I 第二章 核酸化學(xué)

生物化學(xué)Biochemistry

第二章核酸化學(xué)NucleicAcidChemistry核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。核酸概述

第一節(jié)核酸的種類、分布和功能第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的復(fù)合體核蛋白體第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)第五節(jié)核酸的分離純化及含量測(cè)定二、核酸的種類和分布

核酸分為兩大類：DNA(脫氧核糖核酸,DeoxyribonucleicAcid)RNA(核糖核酸,RibonucleicAcid)

動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞RNA：主要存在于細(xì)胞質(zhì)中（tRNA,rRNA,mRNA)，一些特殊功能的RNA也存在于細(xì)胞核中（核酶，siRNA)

第一節(jié)核酸的種類、分布和功能98％核中（染色體中）真核線粒體（mDNA）核外葉綠體（ctDNA）DNA擬核原核質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒核素：1868年，F(xiàn)ridirch.Miescher從細(xì)胞核中分離得到一種含磷量很高的酸性物質(zhì)。二、核酸的生物學(xué)功能——遺傳物質(zhì)的載體1885—1900年間，Kossel、Feulgen、Levine證實(shí)核酸由不同的堿基組成。其最簡(jiǎn)單的單體結(jié)構(gòu)是堿基-核糖-磷酸構(gòu)成的核苷酸。1929年又確定了核酸有兩種，一種是脫氧核糖核酸(DNA)，另一種是核糖核酸(RNA)。1928年，Griffith肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化1944年，Avery在離體條件下完成轉(zhuǎn)化-表明DNA是細(xì)菌的轉(zhuǎn)化因子-首次證明了DNA是遺傳物質(zhì)RNA也是遺傳物質(zhì)-1956年A.Gierer和G.Schraman發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（tobaccomosaicvirus,TMV）的遺傳物質(zhì)是RNA。-1957年美國(guó)的HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre用重建實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一結(jié)論。TMV的結(jié)構(gòu)圖三、核酸的化學(xué)組成

核酸是一種線形多聚核苷酸(polynucleotide),其基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸(nucleotide)。戊糖堿基

磷酸核苷核苷酸核酸

水解

組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。(一)核酸中的戊糖RiboseDeoxyribose（二）堿基核酸中的堿基分兩類：嘌呤和嘧啶1、嘌呤堿(purine)：由嘌呤衍生而來。2、嘧啶堿(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物。

3、稀有堿基：

一些修飾堿基，因含量甚少而稱之。大多為甲基化堿基，多在tRNA中。（三）核苷（nucleoside）核苷戊糖與堿基縮合而成，并以糖苷鍵相連接。糖與堿基之間的C-N鍵，稱為N-糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)戊糖+嘧啶（N1-C1

糖苷鍵）戊糖+嘌呤（N9-C1

糖苷鍵）核苷的表示：核苷：A、G、C、U脫氧核苷：dA,dG,dC,dT修飾核苷：如5-甲基胞嘧啶：m5dC。腺苷鳥苷尿苷胞苷（四）核苷酸（nucleotide）核苷中戊糖的羥基被磷酸酯化，即為核苷酸。PPPPPPPP常見（脫氧）核苷酸的結(jié)構(gòu)和命名鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）腺嘌呤核苷酸（AMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）堿基、核苷和核苷酸的命名堿基核苷核苷酸（5‘-單磷酸）腺嘌呤(A)腺苷腺苷酸（AMP)鳥嘌呤(G)鳥苷鳥苷酸（GMP）尿嘧啶(U)尿苷尿苷酸（UMP）胞嘧啶(C)胞苷胞苷酸（CMP）堿基脫氧核苷核苷酸（5‘-單磷酸）腺嘌呤(A)脫氧腺苷脫氧腺苷酸（dAMP)鳥嘌呤(G)脫氧鳥苷脫氧鳥苷酸（dGMP）胸腺嘧啶(T)脫氧尿苷脫氧胸腺苷酸（dTMP）胞嘧啶(C)脫氧胞苷脫氧胞苷酸（dCMP）組成RNA的基本核苷酸組成DNA的基本核苷酸四、細(xì)胞內(nèi)的其他核苷酸及其衍生物1.多磷酸核苷酸——參與細(xì)胞的能量代謝ATP:能量?jī)?chǔ)存形式GTP、CTP、UTP:能量傳遞UDP、ADP:葡萄糖殘基的載體，參與多糖的合成CDP:膽堿載體，參與磷脂的合成ATP的性質(zhì)ATP分子的最顯著特點(diǎn)是含有兩個(gè)高能磷酸鍵。ATP水解時(shí),可以釋放出大量自由能。ATP是生物體內(nèi)最重要的能量轉(zhuǎn)換中間體。ATP水解釋放出來的能量用于推動(dòng)生物體內(nèi)各種需能的生化反應(yīng)。ATP也是一種很好的磷酰化劑。磷酰化反應(yīng)的底物可以是普通的有機(jī)分子，也可以是酶。磷?；牡孜锓肿泳哂休^高的能量（活化分子），是許多生物化學(xué)反應(yīng)的激活步驟。2.環(huán)核苷酸（環(huán)磷酸化）—參與細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)，信號(hào)傳遞，“二級(jí)信使”cAMPcGMPcAMP和cGMPcAMP(3’,5’-環(huán)化腺苷酸)和cGMP(3’,5’-環(huán)化鳥苷酸)的主要功能是作為細(xì)胞的第二信使。cAMP和cGMP的環(huán)狀磷酯鍵是一個(gè)高能鍵。在pH7.4,cAMP和cGMP的水解能約為43.9KJ/mol，比ATP水解能高得多。3.輔酶類核苷酸——參與酶促反應(yīng)，傳遞電子

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADP

黃素腺嘌呤二核苷酸，F(xiàn)AD煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(或尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸或輔酶Ⅰ)(英語(yǔ)：NicotinamideAdenineDinucleotide，簡(jiǎn)為NAD)，曾稱為二磷酸吡啶核苷酸（DPN）或輔脫氫酶Ⅰ或輔酶Ⅰ。是一種轉(zhuǎn)遞電子(更準(zhǔn)確來說是：氫離子)的輔酶，它出現(xiàn)在細(xì)胞很多新陳代謝反應(yīng)中。NADH或更準(zhǔn)確NADHH是它的還原形式。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化態(tài)）核苷酸的生物學(xué)功能作為核酸的單體細(xì)胞中的攜能物質(zhì)（如ATP、GTP、CTP、GTP）酶的輔助因子的結(jié)構(gòu)成分（如NAD）細(xì)胞通訊的媒介（如cAMP、cGMP）第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、多核苷酸鏈多聚核苷酸是通過一個(gè)核苷酸的C3’-OH與另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。5’5’3’3’（一）核酸的連接方式5磷酸基末端3羥基末端3,5-磷酸二酯鍵單核苷酸之間的連接鍵：3,5-磷酸二酯鍵核酸鏈的二個(gè)游離末端:5磷酸基末端

3羥基末端書寫方向：5

35′

pGpCpApTpT-OH

3′5′GCATT3′OH5′3′PPPPPGCATTGCATT（二）核酸的表示簡(jiǎn)式線條式縮寫堿基縮寫二、DNA的分子結(jié)構(gòu)

MolecularStructureofDNA（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA分子中各脫氧核苷酸之間的連接方式（3′-5′磷酸二酯鍵）和排列順序叫做DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，簡(jiǎn)稱為堿基序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)的走向的規(guī)定為5′→3′。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息。

一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示法結(jié)構(gòu)式，線條式，字母式5′3′（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

脫氧核糖核酸的高度特異排列順序可以用堿基排列順序表示5’A-T-G-C-C-T-G-A3’

連接鍵：3’，5’-磷酸二酯鍵磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架堿基形成側(cè)鏈多核苷酸鏈均有5’-末端和3’-末端病毒和細(xì)菌中的DNA多以環(huán)狀存在，高等生物中的DNA多以線狀存在。

DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示法5′3′結(jié)構(gòu)式5′3′

p

p

p

pOH3′ACTG1′線條式5′

ACTGCATAGCTCGA3′字母式（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

1、DNA的堿基組成-Chargaff定律Chargaff首先注意到DNA堿基組成的某些規(guī)律性，在１９５０年總結(jié)出DNA堿基組成的規(guī)律：

腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即A=T。

鳥嘌呤和胞腺嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即G=C。

含氨基的堿基總數(shù)等于含酮基堿基總數(shù)，即A+C=G+T。嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即A+G=C+T。2、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1）雙螺旋模型的提出1952年，Wilkins和Franklin用高度定向的DNA纖維作出高質(zhì)量的X-光衍射照片，確定了DNA的雙鏈周期性螺旋結(jié)構(gòu)DNA的X射線衍射圖1953年，Watson和Crick提出DNA的反向平行雙螺旋模型，并對(duì)模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測(cè)。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成5′3′5′3′5′3′5′3′磷酸核糖堿基T-A堿基對(duì)C-G堿基對(duì)2）DNA雙螺旋模型要點(diǎn)2.0nm小溝大溝兩條鏈反向平行，右手螺旋堿基在內(nèi)磷酸戊糖在外堿基平面垂直于螺旋軸雙螺旋每轉(zhuǎn)一周為10堿基對(duì)（bp），螺距為3.4nm，0.34nm/bp，直徑為2nm堿基互補(bǔ)配對(duì)：A＝T，G≡C大溝與小溝：蛋白質(zhì)識(shí)別DNA的特定遺傳信息的關(guān)鍵位點(diǎn)堿基堆集力（basestackingforces)堿基處于疏水環(huán)境中

堿基配對(duì)的氫鍵（hydrogenbond)GC含量越高，DNA分子就越穩(wěn)定相反電荷的穩(wěn)定作用，即在陽(yáng)離子/組蛋白存在時(shí)，可以克服骨架上磷酸基負(fù)荷之間的靜電斥力DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義

該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是本世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。3、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài)性（1）A、B和Z型DNAB型DNA:Watson-Crick模型DNA，相對(duì)濕度為92%，生理狀態(tài)下的類型A型DNA:右手螺旋，堿基平面傾斜20o，螺旋變粗變短，螺距2～3nm；75%相對(duì)濕度；生理狀態(tài)下多見dsRNA、DNA-RNAZ-DNA：人工合成、左手螺旋；無小溝；嘧啶、嘌呤交替；與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)；此外，還發(fā)現(xiàn)有C、D、E等型。DNA雙螺旋的不同構(gòu)象

三種DNA雙螺旋構(gòu)象比較A-DNAZ-DNAB-DNAABZ外型粗短適中細(xì)長(zhǎng)螺旋方向右手右手左手螺旋直徑2.55nm2.37nm1.84nm堿基直升0.23nm0.34nm0.38nm堿基夾角32.7034.6060.00每圈堿基數(shù)1110.412軸心與堿基對(duì)關(guān)系2.46nm3.32nm4.56nm堿基傾角1901090糖苷鍵構(gòu)象反式反式C、T反式，G順式大溝很窄很深很寬較深平坦小溝很寬、淺窄、深較窄很深雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑（nm）

螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對(duì)數(shù)目堿基對(duì)間垂直

距離（nm）堿基對(duì)與水平面傾角A－DNAB－DNAZ－DNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.2720o0o7o（2）三股螺旋和四鏈結(jié)構(gòu)三股螺旋DNA（tripleHelixDNA）：H-DNA，一條DNA鏈在B-DNA的大溝處與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的一條鏈以氫鍵的形式相結(jié)合形成的螺旋結(jié)構(gòu)?？赡艿墓δ埽嚎勺柚拐{(diào)節(jié)蛋白與DNA的結(jié)合，關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄過程；與基因重組、交換有關(guān)。Hoogsteen配對(duì)及DNA三股螺旋結(jié)構(gòu)四鏈結(jié)構(gòu)（TetraplexDNA）染色體端粒高度重復(fù)的DNA序列著絲點(diǎn)附近的高度重復(fù)序列，均有形成四鏈結(jié)構(gòu)DNA的可能可能的功能：穩(wěn)定染色體和在復(fù)制過程中保持其完整性，以及參與端粒DNA的復(fù)制等作用。四鏈結(jié)構(gòu)的配對(duì)方式真核生物染色體端粒DNA結(jié)構(gòu)3）其他類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)暫時(shí)的、動(dòng)態(tài)的局部結(jié)構(gòu)，與遺傳信息表達(dá)調(diào)控有關(guān)（二）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)定義：DNA在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上雙螺旋進(jìn)一步扭曲或盤繞形成的特定空間結(jié)構(gòu)。主要類型：超螺旋結(jié)構(gòu)（正超螺旋和負(fù)超螺旋）

線狀DNA形成的超螺旋環(huán)狀DNA形成的超螺旋天然DNA主要以負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)存在真核雙鏈線性DNA（dsDNA）三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能（一）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)堿基組成A、G、C、U（A＝U/G≡C）稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)在局部形成雙螺旋分子較小分類mRNA（信使RNA,messengerRNA）tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA,transferRNA,tRNA)rRNA（核糖體RNA,ribosomalRNA）少數(shù)RNA病毒RNA的類別

信使RNA（messengerRNA，mRNA）：在蛋白質(zhì)合成中起模板作用；核糖體RNA（ribosoalRNA，rRNA）：與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成核糖體（ribosome）,核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所；轉(zhuǎn)移RNA（transforRNA，tRNA）：在蛋白質(zhì)合成時(shí)起著攜帶活化氨基酸的作用。RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

RNA分子中各核苷之間的連接方式（3′-5′磷酸二酯鍵）和排列順序叫做RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)OHOHOH5′3′

RNA與DNA的差異

DNA

RNA糖脫氧核糖核糖堿基AGCTAGCU不含稀有堿基含稀有堿基（二）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)占RNA總量的15％一種氨基酸對(duì)應(yīng)至少一種tRNA分子量25000左右，大約由70－90個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾堿基。tRNA的結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征：?jiǎn)捂溔~草葉形四臂四環(huán)三級(jí)結(jié)構(gòu)特征：在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊扭曲形成倒L型氨基酸臂DHU環(huán)額外環(huán)反密碼子環(huán)T?C環(huán)★氨基酸臂★

DHU環(huán)★反密碼子環(huán)★額外環(huán)★

T?C環(huán)酵母tRNAAla

的二級(jí)結(jié)構(gòu)

DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCAAla3′5′＊tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)(76bp)（三）rRNA，核糖體RNA占RNA總量的80％大腸桿菌5sRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)模型大腸桿菌5sRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（四）信使RNA，mRNA占細(xì)胞總RNA的2％～5％真核細(xì)胞mRNA的3’-末端有一段長(zhǎng)達(dá)200個(gè)核苷酸左右的多聚腺苷酸(polyA)，稱為“尾結(jié)構(gòu)”，5’-末端有一個(gè)甲基化的鳥苷酸，稱為“帽子結(jié)構(gòu)”。

mRNA的分子結(jié)構(gòu)原核生物mRNA特征：

先導(dǎo)區(qū)+翻譯區(qū)（多順反子）+末端序列真核生物mRNA特征：

“帽子”（m7G-5′ppp5′-N-3′p）+單順反子+“尾巴”（PolyA）原核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導(dǎo)區(qū)末端順序真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)AAAAAAA-OH5′

“帽子”PolyA

3′

順反子m7G-5′ppp-N-3′p（五）其他RNASiRNA（小分子干擾RNA,SmallorshortinterferenceRNA,siRNA）:真核生物中雙鏈小分子RNA，主要外源，準(zhǔn)確與靶RNA配對(duì)，降解RNA。miRNA:真核生物中單鏈小分子RNA，內(nèi)源，與靶RNA結(jié)合不完全，不降解抑制翻譯。antiRNA:原核生物中與mRNA相互沉默片段，真核中也存在。第三節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的復(fù)合體核蛋白體表達(dá)：就是指DNA上的信息通過轉(zhuǎn)錄為RNA和RNA再翻譯轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)功能分子的過程。一、病毒（Virus),

是主要由核酸和蛋白質(zhì)組成的非細(xì)胞生物。病毒核酸也分為兩類：DNA和RNA。依據(jù)宿主不同可分為植物病毒（RNA)、動(dòng)物病毒和細(xì)菌病毒（噬菌體）。核蛋白體有病毒、細(xì)菌擬核、真核染色體和核糖體頭部頸圈尾部基板尾絲尖釘噬菌體T2結(jié)構(gòu)TMV病毒顆粒的片段結(jié)構(gòu)圖植物病毒：煙草花葉病毒RNA蛋白質(zhì)亞基動(dòng)物病毒切面模式圖

被膜（脂蛋白、碳水化合物）衣殼（蛋白質(zhì)）核酸突起（糖蛋白）病毒粒呼腸孤病毒Retrovirus大多數(shù)核酸的病毒為雙鏈的DNA或者單鏈的RNA,但已發(fā)現(xiàn)一些簡(jiǎn)單的噬菌體含有單鏈的DNA,一些RNA病毒（如呼腸孤病毒）含雙鏈RNA。二、細(xì)菌擬核(nucleoid)

細(xì)菌細(xì)胞具有原始的核,沒有核膜,更沒有核仁,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,為了與真核細(xì)胞中典型的細(xì)胞核有所區(qū)別,稱為核區(qū)（nuclearregion)、擬核(nucleoid)或原始核（primitiveformnucleus），亦稱細(xì)菌染色體。細(xì)菌擬核（Nucleoid）的突環(huán)結(jié)構(gòu)

RNA-蛋白質(zhì)核心突環(huán)由雙鏈DNA結(jié)合堿性蛋白質(zhì)組成平均一個(gè)突環(huán)含有約40kpDNA三、真核染色體

染色體的結(jié)構(gòu)染色體的組成成分是組蛋白和DNA(1)染色單體,Chromatid

–oneofthetwoidenticalpartsofthechromosomeafterSphase.(2)

著絲粒,

Centromere

–thepointwherethetwochromatidstouch,andwherethemicrotubulesattach.(3)短臂，Shortarm.(4)長(zhǎng)臂，Longarm.長(zhǎng)臂短臂著絲粒染色單體核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖組蛋白與DNA的結(jié)合核小體連結(jié)區(qū)DNA連結(jié)區(qū)DNA核心DNADNA的念珠狀結(jié)構(gòu)真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)

DNA（2nm）核小體鏈（11nm，每個(gè)核小體200bp）纖絲（30nm，每圈6個(gè)核小體）突環(huán)（150nm，每個(gè)突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結(jié)（300nm，6個(gè)突環(huán)）螺旋圈（700nm，每圈30個(gè)玫瑰花）染色體（1400nm，

每個(gè)染色體含10個(gè)玫瑰花200bp）2.染色體的DNA序列特征（1）.原核細(xì)胞通常只含有一個(gè)染色體，染色體上所有的基因幾乎都是單拷貝的。（2）.真核細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)上合組織上復(fù)雜，與所轉(zhuǎn)錄的RAN序列之間不具有共顯性關(guān)系。例如：小鼠中，染色體10%的DNA“高度重復(fù)序列”<10bp,百萬次/細(xì)胞；染色體20%的DNA“中度重復(fù)序列”<幾百bp,1000次/細(xì)胞；染色體70%的DNA單一拷貝序列或者重復(fù)少，大多數(shù)能構(gòu)成基因，能夠被轉(zhuǎn)錄。第四節(jié)核酸的性質(zhì)一、一般理化性質(zhì)

兩性解離/一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑線性大分子（粘度高、抗剪切力差）乙醇可用電泳或離子交換（色譜）進(jìn)行分離室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解顏色反應(yīng)加熱條件下，D－核糖＋濃鹽酸＋苔黑酚綠色

D－2－脫氧核糖＋酸＋二苯胺藍(lán)紫色二、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨(dú)特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)。

DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫光外下發(fā)出熒光。核酸比其各核苷酸的光吸收值之和少30%~40%三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交1.變性定義：在某些理化條件下，DNA雙鏈解開成單鏈的過程。方法：過量酸（pH<5.0）、堿（pH>11.3）、加熱、變性試劑如尿素、酰胺、甲醛等。變性表征：部分生物活性喪失粘度下降浮力密度升高

OD260值增加（增色效應(yīng))

比旋度下降DNA的變性過程加熱部分雙螺旋解開無規(guī)則線團(tuán)鏈內(nèi)堿基配對(duì)DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（nm）光吸收123DNA的變性過程是突然性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大增量一半時(shí)的溫度稱為熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G＋C

的含量有關(guān)。G＋C的含量高，Tm值就高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G＋C的含量，可通過經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442.熱變性和TmTm：熔解溫度（meltingtemperature）Polyd(A-T)DNAPolyd(G-C)

DNA的變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中A260達(dá)到最大值一半時(shí)的溫度稱為該DNA的熔解溫度，用Tm表示。

Tm的大小與DNA分子中（G+C）的百分含量成正相關(guān)，測(cè)定Tm值可推算核酸堿基組成及判斷DNA純度。某些DNA的Tm值60801001.01.41.2100%A260t\0CTmTmTm1231233.核酸的復(fù)性定義：變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。具減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不能復(fù)性。而變性的DNA只有在緩慢冷卻時(shí)才可復(fù)性，復(fù)性過程又稱為“退火”。退火溫度＝Tm－25℃影響復(fù)性的因素：1.DNA片段濃度；2.DNA片段大小;3.DNA片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）;4.溶液的離子強(qiáng)度4.分子雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southern雜交（Southernbolting）：DNANorthern雜交（Northernbolting）：RNAWestern雜交（Westernbolting）：蛋白質(zhì)Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜不同來源的DNA單鏈間或單鏈DNA與RNA之間只要有堿基配對(duì)的區(qū)域，在復(fù)性時(shí)可形成局部雙螺旋區(qū)，稱核酸分子雜交（hybridization）制備特定的探針（probe）通過雜交技術(shù)可進(jìn)行基因的檢測(cè)和定位研究。實(shí)例：southern印跡法分子雜交的原理示意圖一、化學(xué)裂解法：標(biāo)、切、分、染、讀二、酶解法(測(cè)RNA)：標(biāo)、切、分、染、讀

三、合成終止法：標(biāo)、合、分、染、讀Sanger測(cè)定DNA核苷酸序列的方法：DNA合成終止法（雙脫氧DNA鏈合成終止法）。

四、核酸的序列測(cè)定

第五節(jié)核酸的分離純化及含量的測(cè)定●分離純化核酸必須考慮幾個(gè)因素:

一是，為了獲得盡量大的核酸片段，整個(gè)操作盡量在低溫下進(jìn)行，避免劇烈攪拌和震蕩。二是，破碎細(xì)胞后，要采用離心、抽提和酶解等方法除盡蛋白質(zhì)、脂類和糖類等其他細(xì)胞組分；三是，避免非樣品材料的核酸污染，所用的試劑和器皿均要消毒滅菌，實(shí)驗(yàn)過程中可帶上手套?！窈怂岱蛛x純化的一般原則：

1.去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)；

2.保持天然狀態(tài)?！窈怂岱蛛x純化的一般步驟：第一步，破碎細(xì)胞。第二步，去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。第三步，去除其他雜志核酸。最后得到純化的核酸。1.DNA提取的基本步驟：I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放

III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中一、核酸分離提?。篋NA的分離純化CTAB法：1.用液氮凍融，然后破碎細(xì)胞的同時(shí)，用含有CTAB的提取緩沖液使DNA與蛋白質(zhì)解聯(lián)。2.蛋白酶K消化以使蛋白質(zhì)裂解。3.通過緩沖液飽和的苯酚抽提以除去蛋白，或利用氯仿-異戊醇處理除去蛋白。4.加入一定量的NaAC或LiCl,用70%乙醇沉淀DNA。5.利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行進(jìn)一步分離和鑒定。SDS法：1.CTABSDS2.主要靠飽和苯酚抽提。

CTAB法CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，可通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)，加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃

時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaCl

CTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl

提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除?；蚪MDNA－CTAB法

CTAB法流程圖：植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液（1）

材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取注意事項(xiàng)（2）細(xì)胞裂解適量。過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K

細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組DNA的提取注意事項(xiàng)（3）

核酸分離、純化：采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔。離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法。基因組DNA的提取注意事項(xiàng)蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2,v/v)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。注意事項(xiàng)多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌注意事項(xiàng)（4）

核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分。沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀。沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）。若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解。TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase。pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解?；蚪MDNA的提取注意事項(xiàng)2.RNA的分離純化RNA的分離純化二、核酸的純化沉降速度法用超速離心機(jī)進(jìn)行沉降測(cè)定法的一種。在十分強(qiáng)大的離心力場(chǎng)中使溶質(zhì)沉降，對(duì)沉降狀態(tài)進(jìn)行觀測(cè)。從沉降速度測(cè)定求得的高分子沉降系數(shù)，除分子量外還