xì)菌質(zhì)粒真核生物DNA質(zhì)粒真核生物RNA質(zhì)粒質(zhì)粒概述第十九頁，共九十四頁。質(zhì)粒概述細(xì)菌質(zhì)粒定義：細(xì)菌染色體以外的共價閉合環(huán)狀DNA分子，能獨立于細(xì)胞核進(jìn)行自主復(fù)制。大?。?-1700kb之間。攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。功能：一些基因可產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。分類：根據(jù)質(zhì)?？刂频男誀睿梢园鸭?xì)菌質(zhì)粒分成抗性質(zhì)粒、降解質(zhì)粒、毒力質(zhì)粒、共生質(zhì)粒等類型。重組：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間均可發(fā)生存在范圍：如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis等第二十頁，共九十四頁。細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)：

1、可以在細(xì)胞質(zhì)中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；第二十一頁，共九十四頁。細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)：

2、質(zhì)粒是一種復(fù)制子（replicon），根據(jù)自我復(fù)制能力的不同，可把質(zhì)粒復(fù)制的控制形式分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種；嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受細(xì)胞核控制，與染色體DNA復(fù)制相伴隨，一般一個寄主細(xì)胞內(nèi)只有少數(shù)幾個（1-5）個拷貝；松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受細(xì)胞核控制，在染色體DNA復(fù)制停止的情況下仍可以進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量可以達(dá)到10-200個或更多。如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成，會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。嚴(yán)緊型松弛型第二十二頁，共九十四頁。細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)：3、可以通過轉(zhuǎn)化（直接吸收攝入）、轉(zhuǎn)導(dǎo)（噬菌體載體）或接合作用(通過細(xì)胞間緊密接觸而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)交換)由一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞，使兩個細(xì)胞都帶有質(zhì)粒；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時，可以單獨轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起轉(zhuǎn)移，所以可成為基因工程載體。第二十三頁，共九十四頁。細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)：4、質(zhì)粒的不親合性定義：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定共存。分子基礎(chǔ):主要是由于復(fù)制功能之間相互干擾造成。有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，受到同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，使兩種質(zhì)粒最終拷貝數(shù)不同，拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的分裂中更占優(yōu)勢。ColE1、pMB1;pSC101、F、RP4；p15A,衍生質(zhì)粒第二十四頁，共九十四頁。細(xì)菌質(zhì)粒性質(zhì)：

5、質(zhì)粒對于細(xì)菌的生長不是必須的第二十五頁，共九十四頁。代表性細(xì)菌質(zhì)粒（1）F因子，又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，環(huán)狀雙鏈DNA，編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。存在于腸細(xì)菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細(xì)菌中，決定性別。F質(zhì)粒的整個基因組結(jié)構(gòu)由三個主要區(qū)段組成：（1）轉(zhuǎn)移區(qū)（2）復(fù)制區(qū)（3）重組區(qū)，通過和宿主染色體上的IS同源重組或通過轉(zhuǎn)座，F(xiàn)因子可以整合到宿主不同位點上。由于宿主染色體上IS方向不同，所以整合的方向也隨之不同。F因子（fertilityfactor）第二十六頁，共九十四頁。根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)有無F質(zhì)粒及其在細(xì)胞內(nèi)存在狀態(tài)可將細(xì)胞分為四種類型：●

F+菌株：F因子獨立存在，細(xì)胞表面有性菌毛，為帶有F質(zhì)粒的雄性細(xì)胞●F-菌株：無F因子，無性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）?！?/p>

Hfr菌株(高頻重組菌株)：F因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛●

F′菌株：F質(zhì)粒從Hfr菌染色體上脫落時，會出現(xiàn)一定概率的錯誤，使F質(zhì)粒帶上宿主染色體，這種特殊的F質(zhì)粒稱為F′質(zhì)粒。代表性細(xì)菌質(zhì)粒（1）第二十七頁，共九十四頁。代表性細(xì)菌質(zhì)粒（2）：R因子（resistance），抗藥因子，帶R因子的細(xì)菌有大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、綠膿桿菌等G-菌，60-90%的G-菌耐藥性由R因子轉(zhuǎn)移。

R因子是細(xì)胞質(zhì)粒，使寄主菌對鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等抗菌素或磺胺劑產(chǎn)生抗藥性的基因群。和F因子一樣，通過接合進(jìn)行轉(zhuǎn)移，獲得該因子的細(xì)菌獲得對多種藥劑的抗性，給治療帶來很大麻煩。環(huán)狀dsDNA，包括抗性轉(zhuǎn)移因子和抗性決定因子，R因子在細(xì)胞內(nèi)的copy數(shù)從1-2個到幾十個，分為嚴(yán)緊型和松弛型，經(jīng)氯霉素處理，松弛型質(zhì)?？蛇_(dá)2000-3000個/細(xì)胞。R因子（resistencefactor）第二十八頁，共九十四頁。代表性細(xì)菌質(zhì)粒（3）：Col因子，產(chǎn)大腸桿菌素因子，編碼合成大腸桿菌素,通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝而專一性地殺死不含Col因子的其他腸道細(xì)菌。Col因子可分為兩類：ColE1：無接合作用，松弛型多copy；用于重組DNA研究和體外復(fù)制系統(tǒng)。ColIb：與F因子相似，通過接合作用轉(zhuǎn)移，嚴(yán)緊型控制，只有1-2個copy。Col因子（colicinogenicfactor）第二十九頁，共九十四頁。真核生物DNA質(zhì)粒環(huán)狀DNA質(zhì)粒：酵母質(zhì)粒，植物線粒體中的環(huán)狀DNA質(zhì)粒，人和動物的核DNA質(zhì)粒等，都是不知其功能的隱蔽質(zhì)粒。線狀DNA質(zhì)粒：乳酸克魯維酵母的嗜殺線狀DNA質(zhì)粒，植物線粒體中與雄性不育有關(guān)的線狀DNA質(zhì)粒。真核生物RNA質(zhì)粒有殼體的dsRNA質(zhì)粒：由蛋白質(zhì)殼體包裹，存在于某些真菌和植物細(xì)胞中，由于它們酷似病毒，所以也常被稱作真菌病毒和植物隱蔽病毒，或稱類病毒顆粒，典型代表是釀酒酵母的嗜殺dsRNA質(zhì)粒。與RNA病毒的主要區(qū)別是它們不具有感染性．無殼體的dsRNA質(zhì)粒：存在于脂質(zhì)小囊中的栗疫菌減毒dsRNA質(zhì)粒，玉米線粒體中與雄性不育有關(guān)的dsRNA質(zhì)粒。

第三十頁，共九十四頁。把目的基因通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。基因工程所用的vector實際上是DNA分子，攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA。

作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。分子生物學(xué)實驗中常用質(zhì)粒載體第三十一頁，共九十四頁。多克隆位點是含有多個內(nèi)切酶識別位點的一段DNA序列，便于外源DNA片段的插入，而且不會影響質(zhì)粒本身的穩(wěn)定。復(fù)制子是含有DNA復(fù)制起始位點的一段DNA序列，也包括復(fù)制必需的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。復(fù)制子決定質(zhì)粒復(fù)制是嚴(yán)緊型還是松弛型。原核生物DNA有一個ori，真核生物DNA有多個ori。選擇標(biāo)記通常為抗生素耐藥基因，如Amp+，Kan+抗性基因；或產(chǎn)生易于辨認(rèn)的顏色，如半乳糖苷酶、熒光素酶等基因。第三十二頁，共九十四頁?！舭垂δ芊殖桑海?）克隆載體：都有一個松弛的復(fù)制子，能帶動外源基因，在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。它是用來克隆和擴(kuò)增DNA片段（基因）的載體。（2）表達(dá)載體：具有克隆載體的基本元件（如ori，Ampr，Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。

在大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白的表達(dá)載體

要含有適當(dāng)?shù)脑藛幼樱D(zhuǎn)錄終止信號。

在真核細(xì)胞生產(chǎn)外源蛋白的表達(dá)載體

除含有適當(dāng)?shù)恼婧藛幼?，轉(zhuǎn)錄終止信號外，還應(yīng)含有內(nèi)含子剪切序列和polyA加尾信號。載體分類第三十三頁，共九十四頁。載體分類◆按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分：（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體（shuttlevector）指在兩種宿主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子，要含有不同系統(tǒng)可識別的復(fù)制起點，因而可以運(yùn)載目的基因。

第三十四頁，共九十四頁。質(zhì)粒載體的選擇◆構(gòu)建重組DNA的目的：克隆擴(kuò)增：選擇合適的克隆載體pGEM-T,pBluescript蛋白表達(dá)：原核細(xì)胞表達(dá)載體如pBV220,pET等；真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3,pSV2等。研究基因功能：overexpression,knockdown,knockout基因治療：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體◆載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力：理想的克隆質(zhì)粒本身要盡可能小，這樣轉(zhuǎn)化效率較高，同時質(zhì)粒的容量較大，可以插入較大的DNA片段。（2）表達(dá)載體受體細(xì)胞類型：原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。

◆注意事項：

載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，目的基因與載體應(yīng)易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。第三十五頁，共九十四頁。質(zhì)粒載體的選擇

選用質(zhì)粒做載體的4點要求：

①選分子量小的質(zhì)粒，小載體不易損壞，在細(xì)菌里拷貝數(shù)多；②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束；③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。第三十六頁，共九十四頁。常見質(zhì)粒1：pBR322優(yōu)點：1、具有較小的分子量；分子量為4363bp，克隆載體的分子量大小不要超過10kb。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。有24種內(nèi)切酶單一酶切識別位點

其中7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點。3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增之后每個細(xì)胞中可積累1000-3000個拷貝（氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成,阻止細(xì)胞染色體復(fù)制,而質(zhì)粒本身復(fù)制不受影響,增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)）?！癙”表示是一種質(zhì)粒“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和”“322”表示實驗編號第三十七頁，共九十四頁。Example:在pBR322質(zhì)粒的BamHⅠ或SalⅠ位點插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌。涂布在含青霉素的選擇培養(yǎng)基上，可生長涂布于含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基上，不能生長。第三十八頁，共九十四頁。常見質(zhì)粒2：pGEM-T藍(lán)白斑篩選原理：LacZ基因編碼-半乳糖苷酶，催化乳糖水解載體帶有LacZ基因的調(diào)控序列和N端146個氨基酸的編碼信息，編碼-互補(bǔ)肽宿主編碼的-半乳糖苷酶C端當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然各自都沒有酶活性，但它們可融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)，稱這種現(xiàn)象為-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生-半乳糖苷酶可使底物X-Gal產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的MCS后，導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的N端片段，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，細(xì)菌形成白色菌落。-互補(bǔ)第三十九頁，共九十四頁。

α互補(bǔ)的檢測PUC18/19由pBR322和M13噬菌體改造第四十頁，共九十四頁。常用表達(dá)質(zhì)粒：第四十一頁，共九十四頁。質(zhì)粒DNA的分離與純化

1、氯化銫密度梯度離心法

2、堿變性法

3、微量堿變性法

第四十二頁，共九十四頁。1.氯化銫密度梯度離心法原理

◆質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；

◆在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；

◆染色劑溴化乙錠（EB，吖啶類染料）能摻入到DNA鏈的堿基中，使DNA體積增大，浮力密度變小。EB容易插入線狀的DNA，而與環(huán)狀質(zhì)粒DNA的結(jié)合量小于線狀DNA，使浮力密度出現(xiàn)懸殊的差別；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會越低。第四十三頁，共九十四頁。離心流程

◆離心收集菌體，加入溶菌酶或SDS，促進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞裂解，離心收集含質(zhì)粒DNA的上清。

◆將EB的CsCl溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會嵌入到DNA鏈堿基中。

◆EB達(dá)到飽和時，CsCl密度梯度離心。第四十四頁，共九十四頁。2.堿變性法原理：原理：cccDNA與線性染色體DNA片斷之間，拓?fù)鋵W(xué)上存在差異

◆在pH12.0～12.5范圍內(nèi)：

線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性；共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。

◆恢復(fù)pH值中性時：

共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。

線性染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不迅速準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^離心，去除線性染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。第四十五頁，共九十四頁。第四十六頁，共九十四頁。挑取單個菌落接種到5ml含適當(dāng)抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1min，棄上清，沉淀懸浮于150μl溶液Ⅰ（500mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0）冰浴5分鐘；此步驟菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊，否則會降低抽提得率。

加入新配置的200μl溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH，1%SDS），混勻，冰浴10分鐘。這一步操作要注意兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。加入150μl溶液Ⅲ（3mol/L乙酸鉀，pH4.8），冰浴5分鐘；堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，否則最后得到的質(zhì)粒上會有大量的基因組DNA污染。

12000rpm離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管；加入等體積酚/氯仿抽提一次；轉(zhuǎn)移上層水相至新的離心管；等體積氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃沉淀30分鐘；12000rpm離心5分鐘。70%乙醇洗滌沉淀一次；干燥后加入50μl含RNA酶（20ug/ml）的TE（10mmol/LTris-HCL，1mmol/LEDTA，pH8.0），37℃水浴30分鐘。-20℃保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒的小量提取堿裂解法第四十七頁，共九十四頁。

自Qiagen公司推出快速小量提取質(zhì)粒DNA試劑盒以來，很多公司都開發(fā)出類似產(chǎn)品，其原理及實驗步驟大同小異。具體步驟如下(天為時代)：挑取單菌落接種于5ml含適當(dāng)抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；取1.5ml菌液加入Eppendorf管中，13000rpm離心1min，棄上清，加入250ul

S1Buffer,最大速度旋渦震蕩；加入250ulS2Buffer，輕輕顛倒混勻4-6次；加入350ulS3Buffer，立即迅速顛倒混勻，可見白色絮狀沉淀；將上清加入純化柱中，5000rpm離心10min；棄去收集管中液體，加入500ul除蛋白液PDBuffer，13000rpm離心1min；棄去收集管中液體；加入700ulPEBuffer，13000rpm離心1min；棄去收集管中液體；加入500ulPEBuffer，13000rpm離心1min；棄去收集管中液體；13000rpm離心3min，以徹底去除乙醇；將柱子放到一只干凈的1.5mlEppendorf管中，加入50μlddH2O；靜止放置2min,13000rpm離心1min,收集離心液，-20℃保存。

質(zhì)粒的小量提取堿裂解法（試劑盒）第四十八頁，共九十四頁。挑取單菌落接種5毫升含適當(dāng)抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接200ml含同樣抗菌素的LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)12-16小時，細(xì)菌密度(OD600nm)達(dá)到1.0；5000rpm離心15分鐘，棄上清；重懸細(xì)菌于100ml冰預(yù)冷STE（0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）。5000rpm離心15分鐘，棄上清；加10ml溶液1（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0）重懸，混勻，冰浴10分鐘；加入20ml新配置的溶液2（0.2mol/LNaOH,1%SDS），混勻，冰浴10分鐘；加入15ml預(yù)冷的溶液3（3.0mol/LKCl，pH4.8），混勻，冰浴10分鐘；10000rpm離心15分鐘，棄沉淀；加入等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃沉淀1小時；10000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥；用3mlTE（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）溶解沉淀；加入3ml冰預(yù)冷的5mol/LLiCl溶液，充分混勻，10000rpm離心15分鐘，棄沉淀；上清中加入等體積冰預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，10000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀置室溫干燥；500μl含RNA酶（20ug/ml）TE（10mmol/LEDTA，pH8.0）溶解沉淀，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，室溫放置30分鐘；加入500μl含13%聚乙二醇8000的1.6mol/LNaCl，充分混勻，-20℃沉淀2小時；于臺式離心機(jī)上12000rpm離心10分鐘，棄上清；加入400μlTE（pH8.0）溶解沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；轉(zhuǎn)移水相至新的Eppendorf管，加100μl10M乙酸銨，充分混勻；加2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀1小時；12000rpm離心10分。用冰預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀一次，晾干；50μlTE（pH8.0）溶解沉淀，儲存于-20℃冰箱。質(zhì)粒的大量提取聚乙二醇沉淀法

第四十九頁，共九十四頁。分子克隆步驟第五十頁，共九十四頁。轉(zhuǎn)化（transformation）◆重組分子導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞的過程就是轉(zhuǎn)化。

◆宿主細(xì)胞也稱為受體細(xì)胞，分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩類?！粼思?xì)胞以大腸桿菌為主，真核細(xì)胞包括酵母及動物細(xì)胞等。◆在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程。通過宿主細(xì)胞的復(fù)制而使目的基因得到大量的擴(kuò)增。

第五十一頁，共九十四頁。轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細(xì)胞★目前常用的原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法有兩類：電穿孔轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法★電穿孔轉(zhuǎn)化法屬于物理方法，但由于受到儀器的限制，實驗室更常用的是化學(xué)轉(zhuǎn)化法?！锘瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法原理：（1）低溫（0℃）和CaCl2低滲溶液處理，使宿主細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)，即感受態(tài)。菌體膨脹成球形，細(xì)胞壁和膜通透性增強(qiáng)。（2）DNA與Ca2+形成的羥基-磷酸鈣復(fù)合物黏附于菌體表面，42℃短暫熱沖擊處理（熱休克）后，黏附表面的重組DNA被吸收進(jìn)入宿主細(xì)胞。（3）在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長1小時左右，細(xì)胞形態(tài)復(fù)原，進(jìn)入增殖分裂期。第五十二頁，共九十四頁。挑取單菌落，接種無抗菌素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日按1：100轉(zhuǎn)種新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)搖床培養(yǎng)2小時左右，至菌液OD600nm值為時停止培養(yǎng)。置冰上預(yù)冷10分鐘，然后4℃、5000rpm離心10分鐘，棄上清；以10ml冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸細(xì)胞，放置于冰浴中20分鐘；4℃、5000rpm離心10min，棄上清；按每50ml培養(yǎng)物加入2ml冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2的比例重懸細(xì)胞沉淀，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，然后分裝于Eppendorf管中，-70℃低溫冰箱中保存。感受態(tài)宿主菌的制備氯化鈣法

第五十三頁，共九十四頁。

1．前夜接種受體菌（DH5、DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜；

2．取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6；

3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作；

4．吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6．棄去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮；

7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

8．棄去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；

9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘10．加入20l冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸?。?1．立即使用或迅速置于-70oC超低溫保存。感受態(tài)宿主菌的制備電轉(zhuǎn)化法

第五十四頁，共九十四頁。感受態(tài)宿主菌的制備注意事項

1．細(xì)菌的生長狀態(tài)：實驗中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細(xì)胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；3．經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24小時達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）；4．化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必須干凈。去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；第五十五頁，共九十四頁?！?/p>

取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液(化凍后馬上進(jìn)行下面的操作)，加入適量質(zhì)粒DNA?！褫p輕搖勻，冰上放置30min[（1）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝；（2）有助于DNA-Ca2+吸附于細(xì)胞表面；（3）防止DNAase降解DNA]，42℃水浴中保溫1-2min[使細(xì)胞攝入吸附于其表面的DNA]，然后迅速冰上冷卻2min。立即向管中分別加入0.4mlLB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約60min，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)?！衽囵B(yǎng)液0.1ml，接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻?！窬和耆慌囵B(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)，對于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來說，此時應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落。轉(zhuǎn)化步驟第五十六頁，共九十四頁。轉(zhuǎn)化結(jié)果分析第五十七頁，共九十四頁。噬菌體第五十八頁，共九十四頁。噬菌體概述第五十九頁，共九十四頁。噬菌體概述噬菌體：感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒總稱結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型線狀體型核酸類型：雙鏈線性DNA雙鏈環(huán)形DNA單鏈環(huán)形DNA單鏈線形DNA雙鏈RNA單鏈RNA第六十頁，共九十四頁。第六十一頁，共九十四頁。分子量：不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異比較大大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜，對寄主的依賴性較低堿基組成：有些噬菌體的DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的A/T/C/G組成的T4噬菌體DNA沒有C，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）SP01噬菌體DNA中沒有T，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）噬菌體概述第六十二頁，共九十四頁。噬菌體的一般生物特性

可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。除了對寄主的依賴性，還可保護(hù)自己的核苷酸分子（DNA/RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞第六十三頁，共九十四頁。λ噬菌體：基因組長尾噬菌體科，溫和噬菌體◆一般結(jié)構(gòu)：48,502bp，線狀dsDNA?！?/p>

46個基因，分為四類：調(diào)控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ，決定進(jìn)入溶源化或裂解狀態(tài)DNA復(fù)制：O、P、Qλ重組：int、xis、redβ和gam噬菌體顆粒形成與細(xì)胞裂解：頭(A-F)、尾(E-J)、S&R（細(xì)胞裂解）、λ中部約1/3的DNA(b2)與λ存活無關(guān)。第六十四頁，共九十四頁。

線狀ds-DNA兩端具有12nt5’-突起，稱為cos位點，被λ編碼的末端酶所識別，通過粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈環(huán)形DNA。第六十五頁，共九十四頁。DNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp第六十六頁，共九十四頁。

溶菌階段(復(fù)制和釋放)λ噬菌體溶源階段溶源性（lysogeny）：λ噬菌體在大腸桿菌體內(nèi)可以呈環(huán)行分子存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可通過整合酶的作用而整合到寄主染色體上成為原噬菌體狀態(tài)，并與寄主染色體一起復(fù)制并隨細(xì)菌的分裂而傳代，這種現(xiàn)象稱為λ噬菌體的溶源性。只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。在某種刺激下會從宿主DNA中剪接出來，利用宿主細(xì)胞內(nèi)的酶系和蛋白進(jìn)行自我復(fù)制，產(chǎn)生許多子代噬菌體，裂解并從宿主細(xì)胞中釋放的過程稱裂解性循環(huán)。第六十七頁，共九十四頁。

λ噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理：野生型λ噬菌體不適于做載體：（1）λ噬菌體基因組大，有多個常用的核酸內(nèi)切酶的識別位點。（2）λ噬菌體有包裝限制，λ頭部只能容納自身DNA的78-105%，即39-52.5Kb的DNA分子，天然λ僅可插入3Kb外源DNA。對野生型λ噬菌體的改造：（1）除去λ噬菌體DNA中的限制性識別位點，在非必須區(qū)引入合適的限制酶位點。（2）除去λ噬菌體DNA的非必須區(qū)段。（3）引入適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記。第六十八頁，共九十四頁。λ噬菌體載體Lyticphase(Replicateandrelease)Lysogenic

phase(integrateintohostgenome)第六十九頁，共九十四頁?！瘭耸删w載體的優(yōu)點：◆λ噬菌體DNA體外重組后，先要在體外包裝成噬菌體顆粒，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。感染方式導(dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106-108/μgDNA，轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入的頻率僅為103-105/μgDNA?！粞b載外源能力為25kb，大于質(zhì)?！艉Y選方便◆重組λ-DNA分子提取容易●

用途克隆載體；構(gòu)建基因組或cDNA文庫；構(gòu)建抗體庫或隨機(jī)肽庫λ噬菌體載體第七十頁，共九十四頁。

λ噬菌體載體的主要類型

1.插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點，克隆容量較小，一般在10kb以內(nèi)，用于cDNA及小片段DNA的克隆。

2.替換型載體（取代型載體）具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代?？寺∪萘枯^大，一般在20kb左右，常用于構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫。第七十一頁，共九十四頁。插入式載體

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。

若不插入外源基因溶源混濁斑若CI插入外源基因溶菌透明噬斑

cIEcoR

I

LA32.7RA10.6

λgt10第七十二頁，共九十四頁。

lacZLA19.9RA21.9EcoRI

Charon

16A插入式載體LacZ基因插入失活：charon16A載體，非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

第七十三頁，共九十四頁。外源DNA取代噬菌體中對于噬菌體感染和復(fù)制非必要的片段(小于20kb)高感染效率(109轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA,比質(zhì)粒高100倍)替換型載體（取代型載體）第七十四頁，共九十四頁。替換型載體克隆外源DNA的步驟1.應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2.將上述所得的λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3.對重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體第七十五頁，共九十四頁。λ噬菌體的空斑試驗培養(yǎng)基λ肉湯培養(yǎng)基：每升含胰蛋白胨10克，氯化鈉2.5克，高壓滅菌15磅30分鐘；λ肉湯平板：基本同上，每升加瓊脂10克；λ頂層培養(yǎng)基：基本同上，每升加瓊脂7克。高壓后室溫保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们霸谒』蛭⒉t溶化，然后冷卻至45-50℃，并維持在該溫度，可保持溶化狀態(tài)。第七十六頁，共九十四頁。λ噬菌體的空斑試驗步驟1、在含2%麥芽糖和10mmol/L硫酸鎂的λ肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌至飽和。在微波爐或沸水浴中溶化頂層瓊脂培養(yǎng)基，冷卻并維持在45-50℃水浴。2、取5個小試管，每管加入0.3毫升大腸桿菌培養(yǎng)液。將噬菌體溶菌液在λ肉湯培養(yǎng)基中1：1000連續(xù)稀釋，然后每個稀釋度取0.1毫升分別加到含0.3毫升大腸桿菌的試管中，與大腸桿菌培養(yǎng)液混勻，在室溫孵育20分鐘。3、將上述試管移到37℃水浴中保溫10分鐘。4、每管中加入2.5毫升頂層培養(yǎng)基，輕搖混合，然后小心地倒在λ肉湯平板上。輕輕地傾斜平板使頂層瓊脂均勻地鋪到整個平板。整個過程要避免產(chǎn)生氣泡。5、置37℃孵箱培養(yǎng)。一般6-8小時即可看到噬斑，12小時后即可清楚地計數(shù)和挑選噬斑。第七十七頁，共九十四頁。λ噬菌體的空斑試驗制備噬菌體裂解液1、可用毛細(xì)吸管或牙簽從上述噬菌體平板上挑取單個噬斑，置0.4毫升λ肉湯培養(yǎng)基中，放振蕩器上劇烈振蕩以釋放出噬菌體；2、取0.1毫升噬菌體，與0.1毫升過夜培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)液和0.1毫升鈣鎂溶液（10mmol/LMgCl2,10mmol/LCaCl2）混合，置37℃水浴孵育15分鐘。然后轉(zhuǎn)移到50毫升NZC肉湯培養(yǎng)基（每升含NZ胺A10克，氯化鈉5克，MgCl2.6H2O2克），置37℃搖床培養(yǎng)。一般6-8小時會出現(xiàn)裂解，一旦培養(yǎng)液變清亮，就立即收獲。3、加幾滴氯仿裂解仍存在的菌體。將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，于4℃離心10,000r/min(12000g)10分鐘以去除細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移到干凈管中，加幾滴氯仿，混勻后放4℃保存。第七十八頁，共九十四頁。λ噬菌體的空斑試驗提取噬菌體DNA酚/氯仿抽提1、加等體積的飽和酚至噬菌體液中，溫和地攪拌或振搖20分鐘。離心5000r/min10分鐘。將上清移到新的管中，再加等體積飽和酚混合。共抽提三次。2、加入1/10體積的5mol/LNaCl，2倍體積的無水乙醇（或0.6體積的異丙醇），室溫放置20分鐘。3、離心1,500g15分鐘，棄上清。將沉淀用70%乙醇洗1-2次。低溫干燥。4、重溶于TE緩沖液中。甲酰胺抽提（更快捷溫和）1、加1/10體積的2mol/LTris.Cl(pH8.5)/0.2mol/LEDTA,混勻后加入等體積的甲酰胺，混勻，室溫放置30分鐘。2、加兩倍體積的無水乙醇。室溫放置20分鐘。3、離心1,500g15分鐘，棄上清。將沉淀用70%乙醇洗1-2次。低溫干燥。4、重溶于TE緩沖液中。第七十九頁，共九十四頁。M13噬菌體

M13是一種含ssDNA的絲狀噬菌體，感染含F(xiàn)因子的大腸桿菌。感染宿主后不裂解細(xì)菌細(xì)胞，只利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)完成自身增殖，組裝成完整病毒顆粒后被宿主細(xì)胞分泌而出，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長分裂。為分子生物學(xué)中理想的質(zhì)粒載體。

第八十頁，共九十四頁。M13噬菌體基因組為6.4kb，90%以上序列編碼蛋白質(zhì)，11個編碼基因，基因之間間隔區(qū)多為幾個堿基。較大間隔位于基因Ⅷ和Ⅲ以及基因Ⅱ和Ⅳ之間，有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和DNA合成的元件。DNA為正鏈，按基因Ⅱ至Ⅳ方向合成。編碼3類蛋白質(zhì):復(fù)制蛋白（Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ）形態(tài)發(fā)生蛋白（Ⅰ，Ⅳ、Ⅺ）結(jié)構(gòu)蛋白（Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ）第八十一頁，共九十四頁。M13單鏈DNA噬菌體的生命周期成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細(xì)胞，因為這種噬菌體的感染位點在性散毛上。但是無論是RFDNA或ssDNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細(xì)胞。M13噬菌體特點（1）第八十二頁，共九十四頁。RF

DNA感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會形成雙鏈復(fù)制型ＤＮＡ，可以象質(zhì)粒ＤＮＡ那樣在體外進(jìn)行純化和操作。M13噬菌體特點（2）第八十三頁，共九十四頁。M13噬菌體特點（3）單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的制約的，不存在包裝限制問題，能包裝6倍基因組長的DNA分子，這一點正好與λ噬菌體相反。第八十四頁，共九十四頁。以M13噬菌體構(gòu)建出一系列含有單鏈?zhǔn)删w（M13）復(fù)制起點的質(zhì)粒載體

優(yōu)點

1、LacZ片段，密集MCS；

2、成對構(gòu)建，定向地克隆

3、無包裝限制，克隆能力大

4、Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇

缺點

1、插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降

2、實際克隆能力小于1500bp（雖無包裝限制，并非無限包裝）

應(yīng)用

DNA測序、基因的定點突變、異源雙鏈DNA的分析等。

第八十五頁，共九十四頁。第八十六頁，共九十四頁。第八十七頁，共九十四頁。載體的種類和特征