Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑

Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑簡介：夕卜源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、顯微注射法等。LeageneLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（LipofectTransfectionReagent是一種新型的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，適用于把質(zhì)粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸以及核酸蛋白復(fù)合物或帶負(fù)電荷的蛋白轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中。LeageneLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對于常見的哺乳動物細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率，較好的重復(fù)性，且操作簡以及單細(xì)胞毒性較小，可用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑使用方法與Lipofectamine?2000Reagent極為相似。該轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，基本不受細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清和抗生素的影響，即可以在血清和抗生素存在的情況下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。但為了取得最佳的轉(zhuǎn)染效果，推薦轉(zhuǎn)染時使用不含抗生素的含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。組成：名稱編號CZ0002CZ0002CZ0002StorageLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑0.5ml1ml5x1ml4°C使用說明書1份自備料：1、 胰蛋白酶消化液2、 完全培養(yǎng)液和不完全培養(yǎng)液3、 PBS操作步驟（僅供參考）:（-）DNA轉(zhuǎn)染：1、 （以12孔板為例）在轉(zhuǎn)染前18~24h用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至12孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按12孔板計算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，請按比例自行調(diào)節(jié)用量。2、 在加入待轉(zhuǎn)染的DNA之前2~4h,加入不含抗生素的完全培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養(yǎng)液，但抗生素使某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性。3、 配制轉(zhuǎn)染工作液：取兩個無菌離心管，分別加入不含抗生素和血清的培養(yǎng)液，取其中一

離心管加入DNA，輕輕混勻；取另一離心管加入Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。室溫靜置，將含有DNA的培養(yǎng)液用微量移液器輕輕加入含Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置。4將上述轉(zhuǎn)染工作液逐滴滴入對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。5、 培養(yǎng)后，更換為含有血清的完全培養(yǎng)液。對于Hela細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染4h更換培養(yǎng)液;

對于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染6h更換培養(yǎng)液。6、 繼續(xù)培養(yǎng)24~48h后，觀察或收集細(xì)胞或加入適當(dāng)?shù)暮Y選藥物如G418等進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。不同細(xì)胞器皿轉(zhuǎn)染時培養(yǎng)液、DNA、Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用■表96-well24-well12-well6-well6cmdish10cmdish鋪板培養(yǎng)液0.15ml0.5ml1ml2ml5ml10ml無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plDNA0.2pg0.8pg1.6pg4pg8pg24pg無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑0.5pl2pl4pl10pl20pl60pl注意：對于12孔板中一個孔的細(xì)胞,Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的用量可以在3?10pl范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，DNA用量建議在1.6pg，旦也可在1?4pg范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。通常DNA用量(pg)和Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(pl)用量比例為1:2?3，如有必要可在1:0.5?5的范圍內(nèi)優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。為了獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果，不同的細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件有所不同，可在上述推薦范圍內(nèi)自行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。(二)siRNA轉(zhuǎn)染：1、 (以12孔板為例)在轉(zhuǎn)染前18~24h用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量對數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至12孔板中，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，寺細(xì)胞密度達(dá)到即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。后續(xù)操作步驟均按12孔板計算，如果轉(zhuǎn)染器皿不同，青按比例自行調(diào)節(jié)用量。2、 在加入待轉(zhuǎn)染的siRNA之前2~4h,加入不含抗生素的完全培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。也可使用含有血清并含有抗生素的新鮮培養(yǎng)液，旦抗生素使某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性。3、 配制轉(zhuǎn)染工作液：取兩個無菌離心管，分別加入5不含抗生素和血清的培養(yǎng)液，取其中一離心管加入siRNA，輕輕混勻；取另一離心管加入Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。室溫靜置，將含有siRNA的培養(yǎng)液用微量移液器輕輕加入含Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，室溫靜置。4、 將上述轉(zhuǎn)染工作液逐滴滴入對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。5、 培養(yǎng)4~6h后，更換為含有血清的完全培養(yǎng)液。對于Hela細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染4h更換

培養(yǎng)液；對于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT細(xì)胞，推薦在轉(zhuǎn)染6h更換培養(yǎng)液。6、繼續(xù)培養(yǎng)后，觀察或收集細(xì)胞。不同細(xì)胞器皿轉(zhuǎn)染時培養(yǎng)液、siRNA、Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用量表96-well24-well12-well6-well6cmdish10cmdish鋪板培養(yǎng)液0.15ml0.5ml1ml2ml5ml10ml無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plsiRNA5pmol20pmol40pmol100pmol200pmol600pmol無血清培養(yǎng)液15pl25pl50pl100pl200pl500plLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑0.25pl1pl2pl5pl10pl30pl注意：對于12孔板中一個孔的細(xì)胞，Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的用量可以在1?4pl范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，siRNA用量建議在范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。通常siRNA用量(pmol)和Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(pl)的用量比例適量，如有必要可在10?40:1范圍內(nèi)優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。為了獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果，不同的細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件有所不同，可以在上述推薦范圍內(nèi)自行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。siRNA的推薦濃度，常用的濃度范圍為。對于多個孔轉(zhuǎn)染相同數(shù)量相同質(zhì)粒的情況可以把每個孔所需的Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混合物分別配制，然后一起混合在同一個離心管內(nèi)，后續(xù)混勻并孵育后，按照推薦用量滴加到細(xì)胞培養(yǎng)器皿內(nèi)。對于其它培養(yǎng)板或培養(yǎng)器皿，各種試劑的用量可以按照細(xì)胞培養(yǎng)器皿的培養(yǎng)面積按比例進(jìn)行換算。如果轉(zhuǎn)染寡核苷酸或RNA等可以參考轉(zhuǎn)染DNA的條件進(jìn)行。注意事項：1、 注意無菌操作，盡量避免污染，2、 使用高純度DNA或RNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，同時DNA不應(yīng)含有蛋白和酚。3、 影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，如細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)及密度、DNA/siRNA轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染試劑與DNA/siRNA比例等，應(yīng)該在具體實踐中優(yōu)化來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。4、 為了取得較高的轉(zhuǎn)染效率，推薦使用在50代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)。5、 為了取得較高的轉(zhuǎn)染效率，推薦使用高純度的質(zhì)粒，OD260/OD280>1.8o6、 Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不應(yīng)Vortex或離心，宜緩慢晃動混勻。7、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。有效期：12個月有效