教學(xué)課件-流式

第十二章流式細(xì)胞技術(shù)新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院姓名：張雪xx_sunnyxue@163.com

電話(huà)：4366448一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介二、流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析三、實(shí)例解析研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選．從同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)測(cè)得多種參數(shù)研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量

一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

—流式細(xì)胞術(shù)的基本概念極短時(shí)間內(nèi)可分析大量細(xì)胞，只要標(biāo)本中的細(xì)胞數(shù)量足夠，流式細(xì)胞儀（Flowcytometer）可以每秒鐘數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千個(gè)細(xì)胞的速率進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)數(shù)千、數(shù)萬(wàn)乃至數(shù)百萬(wàn)個(gè)。

快可同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的多種特征，當(dāng)同時(shí)用多種分子探針，如用不同熒光素標(biāo)記的不同單克隆抗體進(jìn)行多色熒光染色，通過(guò)流式細(xì)胞分析，即可獲得單細(xì)胞的多種信息，使細(xì)胞亞群的識(shí)別、計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。準(zhǔn)定性或定量分析細(xì)胞：通過(guò)熒光染色對(duì)單細(xì)胞的某些成分如DNA含量、抗原或受體表達(dá)量、Ca2+濃度、酶活性以及細(xì)胞的功能等均可進(jìn)行單細(xì)胞水平的定性與定量分析一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

—流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)光源激光自然光、燈光、氙(汞)燈對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、生物粒子承載工具載(蓋)玻片鞘液及流動(dòng)室檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色放大方式PMT，放大電路目鏡X物鏡統(tǒng)計(jì)人工，200計(jì)算機(jī)，>5000結(jié)果簡(jiǎn)單，單參數(shù)多參數(shù)，綜合分析FLOWMICROSCOPE一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

—流式細(xì)胞儀與顯微鏡細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介

—流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍

流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)快速檢測(cè)分析單個(gè)粒子多物理特性的高技術(shù)，通常指細(xì)胞通過(guò)激光束時(shí)在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對(duì)的熒光強(qiáng)度。通過(guò)光電系統(tǒng)記錄細(xì)胞的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)可得知細(xì)胞特性。流式細(xì)胞儀主要由三部分組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：

液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。

光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過(guò)光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。

電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。對(duì)于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。綜述

在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析。在實(shí)際工作中，用實(shí)體組織進(jìn)行流式細(xì)胞分析往往是不可能的，分析之前必須對(duì)其進(jìn)行分解。被液滴包繞的粒子稱(chēng)為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)（相應(yīng)的透鏡，濾片和探測(cè)器）收集。分光器和濾光片引導(dǎo)散射光和熒光至相應(yīng)的探測(cè)器，把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。單個(gè)粒子通過(guò)其表現(xiàn)出的光散射和熒光屬性，通過(guò)列表模式（Listmode）完成數(shù)據(jù)采集，并對(duì)樣本中的細(xì)胞亞群進(jìn)行分析。散射光和激發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換成為計(jì)算機(jī)可處理的充電脈沖1、液流系統(tǒng)

液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心。而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過(guò)激光束。因此，必須在流動(dòng)室內(nèi)把細(xì)胞注入鞘液流。流動(dòng)室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺(tái)式機(jī)中流動(dòng)室稱(chēng)為樣品槽，大型機(jī)稱(chēng)之為噴嘴。在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相交。流動(dòng)室內(nèi)充滿(mǎn)鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱。這種同軸流動(dòng)的設(shè)計(jì)，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為流體聚焦。液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)將樣本懸液聚焦在光源的中心處InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid細(xì)胞液柱通過(guò)樣品槽產(chǎn)生流體聚焦圖1-1細(xì)胞液柱通過(guò)噴嘴產(chǎn)生流體聚焦圖1-2

樣本壓力和鞘液壓力是不同的，且樣本壓力總是大于鞘液壓力。樣本壓力調(diào)節(jié)器通過(guò)改變樣本壓力的方法控制樣本流速。

臺(tái)式機(jī)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細(xì)胞在流動(dòng)室內(nèi)與激光相交（圖1-1）。除BDLSR型臺(tái)式機(jī)有樣本壓力細(xì)調(diào)旋鈕外，大多數(shù)臺(tái)式機(jī)都采用固定的樣本壓力（分低，中，高速）。

大型機(jī)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞懸液從噴嘴噴出后，粒子或細(xì)胞在流動(dòng)室外與激光相交（圖1-2）。且樣本壓力連續(xù)可調(diào)。增加樣本壓力就是通過(guò)加寬液柱的方法增加樣本流速。換言之，在特定時(shí)間內(nèi)，允許更多細(xì)胞通過(guò)液流。當(dāng)液柱變寬時(shí)，一些流經(jīng)激光束的細(xì)胞會(huì)偏離中心，光斑也會(huì)偏離理想角度，這在一定程度下是允許的。

高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過(guò)，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如DNA分析。

為確保粒子和細(xì)胞完全通過(guò)激光束，正確調(diào)節(jié)樣本壓力對(duì)實(shí)驗(yàn)操作是至關(guān)重要的。2、散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的檢測(cè)2.1散射光信號(hào)

粒子折射激光產(chǎn)生散射光信號(hào)。散射光不依賴(lài)任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱(chēng)為細(xì)胞的物理特性，即細(xì)胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。散射光與細(xì)胞膜，核膜以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的折射性、顆粒性密切相關(guān)，細(xì)胞形狀和表面形貌也對(duì)其產(chǎn)生影響。前向角散射：前向角散射（FSC）光與被測(cè)細(xì)胞的大小和面積有關(guān)，檢測(cè)的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向的散射光信號(hào)（見(jiàn)圖3-1）。FSC不受細(xì)胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號(hào)處理。側(cè)向角散射：側(cè)向角散射（SSC）光與被測(cè)細(xì)胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感（見(jiàn)圖3-1）。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號(hào)。前向角散射光——FSCForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser側(cè)向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser細(xì)胞的光散射特性圖2-1上述兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原光束，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類(lèi)的細(xì)胞亞群，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下圖（圖3-2）為FSC和SSC組成的二維散點(diǎn)圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。圖2-2FSC、SSC二維散點(diǎn)圖圖2-2FSC、SSC二維散點(diǎn)圖2.2熒光信號(hào)

熒光物質(zhì)吸收符合其波長(zhǎng)范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級(jí)。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過(guò)剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱(chēng)為熒光。能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長(zhǎng)范圍稱(chēng)為激發(fā)光譜。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖辙D(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長(zhǎng)要高于激發(fā)光波長(zhǎng)。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長(zhǎng)范圍叫做發(fā)射光譜。目前的流式細(xì)胞儀大多采用氬離子激光器，因?yàn)?88nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)愈強(qiáng)。FITC的激發(fā)光譜如圖2-3所示，488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)，而當(dāng)FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，也會(huì)檢測(cè)到熒光，但信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)這么高。FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)熒光檢測(cè)器圖2-3FITC、PE、PerCP、APC染料的激發(fā)光譜

如果激發(fā)光波長(zhǎng)都是488nm，而發(fā)射光波長(zhǎng)又不是極其接近的話(huà)，我們可以同時(shí)檢測(cè)兩種以上的熒光。如FITC和PE雙染就符合這種條件。這兩種熒光素的發(fā)射光譜如圖2-4所示。雖然PE的激發(fā)光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測(cè)到熒光。更重要的是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光波長(zhǎng)是530nm，PE的發(fā)射光波長(zhǎng)是570nm。他們的發(fā)射光波長(zhǎng)足夠遠(yuǎn)，可以使用不同的檢測(cè)器。被檢測(cè)到的熒光信號(hào)數(shù)量與粒子中標(biāo)記上的分子數(shù)量成正比。圖2-4FITC、PE、PerCP、APC染料的發(fā)射光譜

對(duì)單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，通過(guò)分析細(xì)胞表面抗原標(biāo)記確認(rèn)細(xì)胞類(lèi)型（見(jiàn)圖2-5）。在細(xì)胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細(xì)胞亞群。每個(gè)亞群的染色模式與FSC和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識(shí)別樣本中的細(xì)胞種類(lèi)，并可以得到各細(xì)胞亞群的百分含量。而且，還可以對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分選。圖2-5熒光標(biāo)記抗體對(duì)細(xì)胞表面抗原的特異性結(jié)合3、光學(xué)系統(tǒng)

光學(xué)系統(tǒng)由光學(xué)激發(fā)器和光學(xué)收集器組成。光學(xué)激發(fā)器包括激光和透鏡，透鏡用于形成激光束，并使之聚焦。光學(xué)收集器則由若干透鏡組成，用于收集粒子發(fā)射的光束---激光束相互作用，透鏡組和濾片發(fā)送激光束至相應(yīng)的光學(xué)探測(cè)器。光平臺(tái)的設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)以上功能。3.1光平臺(tái)流式細(xì)胞儀的光平臺(tái)提供了一個(gè)固定平面，將激光源、光學(xué)激發(fā)器和收集器控制在一個(gè)固定的位置。因而臺(tái)式機(jī)的流動(dòng)室和光路是固定的，能夠保證光斑和樣本流自始至終保持恒定。圖3-1和圖3-2分別為臺(tái)式機(jī)FACSCalibur和BDLSR的光平臺(tái)系統(tǒng)。圖3-1臺(tái)式機(jī)FACSCalibur光平臺(tái)系統(tǒng)圖3-2臺(tái)式機(jī)BDLSR光平臺(tái)系統(tǒng)

在大型機(jī)中，當(dāng)液流流過(guò)噴嘴時(shí)，激光束通過(guò)消色差透鏡組以最佳角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置會(huì)發(fā)生變化，所以大型機(jī)的光路沒(méi)有臺(tái)式機(jī)穩(wěn)定，需要每日優(yōu)化。光路不正有可能導(dǎo)致粒子受激光照射的能量不均一，從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同，造成測(cè)量誤差。圖3-3大型機(jī)FACSVantageSE光平臺(tái)系統(tǒng)3.2光學(xué)濾片

當(dāng)細(xì)胞或粒子流過(guò)激光照射區(qū)時(shí)，SSC和熒光信號(hào)很弱，需要使用光電倍增管（PMTs）收集，而FSC信號(hào)很強(qiáng)，由光電二極管收集即可。所有信號(hào)經(jīng)由透鏡組和濾片組到達(dá)相應(yīng)的檢測(cè)器。光電倍增管（PMTs）檢測(cè)到的熒光信號(hào)常常是很微弱的。在光電倍增管（PMTs）前設(shè)置濾片可以使相當(dāng)窄的一波長(zhǎng)范圍內(nèi)光通過(guò)，提高了熒光信號(hào)的純度和強(qiáng)度，因而每個(gè)檢測(cè)器只有一種指定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)進(jìn)入而被檢測(cè)，使光譜帶寬接近熒光染料的發(fā)射峰值。這種濾片稱(chēng)為帶通（BP）濾片。如：FITC檢測(cè)器前的濾片標(biāo)志為530/30，其含義是光譜發(fā)射波長(zhǎng)：530±15nm，或者說(shuō)允許通過(guò)的波長(zhǎng)范圍在515nm和545nm之間。BP500/50則表示其允許通過(guò)波長(zhǎng)范圍為475nm-525nm。流式細(xì)胞儀中常用的濾片還有長(zhǎng)通濾片（LP）和短通濾片（SP），長(zhǎng)通濾片使特定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以下的不通過(guò)。如LP500濾片，將允許500nm以上的光通過(guò)，而500nm以下的光吸收或返回。短通濾片與長(zhǎng)通濾片相反，特定波長(zhǎng)以下的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以上的光吸收或返回。（見(jiàn)圖3-4）。分光器的主要作用是完成光的收發(fā)。二色性反射鏡就是其中一種。560短通二色性反射鏡如圖4-1所示發(fā)射560nm或小于560nm的波長(zhǎng)（如圖3-1所示）。大于560nm的波長(zhǎng)被反射。圖3-4光線通過(guò)長(zhǎng)通濾片、短通濾片及帶通濾片的波長(zhǎng)范圍3.3光電探測(cè)器

處在液流中的粒子通過(guò)激光束時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，這些光信號(hào)通過(guò)光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)（電壓），然后到相應(yīng)的通道。BD流式細(xì)胞儀有兩種類(lèi)型的光電探測(cè)器：光電二極管和光電倍增管（PMTs）。光電倍增管（PMTs）對(duì)光信號(hào)比光電二極管敏感，所以前者用于檢測(cè)較弱的SSC信號(hào)和熒光信號(hào)；后者用于檢測(cè)較強(qiáng)的FSC信號(hào)。粒子進(jìn)入照射區(qū)開(kāi)始散射光或熒光時(shí)產(chǎn)生充電脈沖，首先光信號(hào)或光子由光電倍增管（PMTs）或光電二極管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)由放大器，轉(zhuǎn)換成充電脈沖。當(dāng)粒子位于激光束正中時(shí)，脈沖最大，熒光最強(qiáng)。當(dāng)粒子偏離激光束時(shí)，脈沖回到基線圖3-5充電脈沖的產(chǎn)生

充電脈沖的大小取決于光電倍增管前置放大器獲得的光子數(shù)量，放大器可設(shè)置為線性放大或者對(duì)數(shù)放大（Lin或Log）。對(duì)數(shù)放大（Log）常常用于把陰性信號(hào)從微弱的陽(yáng)性信號(hào)中分離出來(lái)；而線性放大（Lin）通常用于放大散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。充電脈沖通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器把0-1000mV的脈沖轉(zhuǎn)換成為代表0-1,000mV通道的數(shù)值。通道數(shù)值經(jīng)由輸入輸出（GPIO）數(shù)據(jù)線傳送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理顯示圖3-6模擬信號(hào)到數(shù)字信號(hào)的轉(zhuǎn)換過(guò)程3.4閥值

閥值用于設(shè)置低于該道數(shù)的信號(hào)不被處理，只有高于等于閥值道數(shù)的信號(hào)才會(huì)被送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。每次只能有一個(gè)設(shè)閥參數(shù)。如：對(duì)免疫表型實(shí)驗(yàn)，閥值應(yīng)設(shè)為FSC，以消除低于閥值道數(shù)的碎片。用戶(hù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置其它參數(shù)的閥值。第二個(gè)閥值適用于配有兩個(gè)激光器的臺(tái)式機(jī)。如果設(shè)置了兩個(gè)閥值，那么粒子必須同時(shí)滿(mǎn)足兩個(gè)閥值的要求才會(huì)被當(dāng)作信號(hào)細(xì)胞處理。4、數(shù)據(jù)分析4.1數(shù)據(jù)采集及顯示

光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計(jì)算機(jī)能夠儲(chǔ)存處理的數(shù)字信號(hào)。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標(biāo)準(zhǔn)格式存儲(chǔ)，該標(biāo)準(zhǔn)由“分析細(xì)胞學(xué)協(xié)會(huì)”制定。根據(jù)FSC標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)格式應(yīng)包括三個(gè)文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。4參數(shù)（FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE）的單細(xì)胞分析會(huì)生成8位數(shù)據(jù)。當(dāng)單個(gè)樣品累計(jì)收集到10000個(gè)細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB。數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)完畢后，細(xì)胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量。處在同一通道的每一細(xì)胞均符合該通道的信號(hào)值，而且具有相同的信號(hào)密度。通道右側(cè)信號(hào)的熒光強(qiáng)度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強(qiáng)。流式數(shù)據(jù)可以用一維直方圖、二維散點(diǎn)圖、等高線圖、密度圖等來(lái)表示，下面逐一附圖說(shuō)明。1，單參數(shù)直方圖：每一個(gè)細(xì)胞單參數(shù)的測(cè)量數(shù)據(jù)可以整理成統(tǒng)計(jì)分布，以直方圖的方式來(lái)顯示。在圖中，橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度的值，其單位是道數(shù)，可以是線形（line）或者對(duì)數(shù)（log）?？v坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)（count），如下圖：2，散點(diǎn)圖：

散點(diǎn)圖常被用來(lái)分析多參數(shù)數(shù)據(jù)，如凋亡周期特異性，早期凋亡的檢測(cè)等，如下圖：AnnexinV-FITC/PI染色。3,等高線圖和密度圖

這兩種圖其實(shí)就是密度圖的變化，等高線圖和地圖一樣。密度圖則與等高線圖密切聯(lián)系，密度高的地方顏色就偏紅些。

圖4-1流式數(shù)據(jù)分析圖4.2設(shè)門(mén)

通過(guò)設(shè)門(mén)的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門(mén)，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。圖4-2全血樣本中淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖lysedwholeblood4.3細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析包括從點(diǎn)圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù),然后統(tǒng)計(jì)點(diǎn)圖中的細(xì)胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點(diǎn)圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過(guò)設(shè)門(mén)的方法區(qū)分指定的細(xì)胞亞群。如圖4-3所示，在淋巴細(xì)胞亞群周?chē)O(shè)門(mén)，以單獨(dú)分析或分選該亞群細(xì)胞。圖4-3選定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門(mén)

門(mén)內(nèi)細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在后面的實(shí)例中，我們將詳盡闡述細(xì)胞亞群百分含量的不同分析方法。我們可以通過(guò)單參數(shù)直方圖，二維點(diǎn)圖和三維圖來(lái)分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點(diǎn)圖可設(shè)置象限標(biāo)志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表以輸出結(jié)果。直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界（見(jiàn)圖4-4）。左圖中M1為陰性對(duì)照峰。右圖中M2為CD3FITC陽(yáng)性峰。圖4-4陰性對(duì)照峰M1和CD3FITC陽(yáng)性峰M2

圖4-5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門(mén)內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中M1（陰性）細(xì)胞619個(gè)，M2（CD3陽(yáng)性）細(xì)胞2272個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽(yáng)性百分含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。圖4-5直方圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果

二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖4-6為陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽(yáng)性細(xì)胞以及雙陽(yáng)性細(xì)胞。左下象限（LL）為雙陰性細(xì)胞，左上象限（UL）為Y軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD19PE），左下象限（LR）為X軸陽(yáng)性細(xì)胞（CD3FITC），右上象限（UR）為雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）。圖4-6陰性對(duì)照組和CD3FITC/CD19PE雙染樣本如圖所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽(yáng)性細(xì)胞（CD19+/CD3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。圖5-7散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果

另一個(gè)分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門(mén)。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域（如圖4-8所示）；然后統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)指定細(xì)胞亞群的百分含量。在圖4-9中，R4門(mén)內(nèi)為CD4陽(yáng)性，CD3陰性的淋巴細(xì)胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%。圖4-8CD3FITC/CD4PE雙染樣本分析圖圖4-9CD3FITC/CD4PE雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果4.4流式細(xì)胞儀的其它應(yīng)用以及數(shù)據(jù)分析

這些分析方法通常適用于計(jì)算離散細(xì)胞群的百分含量，對(duì)于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽(yáng)性并不適用。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個(gè)細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽(yáng)性，所以我們通過(guò)幾何均值法和中位法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光密度和陽(yáng)性率。如果樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽(yáng)性的，兩者間的差異越大，說(shuō)明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽(yáng)性率越高。圖4-10單細(xì)胞株分析圖如圖4-10所示，左圖為單細(xì)胞群的散射光信號(hào)，右圖為陰性對(duì)照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個(gè)峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。我們使用周期分析軟件進(jìn)行DNA定量分析。因?yàn)镈NA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是離散的，所以我們對(duì)曲線以下的面積進(jìn)行積分，以得到每個(gè)細(xì)胞亞群的百分含量結(jié)果。圖4-12細(xì)胞周期的DNA直方圖5、分選5.1分選

在大多數(shù)應(yīng)用中，粒子處理完畢都被送往廢液缸，分選功能的實(shí)現(xiàn)使我們可以獲取收集感興趣的細(xì)胞以進(jìn)行再分析。要分選細(xì)胞，首先要識(shí)別待分選的細(xì)胞亞群。我們需要在該亞群周?chē)O(shè)定一邏輯門(mén)，也就是所謂的分選門(mén)。不同的流式細(xì)胞儀分選方法不同。比如臺(tái)式機(jī)使用機(jī)械裝置捕集管分選細(xì)胞。捕集管位于流動(dòng)的細(xì)胞上部，通過(guò)出入樣本流的方法收集感興趣的細(xì)胞亞群，分選速度為每秒300個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞流過(guò)激光束時(shí)，電系統(tǒng)通過(guò)設(shè)置好的分選門(mén)，快速確定分選目標(biāo)。因?yàn)榧す夤饴泛鸵毫魉俣仁枪潭ǖ模?xì)胞從光斑流向捕集管的時(shí)間也是恒定的。當(dāng)?shù)竭_(dá)延遲時(shí)間時(shí)，捕集管轉(zhuǎn)時(shí)樣本流捕獲細(xì)胞。如圖5-1所示，左圖為捕集器位于鞘液流，右圖為捕集器位于樣本流，正在捕獲目標(biāo)細(xì)胞。圖5-1

細(xì)胞的性質(zhì)是在進(jìn)入液滴以前已經(jīng)被測(cè)定了的。如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則儀器在這個(gè)被選定的細(xì)胞剛形成液滴時(shí)給整個(gè)液柱充以指定的電荷。這樣，當(dāng)被選定的細(xì)胞形成液滴時(shí)就帶有特定的電荷，未被選定的細(xì)胞形成的細(xì)胞液滴及不包含細(xì)胞的空白液滴不被充電，也不帶電荷。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，依所帶電荷的極性向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，從而完成了細(xì)胞分選。圖5-2FACSVantageSE分選元件圖6、激光器及光路校正

流式細(xì)胞儀中通常使用的氬離子激光器是一種氣體激光器。這種激光器由氣缸或等離子管組成，其頻率穩(wěn)定性高，相干性好，壽命長(zhǎng)。激光是這樣產(chǎn)生的：當(dāng)高壓放電激發(fā)電子，電子吸收能量躍遷到高能級(jí)，然后在短時(shí)間內(nèi)釋放光子，回到基態(tài)。等離子管末端的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)回反射光子。這些光子與其它受激電子相互作用，釋放出更多與其波長(zhǎng)、相位、方向相同的光子，隨著光子數(shù)量的增加，光信號(hào)得到放大產(chǎn)生激光，并通過(guò)放電管尾部的布魯斯特窗產(chǎn)生偏振，以最小損耗率傳送。我們?cè)诘入x子管周?chē)右淮艌?chǎng)，對(duì)帶電粒子起約束作用，以提高放電區(qū)中心的電子密度和離子密度，從而提高了輸出功率。

激光光束在到達(dá)流動(dòng)室前，先經(jīng)過(guò)透鏡，將其聚焦，形成短軸稍大于細(xì)胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布；為保證樣品中細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)分別受到光照并且受照強(qiáng)度十分一致，須將樣本流與激光束正交且相交于激光能量分布峰值處。臺(tái)式機(jī)的光路調(diào)節(jié)對(duì)用戶(hù)是封閉的，即安裝時(shí)由工程師調(diào)試完畢后，無(wú)需用戶(hù)作任何調(diào)節(jié)，所以用戶(hù)操作十分方便。大型機(jī)使用的是可調(diào)激光器和可調(diào)光學(xué)系統(tǒng)，用戶(hù)可以根據(jù)需要自行調(diào)節(jié)。樣本處理細(xì)胞懸液的制備細(xì)胞懸液：分離PBMC：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細(xì)胞特定群體丟失，并可能引入某些誤差直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣本用血量小灌洗液、體腔積液培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系實(shí)體組織：病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本針吸組織：新鮮樣本鞘液、洗液等：清潔無(wú)顆粒雜質(zhì)步驟一：

選擇合適的熒光染料必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少熒光產(chǎn)生過(guò)程PropidiumIodide400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmFluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)ProteinAllophycocyanin(APC)Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmFITC和PE熒光光譜

補(bǔ)償模型圖

補(bǔ)償調(diào)節(jié)前后對(duì)比FL1FL2步驟二：

染色1、外周血免疫細(xì)胞表面標(biāo)記(I)取100μl肝素抗凝全血，置于FCM測(cè)量管中。(2)直接標(biāo)記：加入帶熒光標(biāo)記的鼠抗人目的單克隆抗體試劑10μI，充分混勻，在4攝氏度冰箱中反應(yīng)30min:(3)間接標(biāo)記法：加入不帶熒光標(biāo)記的鼠抗人目的單克隆抗體試劑10ul，充分混勻，反應(yīng)30min，再加入帶熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體，反應(yīng)30min；(4)再加入2ml溶紅細(xì)胞液，充分混勻，在4度冰箱中反應(yīng)5-10min，(5）以I500r/min離心5min，去上清；(6）用生理鹽水洗1遍，收集細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè).2、外周血免疫細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記(1)肝素抗凝采血，(2)取2只試管，分別作為陰性對(duì)照管(A管)和測(cè)定管(B管)，于2只試管中均加人100μl血液和100ulPRM1-1640(3)A管中加入3.4ul1mg/ml的莫能屋工作液，B管中加人，5ulIμg/ml的PMA工作液。(4)37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h，(5)混勻，取出100μI，加入適量CD3-PC5(PerCP)，CD8-FITC，孵育30min(6)用破膜劑固定和破膜，(7)加入適量IL-4-PE,IFN-yPE，孵育30min(8)PBS洗一次，去上清，適量PBS重懸細(xì)胞沉淀，上機(jī)檢測(cè)。值得注意的是，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞表團(tuán)和細(xì)胞內(nèi)抗原時(shí)，應(yīng)先標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，破膜后再標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)抗原，直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low間接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high示意圖畫(huà)圖尋找目標(biāo)細(xì)胞調(diào)整儀器設(shè)置到合適的狀態(tài)我們可以得到怎樣的結(jié)果？它們意味著什么？步驟三：

數(shù)據(jù)收集和分析儀器設(shè)置調(diào)節(jié)1.用未染色細(xì)胞調(diào)整儀器PMT電壓2.用單染色的細(xì)胞調(diào)節(jié)儀器補(bǔ)償例：一個(gè)雙色染色的實(shí)驗(yàn)抗體AFITC，抗體BPE

對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要準(zhǔn)備的是陰性對(duì)照：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE單陽(yáng)性對(duì)照：

FITC:細(xì)胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:細(xì)胞加上AbBPE,IgG1FITC關(guān)于同型對(duì)照數(shù)據(jù)分析設(shè)門(mén)設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)如何設(shè)定陰性與陽(yáng)性的界限

流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學(xué)特性。它借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)與血球計(jì)數(shù)原理,同時(shí)利用熒光染料,激光技術(shù),單抗技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,大大提高了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)精確性,而且從同一個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)測(cè)得多種參數(shù),為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗(yàn)學(xué)發(fā)展提供了一個(gè)全新的視角和強(qiáng)有力的手段。

FCM在生命科學(xué)中的應(yīng)用,標(biāo)志著細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等進(jìn)入了細(xì)胞和分子水平的研究。為從微觀認(rèn)識(shí)細(xì)胞及橫向比較特征提供了精密、準(zhǔn)確的方法.一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介二、流式細(xì)胞術(shù)在生物學(xué)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析三、實(shí)例解析二、流式細(xì)胞術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用

1、染色體核型分析用流式細(xì)胞術(shù)可將分離的染色體進(jìn)行分類(lèi)、純化。傳統(tǒng)的核型分析在取材、培養(yǎng)、涂片、固定后,用分帶技術(shù)顯示出不同染色體的特征信息,然后再顯微照相,放大、剪接、組型。這是一個(gè)十分費(fèi)時(shí)且不可避免摻有主觀因素的技術(shù)。目前,用儀器自動(dòng)分型的方法,一是采用圖像技術(shù)的靜態(tài)方法,再有就是采用流式細(xì)胞術(shù)。后者除可做染色體分析外還可純化,得到克隆實(shí)驗(yàn)所要求的染色體,這是其他任何技術(shù)都無(wú)法完成的。

2、在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的分析功能和分選功能在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域很有用處。分析的功能常用來(lái)研究分離的染色體,有時(shí)也用來(lái)檢測(cè)或定量測(cè)量細(xì)胞表面或內(nèi)部為特異基因所編碼的細(xì)胞分子;分選的功能可用來(lái)分選指定的染色體,然后用來(lái)建立人類(lèi)染色體DNA文庫(kù)。

3、用于家畜性別的預(yù)選擇將家畜的X、Y精子分選出來(lái),達(dá)到控制胎畜性別的目的。此外,在精子發(fā)生學(xué)、睪丸瘤、不育癥、藥物對(duì)精細(xì)胞的干擾等研究中,都可使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量研究。

4、在微生物學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)在真核細(xì)胞生物學(xué)方面,特別是哺乳類(lèi)細(xì)胞學(xué)方面有重要貢獻(xiàn),

在微生物學(xué)中,需要對(duì)大數(shù)量細(xì)菌進(jìn)行逐個(gè)的快速多參數(shù)精確測(cè)量時(shí),流式細(xì)胞術(shù)很適合解決此類(lèi)問(wèn)題。已發(fā)表的論文多數(shù)是針對(duì)酵母菌和各類(lèi)細(xì)菌的測(cè)量與分析。酵母菌的測(cè)量在技術(shù)上比較簡(jiǎn)單,它自身體積大,其DNA含量約為人類(lèi)二倍體細(xì)胞DNA含量的1/200?，F(xiàn)在已用定量DNA、RNA和光散射方法研究酵母菌的細(xì)胞周期。用同樣方法和目的,也對(duì)原生生物、藻類(lèi)和霉菌類(lèi)以及各種重金屬對(duì)其的影響進(jìn)行研究。另外用FITC結(jié)合的抗血清可作種系鑒別,應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)已能代替臨床上經(jīng)典的費(fèi)時(shí)繁瑣的細(xì)菌抗生素敏感試驗(yàn)和傳染活性的測(cè)定。在工業(yè)中,流式細(xì)胞術(shù)可用于快速微生物鑒定,如對(duì)飲用水及原油中的微生物學(xué)鑒定與控制。

5、在細(xì)胞周期研究中的應(yīng)用在生物細(xì)胞核中,DNA含量并非恒定,隨細(xì)胞增殖周期時(shí)相不同而發(fā)生變化。G0期是第一次細(xì)胞分裂完成后進(jìn)入第二次分裂開(kāi)始前的階段。G0期細(xì)胞是不參與細(xì)胞增殖的一群細(xì)胞,為靜止期細(xì)胞,其細(xì)胞DNA含量為較恒定的二倍體(diploid)。G1期指第二次分裂開(kāi)始到本次DNA復(fù)制之前的過(guò)程,此期主要功能是積累能量和原料為DNA的復(fù)制做準(zhǔn)備,故又稱(chēng)DNA合成前期。G1期細(xì)胞具有增殖活性,開(kāi)始有RNA的合成;G0期和Gl期是細(xì)胞處于周期過(guò)程中兩種不同功能狀態(tài)時(shí)相的細(xì)胞,不能視為同一細(xì)胞,但就DNA含量而言,兩者相同,均為二倍體DNA含量。S期又稱(chēng)DNA合成期,合成及復(fù)制DNA。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后,DNA含量值逐漸從二倍體～四倍體增加,直到細(xì)胞DNA倍增結(jié)束,進(jìn)入G2期。G2期指從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始的時(shí)間區(qū)間,又稱(chēng)DNA合成后期或有絲分裂前期,此期合成大量蛋白質(zhì),為M期的細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備。經(jīng)過(guò)G2期后細(xì)胞最終進(jìn)入M期,即有絲分裂期。在M期分裂為兩個(gè)子細(xì)胞之前,G2期和M期的DNA含量均為恒定的四倍體細(xì)胞群。FCM分析細(xì)胞周期與DNA倍體時(shí),需對(duì)DNA進(jìn)行染色。DNA熒光染料與細(xì)胞DNA雙鏈的結(jié)合有一定量效關(guān)系,即DNA含量的多少與PI結(jié)合量成正比,因此通過(guò)熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量。二、流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1、免疫學(xué)中的應(yīng)用2、血液病的分型/治療方案確定及療效評(píng)估等3、血小板功能相關(guān)疾病的診斷及機(jī)理研究4、增殖/倍體分析5、細(xì)胞凋亡研究6、移植配型/移植排斥/免疫功能重建等各方面研究7、細(xì)胞分選8、流式鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞9、細(xì)胞功能分析（包括增殖/活化等各方面功能的研究）10、用于診斷紅細(xì)胞性疾?。òǜ鞣N免疫細(xì)胞如T/B/NK/DC等的分類(lèi)研究）

（如，白血病/淋巴瘤等）1.流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用1.淋巴細(xì)胞亞群分析

淋巴細(xì)胞是正常機(jī)體免疫系統(tǒng)功能最重要的一大細(xì)胞群,在免疫應(yīng)答過(guò)程中,未梢血淋巴細(xì)胞發(fā)育成為功能不同的亞群.各亞群的數(shù)量和功能產(chǎn)生異常時(shí),就能導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化.FCM可以同時(shí)檢測(cè)一種或幾種淋巴細(xì)胞細(xì)胞表面抗原,對(duì)不同的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的測(cè)定來(lái)監(jiān)控病人的免疫狀態(tài),指導(dǎo)治療.

免疫狀態(tài)

相關(guān)疾病CD3、CD4、CD8總數(shù)降低 細(xì)胞免疫功能低下，免疫缺陷CD4/CD8比值降低 AIDS、病毒感染、惡性腫瘤（復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移）再生障礙性貧血等CD4/CD8比值升高 SLE、RA、MCTD、自身免疫性溶血性貧血等1.流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用

—免疫狀態(tài)的檢測(cè)2.感染及其治療效果觀察

由于T淋巴細(xì)胞在人體免疫系統(tǒng)中承擔(dān)著重要的功能,因此,當(dāng)感染發(fā)生時(shí),T淋巴細(xì)胞各亞群的變化往往能很敏感地反映感染的狀態(tài)與程度.例如,細(xì)胞膜外CD4分子有HIV識(shí)別部位,因此CD4細(xì)胞是HIV病毒受體,AIDS病人CD4+T細(xì)胞明顯減少,該指標(biāo)是診斷AIDS的重要標(biāo)志.當(dāng)病毒感染發(fā)生時(shí)(如乙型肝炎,EB病毒和巨細(xì)胞包涵體病毒),CD8+T細(xì)胞增多,對(duì)CD8細(xì)胞的測(cè)定有助于對(duì)感染的診斷,治療效果的動(dòng)態(tài)觀察.利用流式細(xì)胞儀可對(duì)器官或骨髓移植后病人進(jìn)行監(jiān)控.當(dāng)病人CD3+,CD25+持續(xù)增加提示已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生排異,CD4/CD8持續(xù)下降表明有感染發(fā)生,當(dāng)其比值小于0.2時(shí)必須停用免疫抑制劑.由于流式細(xì)胞儀將靜態(tài)的,顯微鏡下肉眼觀察改為動(dòng)態(tài)的,計(jì)算機(jī)信號(hào)處理,因此結(jié)果更真實(shí),更具有統(tǒng)計(jì)意義.治療前治療后1m治療后3mCD4+細(xì)胞數(shù)(個(gè)/ul)135264.6288.3病例:AIDS

1.流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用

—評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫功能3.其他免疫功能性疾病分析

流式細(xì)胞儀便捷,準(zhǔn)確的特點(diǎn)可以用來(lái)對(duì)自身免疫性疾病進(jìn)行檢測(cè)與療效觀察.1）系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）病人的淋巴細(xì)胞變化可以反映該病的活動(dòng)情況和器官侵犯程度.活動(dòng)或非活動(dòng)性SLE伴有多系統(tǒng)疾病但無(wú)腎臟損害的病人可出現(xiàn)CD4/CD8比值升高,伴有嚴(yán)重腎臟損害的SLE病人可出現(xiàn)低CD4+,高CD8+的現(xiàn)象.2）有證據(jù)表明外周血HLAB27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊髓炎的發(fā)生有很大程度的相關(guān)性,利用流式細(xì)胞儀可以進(jìn)行HLA-B27/HLA-B7雙標(biāo)記來(lái)檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞,同時(shí)排除交叉反應(yīng).3）CD23表達(dá)的增加與變態(tài)反應(yīng)性疾病,自身免疫性疾病,腎病綜合癥有關(guān),而且陽(yáng)性率與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),治療有效后CD23+細(xì)胞減少.4）利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PNH血細(xì)胞的細(xì)胞膜所缺乏蛋白如CD55與CD59來(lái)確診陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿，比傳統(tǒng)的血清溶血試驗(yàn)具有更高的特異性與靈敏度.

了解不同淋巴細(xì)胞及亞群數(shù)量及功能變化，對(duì)臨床可提供重要的實(shí)驗(yàn)信息。

認(rèn)識(shí)疾病觀察病程變化考核藥物療效

探討發(fā)病機(jī)制判斷預(yù)后

1.流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用

—淋巴細(xì)胞功能測(cè)定的目的

流式檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞亞群的正常參考范圍CD3+70.0±12.0%CD3+CD4+CD8-40.0±9.0%CD3+CD4-CD8+30.0±8.0%CD3-CD56+(NK)12.0±8.0%CD19+8.0±3.0%CD4+/CD8+比值：1.0-2.52.流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用CD(clusterofdifferentiation)指的是分化群或分化簇。在使用CD命名細(xì)胞膜表面免疫標(biāo)志的初期，他專(zhuān)職白細(xì)胞膜上的抗原或抗原識(shí)別的抗體，故又稱(chēng)白細(xì)胞分化抗原。?

目前“CD”代表的不僅僅是白細(xì)胞表面抗原，還有紅細(xì)胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系細(xì)胞表面抗原及其他組織細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原等，研究方法以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法為主。

2.臨床血液學(xué)中的應(yīng)用白血病的免疫分型

白血病免疫學(xué)分型是利用單克隆抗體(McAb)檢測(cè)白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)抗原（CD）,分析其表現(xiàn)型,以了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列（如髓系、紅系、淋巴系等白血病亞型）及其分化程度。對(duì)白血病細(xì)胞抗原的分析研究有助于對(duì)白血病進(jìn)行分型，為診斷和治療提供依據(jù)。

——

白血病的免疫分型

白血病分型是選擇化療方案和判斷預(yù)后的重要依據(jù)。白血病免疫分型是免疫分型的重要組成部分，對(duì)白血病的診斷、治療策略制定、預(yù)后判斷及對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的研究都具有重要作用。

2.臨床血液學(xué)中的應(yīng)用舉例：T系急性淋巴細(xì)胞白血病免疫表型特點(diǎn)（T-ALL）：根據(jù)T淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)的成熟順序，將T-ALL分為早期、中期和晚期三類(lèi)。早期T-ALL：表達(dá)CD7和CD1a，CD4、CD8及CD3均為陰性；中期T-ALL：除表達(dá)CD7和CD1a外，還表達(dá)CD2、CD5，CD4/CD8同時(shí)表達(dá)，而CD3仍為陰性；晚期T-ALL：CD3為陽(yáng)性，但丟掉CD1a，其他標(biāo)志同中期表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)CD抗原來(lái)確定白血病分期。淋巴瘤免疫分型：淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測(cè)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)抗原,分析其表現(xiàn)型,以了解被測(cè)淋巴瘤細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。如①B細(xì)胞系淋巴瘤②T/NK細(xì)胞系淋巴瘤③淋巴細(xì)胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤④造血細(xì)胞以外的腫瘤等。殘留白血病檢測(cè)：是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解后體內(nèi)殘留少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。而少量的白血病細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上難以辨認(rèn)，因此，用流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)殘存白血病細(xì)胞，指導(dǎo)治療。正常骨髓表型異常骨髓表型

2.臨床血液學(xué)中的應(yīng)用

—白血病免疫分型圖示CD38含量CD34含量

能正確區(qū)別AML和ALL，并能進(jìn)一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型。能正確鑒別AML中的M0、M6、M7

診斷雙系或雙表型白血病發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)個(gè)別次要非本系列相關(guān)抗原的白血病診斷少見(jiàn)疑難白血病(如毛細(xì)胞性白血病)

2.臨床血液學(xué)中的應(yīng)用

—免疫分型的價(jià)值

3.DNA倍體和細(xì)胞周期分析原理：

利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等)與細(xì)胞內(nèi)的DNA分子結(jié)合，這些染料經(jīng)488nm激光激發(fā)后，會(huì)發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量。

3.DNA倍體和細(xì)胞周期分析

檢測(cè)細(xì)胞周期

橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度的值，其單位是道數(shù)，可以是線形（line）或者對(duì)數(shù)（log）。

縱坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)（count）。2N

代表G0/G1期細(xì)胞4N

代表G2/M期細(xì)胞兩者中間代表S期細(xì)胞這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖。

2N4NNumberofCells

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析3.DNA倍體和細(xì)胞周期分析

含有大量非整倍體細(xì)胞G0/G1(2.8N)和G2/M(5.6N)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析3.DNA倍體和細(xì)胞周期分析

二倍體四倍體非整倍體

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析3.DNA倍體和細(xì)胞周期分析

意義：

DNA含量是隨細(xì)胞增殖分裂周期各時(shí)相的變化而變化的。

DNA含量正常與否以及各階段細(xì)胞分化情況，可作為了解腫瘤惡化程度和預(yù)后的重要參考。1,細(xì)胞增殖周期各時(shí)相細(xì)胞數(shù)的比率:在生物細(xì)胞核中，DNA含量并非恒定，隨細(xì)胞增殖周期時(shí)相不同而發(fā)生變化。因此，不同種類(lèi)的細(xì)胞，其細(xì)胞各期（G0/1期,S期,G2/M期）百分比含量是不同的。2,細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué):DNA含量隨細(xì)胞增殖周期各時(shí)相而發(fā)生變化,通過(guò)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞DNA含量,可計(jì)G0/G1,S,G2/M各增殖細(xì)胞周期所占的百分比.3,分化誘導(dǎo)治療是腫瘤化學(xué)治療的一項(xiàng)重要方面,由于靜止期(G0)細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感,而增殖期(S,G2/M)對(duì)化療敏感性高,如果將靜止期細(xì)胞采用分化誘導(dǎo)治療法,使其大量進(jìn)入增殖細(xì)胞群,再用對(duì)增殖細(xì)胞有殺傷作用的藥物,就可以殺傷大量的瘤細(xì)胞.應(yīng)用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期分析就可以觀察該種藥物的療效并作預(yù)后估計(jì).4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的主要表現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)水解酶改變：如Caspase-3活化，降解DNA（在凋亡的早期就能檢測(cè)到，隨凋亡的過(guò)程持續(xù)升高，在凋亡的晚期快速下降。連續(xù)監(jiān)測(cè)可動(dòng)態(tài)觀察凋亡的整個(gè)過(guò)程。）DNA含量下降：小分子DNA滲透到細(xì)胞外，經(jīng)PI染色后，表現(xiàn)在G0-G1期峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，稱(chēng)為凋亡峰。PI不能通過(guò)細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞進(jìn)入胞內(nèi)染色，因此具體操作時(shí)要用乙醇將細(xì)胞膜打孔，把染料引入胞內(nèi)并將細(xì)胞固定。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡表現(xiàn)

凋亡峰，凋亡細(xì)胞19%二倍體，四倍體，無(wú)凋亡峰凋亡峰，凋亡細(xì)胞68.3%4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

DNA含量法AnnexinV/PI雙染色法：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，PS（磷酯酰絲氨酸）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜表面，AnnexinV具有易于結(jié)合PS的磷脂結(jié)合蛋白。因此，建立一種用AnnexinV結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指標(biāo)并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性的檢測(cè)方法。該法使用FITC標(biāo)記AnnexinV，同時(shí)結(jié)合使用PI拒染法。B2

表示晚期凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞B1

表示早期凋亡細(xì)胞B4

表示死亡細(xì)胞B3表示活細(xì)胞4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡采用AnnixinV方法

臨床和科研工作中,可利用各種因素有目的的誘導(dǎo)或控制凋亡,選擇不同的流式染色方法研究調(diào)控因素，如藥物、放療對(duì)凋亡的影響，有助于臨床抗腫瘤、抗病毒、抗感染的藥物選擇。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板血小板膜糖蛋白復(fù)合物診斷血小板缺陷性疾病

CD41-CD61復(fù)合物：血小板無(wú)力癥

CD42a-CD42b復(fù)合物：巨大血小板癥血小板活化的相關(guān)檢查 血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63

血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板減少性疾病 血小板自身抗體檢測(cè) 網(wǎng)織血小板的檢測(cè)血小板脫落微粒的檢測(cè)5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板血小板檢測(cè)指標(biāo)血小板血小板抗體表達(dá)率：12.3%5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板血小板抗體血小板活化是血栓形成的重要環(huán)節(jié)，直接測(cè)量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應(yīng)性輔助診斷和監(jiān)控血栓性疾病包括冠心病、腦部動(dòng)脈硬化、腦梗塞、高血壓病、糖尿病等疾病的血栓并發(fā)癥，對(duì)判斷血栓前狀態(tài)意義也非常重大子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后發(fā)生急性缺血事件的危險(xiǎn)性測(cè)定凝血酶等誘導(dǎo)劑活化的血小板，即通過(guò)血小板體外活化，評(píng)估病人血小板的活化能力血栓性疾病的抗血小板治療藥物選擇與療效觀察中、老年人定期健康體檢等5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板臨床意義6.流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞6.流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞

CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)圈定細(xì)胞CD34含量0.8%CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)T淋巴細(xì)胞亞群分析和活化功能檢測(cè)移植后造血重建的監(jiān)測(cè)移植后免疫重建的監(jiān)測(cè)造血干細(xì)胞移植后免疫重建（6個(gè)月NK；9個(gè)月T、B）移植后微小殘存病灶檢測(cè)移植后巨細(xì)胞病毒感染的診斷6.流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞移植中的作用

7.樹(shù)突狀細(xì)胞檢測(cè)7.樹(shù)突狀細(xì)胞檢測(cè)：樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是一類(lèi)抗原呈遞細(xì)胞（APC），具有抗原遞呈功能，并參與免疫調(diào)控功能。樹(shù)突狀細(xì)胞的分化發(fā)育大致分為4個(gè)階段，既從髓系DC前體到未成熟期DC、遷移期DC和成熟期DC。CMRF-44，CMRF-56，CD83，CD25，共刺激分子(CD40，CD80，CD86)，及MHCII類(lèi)分子等均為DC活化/成熟過(guò)程中的標(biāo)志物，可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

當(dāng)你需要研究樹(shù)突狀細(xì)胞與免疫性疾病的關(guān)系時(shí)，可以檢測(cè)成熟DC細(xì)胞CD11c+細(xì)胞，CD123+細(xì)胞在人體中所占的比例。它們?cè)龈撸f(shuō)明患者DC呈遞抗原水平高于正常人。由于CD11c+DC是比CD123+DC更成熟的DC，因此，病變局部的CD123+細(xì)胞會(huì)比外周血中CD123+細(xì)胞增高。說(shuō)明病變局部的抗原呈遞高于周?chē)M織。8、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)的研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要功能是抑制機(jī)體免疫功能，太強(qiáng)則免疫耐受，太弱會(huì)引起自身免疫反應(yīng)調(diào)控性T細(xì)胞的表型是CD4+CD25+FoxP3+CD127low-int

腫瘤：外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞比率高者預(yù)后較差.

它與腫瘤免疫功能低下及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).監(jiān)測(cè)外周血CD4+CD25highTr細(xì)胞比率可評(píng)價(jià)腫瘤患者預(yù)后。

肝炎：CD4+CD25highTreg在慢性乙型肝炎患者高病毒載量組明顯升高,這提示Treg可能通過(guò)抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)影響病毒清除;Treg在急性肝炎早期較低,隨后增高,可能與Treg在急性肝炎的不同發(fā)病階段中所起的作用有關(guān).

異基因造血干細(xì)胞移植：Treg的動(dòng)態(tài)變化與aGVHD（急性移植物抗宿主?。┑年P(guān)系密切，可作為臨床監(jiān)測(cè)aGVHD發(fā)生的重要指標(biāo)之一

梅毒：CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的異常變化（升高）可能是梅毒患者持續(xù)陽(yáng)性或臨床癥狀反復(fù)、經(jīng)久不愈的原因所在。

9、流式細(xì)胞儀的細(xì)胞因子檢測(cè)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞因子檢測(cè)：?

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的,目前已多達(dá)60余種,細(xì)胞因子的檢測(cè)方法大致分分子生物學(xué)檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法;?

分子生物學(xué)檢測(cè)法包括多聚酶鏈反應(yīng)--PCR、原位雜交、Northern印跡試驗(yàn)和斑點(diǎn)雜交等方法,是測(cè)定細(xì)胞因子的基因水平,包括DNA和mRNA.但有時(shí)細(xì)胞雖然表達(dá)細(xì)胞因子的基因,并無(wú)分泌細(xì)胞因子的功能.?

免疫學(xué)檢測(cè)法包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法-ELISA，放射免疫檢測(cè)法-RIA，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子.與ELISA方法比較不同之處是可以確定分泌細(xì)胞因子的特異性細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)：T淋巴細(xì)胞(CD3+),T輔助細(xì)胞(CD3+CD4+),包括Th1,Th2.T抑制細(xì)胞(CD3+CD8+),包括Tc1,Tc2.Th1細(xì)胞主要是CD4+細(xì)胞分泌IL-2、IL-12、IFN-y和TNF-b/a等，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞主要是CD4+細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Tc1細(xì)胞主要是CD8+細(xì)胞分泌IFN-y、IL-2、IL-6和IL-10等。Tc2細(xì)胞主要是CD8+細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等。Th1:CD4+IFN-y+Tc1:CD8+IFN-y+Th2:CD4+IL-4+Tc2:CD8+IL-4+細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的關(guān)鍵步驟：?

活化細(xì)胞：活化T細(xì)胞---巴豆脂（PMA）+離子霉素或鈣離子載體A23187、植物血凝素(PHA）、T細(xì)胞受體或CD3的抗體等；活化B細(xì)胞---脂多糖（LPS）、金黃色葡萄球菌腸內(nèi)毒素A、B細(xì)胞受體抗體等；活化單核細(xì)胞---脂多糖（LPS）、某些細(xì)胞因子。?

阻斷劑:在活化過(guò)程中還需要加入蛋白轉(zhuǎn)移抑制物，如莫能菌素(Monensin)、布雷菲爾德菌素A(BrefildinA)，用以阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，提高陽(yáng)性率。?

細(xì)胞表面抗原染色：如CD4、CD8等。?

固定:4%多聚甲醛.?

穿孔：皂角素(Soponin).?

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。如IFN-y、IL-4等。11.淋巴細(xì)胞活化功能研究HLA-DR、CD25、CD69、CD71是T細(xì)胞活化各個(gè)時(shí)期表達(dá)的標(biāo)志性抗原，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)可以判斷出疾病的進(jìn)程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預(yù)后和治療。如CD25+/CD3+>5-10%提示排斥；12.紅細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定紅細(xì)胞CD55、CD59抗原的表達(dá)，成為診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）患者的金標(biāo)準(zhǔn)。10.間充質(zhì)干細(xì)胞造血系統(tǒng)細(xì)胞的主要來(lái)源無(wú)特異性標(biāo)記，天然數(shù)量稀少最好用流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析方法來(lái)分析一、流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介二、流式細(xì)胞術(shù)在生物學(xué)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析三、實(shí)例解析分析程序

流式細(xì)胞儀的使用一般分為三個(gè)步驟。第一，是儀器前階段，包括試劑的準(zhǔn)備，細(xì)胞制備、細(xì)胞的熒光染色；第二，是流式細(xì)胞儀階段，主要是儀器的操作；第三，是結(jié)果分析階段。樣本制備可檢測(cè)的樣本種類(lèi)多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液樣本制備直接標(biāo)記新鮮全血熒光抗體標(biāo)記溶血－－溶血素（室溫）洗細(xì)胞－－PBS（低速離心）固定－－固定液間接標(biāo)記分離PBMC,制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度106-107凍存/新鮮PBMC標(biāo)本熒光抗體標(biāo)記肝、脾、淋巴節(jié)扁桃體等組織新鮮組織標(biāo)本經(jīng)胰酶消化制備單細(xì)胞懸液溶血Ficoll梯度離心獲得PBMC細(xì)胞懸液濃度：106－107/ml活細(xì)胞的存活率>90%

計(jì)數(shù)用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10６～１×10７／ml

熒光標(biāo)記取細(xì)胞懸液100ul加入預(yù)先有特異性McAb(5～

50μl)的流式管內(nèi)，輕混勻4℃/室溫30min

用PBS2ml洗滌2次，1000rpm×5min

棄上清，加入5～50μl工作作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，搖勻4℃/室溫30min

洗細(xì)胞用PBS2ml洗滌2次，1000rpm×5min

固定加適量固定液（100～500μl)重懸細(xì)胞

上機(jī)

FCM檢測(cè)或制片后熒光顯微鏡下觀察制備高活性的細(xì)胞懸液(培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、實(shí)體組織細(xì)胞等均可用于本法)儀器的操作儀器主要分為主機(jī)部分（包括激光激活源，射流，射線探測(cè)器）和計(jì)算機(jī)部分（CELLQuestsoftwere）。儀器的操作分為使用前的準(zhǔn)備、使用中的操作和使用后的清洗。1.使用前的準(zhǔn)備（1）打開(kāi)電源：包括系統(tǒng)電源和主機(jī)部分電源。（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應(yīng)含足夠的儀器緩沖液，廢液槽應(yīng)在上次使用后清洗干凈。（3）使機(jī)器處于負(fù)亞狀態(tài)，才能使細(xì)胞懸液被吸入至機(jī)器的吸管口。（4）機(jī)器處于可應(yīng)用狀態(tài)時(shí)，指示燈會(huì)變成綠色。2.使用中的操作（1）計(jì)算機(jī)部分——使用系統(tǒng)軟件：設(shè)定所要檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量：一般設(shè)10000-20000個(gè)細(xì)胞。命名本次實(shí)驗(yàn)：一般含使用者的姓名和實(shí)驗(yàn)日期。打開(kāi)記數(shù)部分：顯示進(jìn)入的細(xì)胞數(shù)以及檢測(cè)一定量的細(xì)胞所需要的時(shí)間。將微機(jī)與主機(jī)連接：控制檢測(cè)時(shí)的預(yù)檢測(cè)和實(shí)際檢測(cè)。主機(jī)設(shè)定：一般是已設(shè)定好的適合測(cè)定淋巴細(xì)胞的條件，包括探測(cè)器的電壓。探測(cè)器的電壓是調(diào)空光電倍增管所能檢測(cè)熒光密度的范圍。選擇檢測(cè)的波長(zhǎng)和表達(dá)方式（plot）(2)細(xì)胞的吸入：將裝有細(xì)胞的FACS測(cè)定管放置到機(jī)器吸管孔處。先預(yù)檢測(cè)樣品，然后進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)?？筛鶕?jù)細(xì)胞的濃度選擇測(cè)定的速度（低、中或高）。所有的數(shù)據(jù)將自動(dòng)存入電腦。應(yīng)用舉例(一)小鼠胸腺細(xì)胞CD4及CD8分子表達(dá)的檢測(cè)a.簡(jiǎn)要說(shuō)明(1)細(xì)胞為小鼠胸腺細(xì)胞。(2)抗體為PE標(biāo)記的抗CD8抗體和FITC標(biāo)記的抗CD4抗體。b.結(jié)果以點(diǎn)狀二維圖（dotplot）表示。橫坐標(biāo)為CD8分子，縱坐標(biāo)為CD4分子。所以右上代表雙陽(yáng)性細(xì)胞群，左下代表雙陰性細(xì)胞群，左上代表CD4+CD8-的單陽(yáng)性細(xì)胞群，右下代表CD4-CD8+單陽(yáng)性細(xì)胞群。c.結(jié)果分析胸腺中存在著發(fā)育不同階段的胸腺細(xì)胞，這些發(fā)育不同階段的胸腺細(xì)胞表達(dá)CD4及CD8分子存在著差異。上面的結(jié)果是正常小鼠胸腺細(xì)胞CD4及CD8分子的表達(dá)情況：①存在著4種亞群：CD4-CD8-的雙陰性細(xì)胞群（5.6%），CD4+CD8+的雙陽(yáng)性細(xì)胞群（74.3%），CD4+CD8-的單陽(yáng)性細(xì)胞群（16.1%）和CD4-CD8+的單陽(yáng)性細(xì)胞群（4.0%）；②在這4種亞群中以CD4+CD8+的雙陽(yáng)性細(xì)胞群為主（75%）。(二)小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞和B細(xì)胞的組成1.簡(jiǎn)要說(shuō)明（1）細(xì)胞為小鼠脾細(xì)胞（2）抗體為PE標(biāo)記的抗CD3抗體和FITC標(biāo)記的抗CD19抗體2.結(jié)果以點(diǎn)狀二維圖表示。橫坐標(biāo)為CD3分子，縱坐標(biāo)為CD19分子。因此，左上為B細(xì)胞群，右下為T(mén)細(xì)胞群。3.結(jié)果分析在脾臟中主要存在有兩大類(lèi)淋巴細(xì)胞群——T細(xì)胞和B細(xì)胞。其中B細(xì)胞占60%左右，T細(xì)胞占30%。(三)活化T細(xì)胞CD69分子的表達(dá)1.簡(jiǎn)要說(shuō)明（1）成熟T細(xì)胞來(lái)自正常小鼠脾臟，經(jīng)純化而獲得，通常情況下T細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在不同濃度的抗CD3抗體的刺激下T細(xì)胞活化。（2）抗體為FITC標(biāo)記的抗CD69抗體。2.結(jié)果以直方圖表示。橫坐標(biāo)為熒光的強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為具有相應(yīng)熒光強(qiáng)度的細(xì)胞數(shù)。3.結(jié)果分析在沒(méi)有抗CD3抗體刺激時(shí)，絕大多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)的T細(xì)胞不表達(dá)CD69分子在低劑量抗CD3抗體刺激下，42.4%的T細(xì)胞表達(dá)CD69分子；在高抗CD3抗體刺激下，54.3%的T細(xì)胞表達(dá)CD69分子。說(shuō)明靜止的T細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)較少的CD69分子，而活化的T細(xì)胞則表達(dá)高水平的CD69分子，并且該分子的表達(dá)隨著活化的強(qiáng)度而增加。因此，檢測(cè)CD69分子可作為T(mén)細(xì)胞活化的標(biāo)志。（四）白血病免疫分型流式檢測(cè)過(guò)程流式細(xì)胞儀不僅可檢測(cè)細(xì)胞表面的抗原，通過(guò)運(yùn)用破膜-固定劑.還可在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核抗原。在檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)抗原時(shí)，特別要注意確認(rèn)試劑是不是會(huì)影響細(xì)胞光散射信號(hào)，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞表而膜和細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核抗原，更能夠協(xié)助我們做出臨床診斷。

(1)急性白血病免疫分型單標(biāo)記抗體的選擇用流式細(xì)胞儀檢測(cè)常用的單克隆抗體均為異碴氨酸熒光景(FITC).藻紅蛋白(PE)及PerCP標(biāo)記的直標(biāo)抗體。B淋巴系統(tǒng)單抗有CD10，CD19、CD20、CD22等；T淋巴系統(tǒng)單抗有CD2、CD3、CD5、CD7等，粒細(xì)胞系統(tǒng)(粒系)單抗有CD13、CD14、CD15、CD33等；干細(xì)胞及巨核細(xì)胞系單抗有CD34、CD41、CD61、HLA-DR等。（2）急性白血病雙標(biāo)記抗體的的選擇CD3/CDI9，區(qū)分T淋巴系和B淋巴系CD10/CD33(CD20/CD13)，區(qū)分粒系、B淋巴系或診斷混合型白血病CD41,巨核系標(biāo)記CD34、HLA-DR、CD9,與上述抗體結(jié)合使用鑒別未分化型急性白血病，MPO(粒系過(guò)氧化物酶)，胞質(zhì)染色，用于MO之診斷GPA/CD36，可用于M6的診斷(GPA+/CD36+為早期紅系細(xì)胞，GPA+/CD36-為成熟紅細(xì)胞),另外，對(duì)T淋巴系尚應(yīng)做CD7、CD4、CD8等檢測(cè)，粒系應(yīng)作CDI4、CDI5(M4或M5時(shí)陽(yáng)性)檢測(cè)巨核系可加作CD42a、CD42b檢測(cè)。(3)免應(yīng)表型的處理程序細(xì)胞表面抗原檢測(cè)的染色方案1、取20μl單克隆抗體與100μl抗凝血，共同混合置室溫20min;2、加溶血素500μI.置室溫避光15min，2000轉(zhuǎn)離心5min;3、棄上清，加500μIPBS重懸，上儀器檢測(cè)：以CD45-PerCP/SSC設(shè)門(mén)，觀察每群細(xì)胞免疫表型。細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)抗原檢測(cè)的染色方案1、在試管中加入染膜外抗原單抗或陰性對(duì)照，在每一試管中加入大約1x106個(gè)細(xì)胞，混勻后，避光孵育15min.2、再加入100ul的試劑A，避光孵育15min.3、用3mlPBS洗滌1次.1500轉(zhuǎn)離心5min，去上清4、加入100ulB液和相應(yīng)的膜內(nèi)標(biāo)記抗體或陰性對(duì)照.5、混勻后，孵育20min，3mlPBS洗滌1次.6、1500轉(zhuǎn)離心5min，去上清，用0.5mlPBS重新懸浮.7、上機(jī)分析.(4)流式細(xì)胞術(shù)用于自血病免疫分型中的注意事項(xiàng)1、如檢測(cè)標(biāo)本內(nèi)混有正常細(xì)胞和異常細(xì)胞，結(jié)果解釋需結(jié)合臨床指征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè).在報(bào)告細(xì)胞標(biāo)志物結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮到有許多免疫標(biāo)志物井