探討PF4對(duì)As斑塊穩(wěn)定性的可能影響,病理學(xué)論文

探討PF4對(duì)As斑塊穩(wěn)定性的可能影響,病理學(xué)論文動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是一個(gè)慢性炎癥性疾病。業(yè)以證明,血小板活化后可釋放大量的趨化因子,行使著除了止血以外的強(qiáng)大的炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)As的發(fā)展。血小板因子4(plateletfactor4,PF4)是血小板活化后釋放的最豐富的蛋白之一,不僅存在于As的早、晚期病變,且與病變分級(jí)、臨床異常感覺和狀態(tài)等臨床參數(shù)相關(guān),表示清楚PF4在As的發(fā)展中起重要作用。已有研究顯示PF4可誘導(dǎo)炎癥型巨噬細(xì)胞構(gòu)成、單核細(xì)胞黏附于受損的內(nèi)皮等炎癥經(jīng)過(guò)。鑒于PF4與As臨床疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性,PF4在As中的作用有待更深一步的研究。由血管炎癥引發(fā)的異常血管重塑在As發(fā)生發(fā)展中起主導(dǎo)作用?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)作為炎性細(xì)胞因子在血管重構(gòu)、斑塊不穩(wěn)定性及其破裂中起著重要作用。在重構(gòu)的血管,MMP-9被大量的表示出、分泌和活化。巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞是血管組織MMP-9的重要來(lái)源。而炎性因子如腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素等可誘導(dǎo)MMP-9表示出。但PF4對(duì)MMP-9表示出的影響還未見文獻(xiàn)報(bào)道。Toll樣受體4(toll-likereceptor4,TLR4)是天然免疫中介導(dǎo)細(xì)胞跨膜信號(hào)傳導(dǎo)的Toll樣受體家族成員。研究顯示在人As斑塊中TLR4的表示出顯著提高;活化的TLR4可上調(diào)MMP-9表示出、降解基質(zhì)蛋白;在大鼠模型中,TLR4高表示出可促進(jìn)大鼠As斑塊的構(gòu)成和血管重構(gòu)。因而,本研究觀察PF4對(duì)巨噬細(xì)胞MMP-9表示出的影響及TLR4在華而不實(shí)的作用,旨在討論P(yáng)F4對(duì)As斑塊穩(wěn)定性的可能影響。1、材料與方式方法1.1主要材料重組人血小板因子4(PF4)購(gòu)自Peprotech公司,脂多糖(LPS)購(gòu)自上海捷瑞公司,fo波脂(PMA)購(gòu)自Sigma公司,胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物研究所,RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司,TLR4抗體型阻斷劑購(gòu)自Biolegend公司,TrizolRe-agent和引物分別從上海生物工程技術(shù)有限公司購(gòu)買和合成,cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Fermentas公司,TaqPCRMasterMix以及DNAMarker購(gòu)自北京天根公司,MMP-9一抗購(gòu)自北京博奧森生物公司,TLR4一抗購(gòu)自eBioscience公司。THP-1單核細(xì)胞系購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。1.2細(xì)胞培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞在含10%胎牛血清的RP-MI1640培養(yǎng)基中,靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前,細(xì)胞用160nmol/LPMA孵育24h,使其誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞。換無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,同步化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。巨噬細(xì)胞分別經(jīng)PBS(溶劑對(duì)照)、不同濃度PF4(25~200g/L)、脂多糖(LPS,100g/L)處理4h或12h,RT-PCR和Westernblot檢測(cè)MMP-9和TLR4表示出;為進(jìn)一步研究TLR4在華而不實(shí)的作用,細(xì)胞經(jīng)TLR4阻斷劑(25g)預(yù)處理30min后,再與PF4孵育特定時(shí)間,檢測(cè)MMP-9表示出。1.3RT-PCR反響收集細(xì)胞,TrizolReagent試劑提取總RNA。各樣本取0.2g總RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒講明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用TaqPCRMasterMix試劑進(jìn)行PCR循環(huán):95℃溫育5min,95℃變性45s,54℃退火45s,72℃延伸1min,共32個(gè)循環(huán),72℃,繼續(xù)延伸10min。4℃冷卻。反響結(jié)束后,取反響產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,UVP型凝膠圖象分析系統(tǒng)攝圖。TLR4、MMP-9和GAPDH產(chǎn)物大小依次為507bp、476bp和240bp。以各組目的基因與GAPDH灰度值比值代表目的基因的mR-NA相對(duì)表示出量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4Westernblot分析收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。取50g蛋白質(zhì)參加5SDS凝膠上樣緩沖液,煮沸100℃變性5min。取變性蛋白質(zhì)行12%SDS電泳,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉,參加一抗TLR4抗體、抗MMP-9抗體和抗-actin抗體,4℃過(guò)夜。TBST洗膜。參加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2h。發(fā)光劑激發(fā)熒光,顯影、定影后進(jìn)行圖像分析。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值比值,作為各組間蛋白相對(duì)表示出量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用xs表示。用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,兩組間比擬用Studentst檢驗(yàn),多重比擬在ANOVA分析后用Dunnetts-t檢驗(yàn)。P0.05為差異有顯著性意義。2、結(jié)果2.1PF4上調(diào)THP-1源性巨噬細(xì)胞MMP-9表示出THP-1源性巨噬細(xì)胞未經(jīng)處理時(shí),細(xì)胞有MMP-9mRNA表示出。細(xì)胞經(jīng)不同濃度PF4(25~200g/L)處理4h后,RT-PCR結(jié)果顯示(圖1),與對(duì)照組比,細(xì)胞MMP-9mRNA水平隨著PF4濃度的增加而逐步升高。華而不實(shí),最大效應(yīng)濃度為100g/L(P0.001),且高于LPS組的MMP-9mRNA水平(P0.01;表1)。與MMP-9mRNA水平一致的是,經(jīng)不同濃度(25~200g/L)PF4處理12h后,THP-1源性巨噬細(xì)胞MMP-9的蛋白水平也較對(duì)照組顯著上調(diào),當(dāng)PF4濃度為100g/L時(shí),MMP-9蛋白水平增高最為明顯(P0.01,圖1和表1)。2.2PF4上調(diào)THP-1源性巨噬細(xì)胞TLR4表示出對(duì)照組細(xì)胞有TLR4mRNA表示出。經(jīng)不同濃度的PF4孵育后,與對(duì)照組比擬,25g/L和50g/L的PF4對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4的mRNA表示出水平無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用,然而100g/LPF4顯著上調(diào)TLR4的mRNA表示出水平(P0.001),與LPS陽(yáng)性對(duì)照組比擬,TLR4的mRNA表示出水平顯著上調(diào)(P0.05,圖2和表2)。PF4濃度達(dá)200g/L時(shí),TLR4mR-NA表示出水平略有降低,但仍高于對(duì)照組。Westernblot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比擬,100g/LPF4顯著上調(diào)TLR4的蛋白表示出水平(P0.05;圖2和表2),與基因水平的檢測(cè)結(jié)果基本一致。2.3TLR4阻斷劑逆轉(zhuǎn)PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表示出為了探尋求索PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9表示出能否通過(guò)TLR4信號(hào)環(huán)節(jié),實(shí)驗(yàn)采用TLR4阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞后,觀察PF4對(duì)巨噬細(xì)胞MMP-9表示出的影響,RT-PCR和Westernblot(圖3)結(jié)果均顯示,參加TLR4阻斷劑后,其MMP-9mRNA和蛋白表示出水平均較PF4單獨(dú)孵育組顯著降低(P0.05)。同時(shí),LPS和TLR4阻斷劑共處理組的MMP-9mRNA和蛋白表示出水平也較LPS單獨(dú)孵育組低(P0.05),表示清楚TLR4是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞MMP-9表示出的重要環(huán)節(jié)(表3)。3、討論血小板作為多功能細(xì)胞,不僅在止血經(jīng)過(guò)中起作用,而且在炎癥、免疫和As等多種病理經(jīng)過(guò)中起重要作用。新近的觀點(diǎn)以為,活化的血小板通過(guò)釋放多種活性因子影響As的發(fā)展。在諸多的活性因子當(dāng)中,PF4的含量最豐富,被以為是巨噬細(xì)胞成熟和血小板活化的標(biāo)記物。值得注意的是,在As性疾病患者血液中PF4水平較正常對(duì)照者顯著增高。但PF4在As的發(fā)生發(fā)展中起何種作用尚未說(shuō)明。人PF4基因位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂,全長(zhǎng)1000bp,含有3個(gè)外顯子,是小誘導(dǎo)基因(thesmallinduc-iblegene,SIG)家族中的一員。SIG家族成員的基因組的外顯子構(gòu)造極其類似,且其蛋白質(zhì)的氨基酸序列有同源性,都含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基。SIG在凝血、感染、細(xì)胞生長(zhǎng)方面扮演重要角色。大量研究表示清楚,PF4在血栓和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊構(gòu)成中起重要作用。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PF4可誘導(dǎo)單核細(xì)胞存活、表示出細(xì)胞因子、構(gòu)成氧自由基和黏附于受損的內(nèi)皮;誘導(dǎo)炎性巨噬細(xì)胞(無(wú)CD163表示出)構(gòu)成;抑制低密度脂蛋白受體(lowdensitylipopro-teinreceptor,LDLR)降解、促進(jìn)LDL氧化;誘導(dǎo)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)與血管細(xì)胞和巨噬細(xì)胞結(jié)合等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲除血小板PF4基因,可減少ApoE-/-小鼠As病變面積。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PF4可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表示出MMP-9,且TLR4介入此經(jīng)過(guò)。結(jié)果顯示,PF4能夠促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞MMP-9的表示出。THP-1源性巨噬細(xì)胞經(jīng)不同濃度PF4(25~200g/L)處理后,MMP-9的mR-NA和蛋白水平均隨著PF4濃度的增加而逐步升高,尤其以濃度為100g/L時(shí)升高最為顯著?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrixmetalloproteinases,MMP)不僅僅是一種能分解細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白酶類,也是連接炎癥和血管重構(gòu)的炎癥介質(zhì)。研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽的厚度直接影響斑塊的穩(wěn)定性,纖維帽越薄則斑塊越易破裂。纖維帽主要由膠原纖維與平滑肌細(xì)胞構(gòu)成。MMP-9是降解膠原的主要酶類之一,嚴(yán)重影響斑塊的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)研究表示清楚,腫瘤壞死因子等多種炎性因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等表示出和分泌大量的MMP-9。而局部MMP-9含量增加不僅降解細(xì)胞外基質(zhì)、促使平滑肌細(xì)胞從中膜遷移入內(nèi)膜并增殖,還誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞遷移、募集和黏附至血管壁,使血管壁細(xì)胞增殖或凋亡;在MMP-9基因缺失的小鼠,As斑塊內(nèi)膠原含量增加,而巨噬細(xì)胞含量減少、斑塊面積縮小。臨床研究發(fā)現(xiàn),急性腦梗死的患者外周血MMP-9的水平明顯升高,提示MMP-9可能介入腦梗死的病理經(jīng)過(guò)。新近研究發(fā)現(xiàn),血清MMP-9水平與人頸動(dòng)脈總斑塊分?jǐn)?shù)、斑塊不穩(wěn)定性獨(dú)立相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PF4促進(jìn)巨噬細(xì)胞MMP-9表示出上調(diào),提示PF4可能通過(guò)促進(jìn)MMP-9的表示出,加劇血管炎癥反響及斑塊的不穩(wěn)定性。TLR是固有免疫細(xì)胞膜上辨別系統(tǒng)的重要組成部分。TLR4是TLR家族成員,在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及心肌細(xì)胞表示出。TLR4可通過(guò)辨別LPS、熱休克蛋白60等,介入免疫調(diào)節(jié)和炎癥反響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PF4(100g/L)顯著上調(diào)TLR4的mRNA和蛋白表示出水平。文獻(xiàn)報(bào)道LPS可激活TLR4。本實(shí)驗(yàn)以LPS為陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果顯示,與100g/LLPS比擬,100g/LPF4能上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9和TLR4表示出。TLR4阻斷劑是一種抗體型阻斷劑,本研究發(fā)現(xiàn),TLR4阻斷劑可逆轉(zhuǎn)PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞MMP-9的表示出,表示清楚TLR4是PF4上調(diào)巨噬細(xì)胞