學(xué)習(xí)情境九微生物的分離純化與保藏技術(shù)

學(xué)習(xí)情境九微生物的分離純化與保藏技術(shù)第一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日微生物純化、分離的原因自然界中，微生物都是以群居的方式存在的在人為條件下培養(yǎng)的微生物群體稱為培養(yǎng)物(culture)只有一種微生物的培養(yǎng)物稱作純培養(yǎng)物(pureculture)第二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日純培養(yǎng)的過(guò)程通過(guò)分離、純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物接種技術(shù)無(wú)菌操作技術(shù)第三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日一、接種技術(shù)接種工具

接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀第四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日無(wú)菌技術(shù)(aseptictechnique)在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)，防止其被其它微生物污染的技術(shù)純培養(yǎng)物

環(huán)境第五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日二、微生物分離純化技術(shù)分離(isolation)：從混雜微生物群體中獲得只含有某一種微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。用固體培養(yǎng)基分離用液體培養(yǎng)基分離單細(xì)胞分離富集分離第六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日1.利用固體培養(yǎng)基分離原理：微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)第七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日1.利用固體培養(yǎng)基分離值得指出的是：在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到

視頻錄像第八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日（1）稀釋傾注平板法（pourplatemethod）先將待分離的材料用無(wú)菌水作一系列的稀釋（如1∶10、1∶100、1∶1000…）然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出出菌落如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)第九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日傾注平板第十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）涂布平板法（spreadplatemethod）

將含菌的樣品加入還比較燙的瓊脂培養(yǎng)基，再倒平板，易造成某些熱敏感菌的死亡某些好氧菌會(huì)在瓊脂中間缺氧影響生長(zhǎng)第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日涂布vs.傾注第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日(3)平板劃線分離法（streakplatemethod）

第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日(3)平板劃線分離法（streakplatemethod）連續(xù)稀釋的過(guò)程第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日平板劃線分離的方法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日2.用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)稀釋法原理：連續(xù)稀釋，使一只試管里分配不到一個(gè)微生物如果大多數(shù)平行稀釋管里沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物就是純培養(yǎng)物第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日3.單細(xì)胞挑取分離法

第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日4.富集分離法利用選擇培養(yǎng)基創(chuàng)造只讓所需微生物生長(zhǎng)的條件，所需微生物有效地與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落。如分離專性寄生菌，須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群中，使其大量生長(zhǎng)。多次重復(fù)移種便可得到純的寄生菌。

第二十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日附：一些操作技術(shù)圖片培養(yǎng)第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日倒平板第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日isolationplate第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日移接斜面常用的接種方法劃線接種點(diǎn)接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日純化（平板劃線法）倒平板——?jiǎng)澗€——培養(yǎng)——挑菌落——純種（純培養(yǎng)）

第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日任務(wù)二微生物菌種保藏技術(shù)第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日一、菌種的衰退與復(fù)壯的

1.衰退：菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

2、菌種的復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

菌種的復(fù)壯措施：

純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）；

通過(guò)寄主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）；

淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）；

采用有效的菌種保藏方法。第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

3、防止菌種衰退的方法：

控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過(guò)程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8～10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）；

選擇合適的培養(yǎng)條件；

采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）；

采用有效的菌種保藏方法。第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

二、菌種保藏1、目的：

存活，不丟失，不污染；

防止優(yōu)良性狀喪失；

隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種。第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日2.原理選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等）創(chuàng)造降低微生物代謝活動(dòng)強(qiáng)度，生長(zhǎng)繁殖受抑制難以發(fā)生突變的環(huán)境條件（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)等）添加保護(hù)劑第三十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

3.菌種保藏的方法

菌連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種種生活態(tài)傳代培養(yǎng)保藏法連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在合適的載體上第三十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，2022年，8月28日

方法：

①低溫保藏法：

方法：菌種管置4℃冰箱保藏，定時(shí)傳代。

原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降。

②石蠟油低溫保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。

③干燥保藏法將菌種置于土壤、細(xì)紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時(shí)間幾至