EnzymeThermistor的乳品安全快速分析技術

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Y謝斌瑞典Lund大學純與應用生物化學系武漢2013.03EnzymeThermistor

-酶熱生物傳感技術及其乳品安全的快速分析什么是生物傳感器?電活性物質電極pH變化pH電極熱量熱敏電阻光光敏元件質量變化壓電晶體酶抗體微生物細胞分子識別信號傳感電信號生物傳感器原理生物量熱–一種萬能的生物分析平臺生物反應中的熱量變化是一種常見形式酶-底物催化的特異性生物反應產(chǎn)生足夠的熱量測量系統(tǒng)對光、濁度、電等不敏感采用差分量熱，環(huán)境溫度變化影響小極高的分析精度（<10-5℃)適合于有機相熱敏傳感器無需校正樣品（如，血液、奶等）一無需預處理，可直接進樣分析采用流動注射分析，檢測快速、成本低（約1元人民幣/樣品）可連續(xù)、在線分析早期設計樣品酶Peltier器件酶熱敏電阻樣品酶流動管熱敏電阻熱酶電阻(a)靜態(tài)分析(b)靜態(tài)或流動分析(c)流動分析酶熱生物分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理信號放大固相酶柱酶熱傳感器流動泵進樣閥進樣管路緩沖載液酶熱生物分析儀生物固相固態(tài)表面固相及摧化反應酶熱生物傳感原理ΔT=ΔH·nρCγTrTmSCΔT=Tm-TrCγ:反應器熱容量ΔH:反應中熱焓的變化nρ:反應物摩爾數(shù)S:底物P:產(chǎn)物P酶催化熱焓變化●多數(shù)酶催化反應為放熱反應,ΔH<0-ΔH=-100kJ/mol為典型的過氧化物酶和氧化酶的熱焓，其它酶在同一數(shù)量級氧化酶可與過氧化物酶共同固相-ΔH變化疊加，增加熱信號-消除過氧化氫危害，穩(wěn)定了酶活性-產(chǎn)生額外的50%氧●Tris緩沖液能加大質子熱焓，從而對如，蛋白酶等增加約-47kJ/mol的熱量傳感裝置參數(shù)流速:0.5-2ml/mL樣品量:0.01-1mL測量時間:1-6min酶柱容量:0.2-1mL固相酶量:>50units/柱固相材料:CPG,傳感器:熱敏電阻傳感器酶柱進樣樣品環(huán)：50-500μL酶柱內徑（I.D）:1-2mm酶柱容量：0.5to1mL

固定化酶方法（戊二醛共價交聯(lián)）可控多孔(120-160nm)玻璃珠(CPG):瓊脂糖凝膠:CL-6B網(wǎng)狀玻化碳（RVC）溶膠凝膠固定化細胞方法鈣果膠凝膠海藻酸鈣凝膠細胞嵌入瓊脂糖顆粒酶熱生物傳感電極酶柱裝載電極置位檢測條件設置檢測響應信號性能特點是一種萬能的生物分析平臺。原理上只要存在相應的酶，就能對其底物進行特異的檢測

傳感器與流動樣品隔離，不受光，電和化合物的直接干擾，無需經(jīng)常校正

無需對待測樣品，如全血、發(fā)酵液、奶等進行預處理，可直接進樣分析

可進行現(xiàn)場的連續(xù)、在線分析，如發(fā)酵過程檢測和血糖動態(tài)監(jiān)測

可實現(xiàn)多分析物的同步檢測和分析

酶柱可反復使用數(shù)百次，檢測成本低，并易于更換

測量快速（約1-5分鐘/樣品），操作簡便，可實現(xiàn)自動檢測分析

已實現(xiàn)商品化和系列產(chǎn)品，并能根據(jù)用戶的特殊要求打造

除酶分析外，還可用于細胞、微生物、酵母、ATP等分析

應用領域●

臨床分析，如糖尿病●發(fā)酵過程監(jiān)測，如青霉素發(fā)酵●食品安全檢測分析，如乳品中非法添加劑青霉素、

β-內酰胺酶等●環(huán)境污染分析，如持續(xù)有機污染物氯酚、重金屬、農(nóng)藥殘留物等●生物分析中，如酶分析、免疫分析、細胞分析、微生物分析、DNA分析等●遠程健康監(jiān)測

已檢測的分析物實例乳品安全快速檢測分析

牛奶非法添加劑Illegaladditionofβ-lactamasewasdiscoveredinChina,in2007.Accordingtothereport,β-lactamaseactivitywasfoundin49outof77individuallypackedmilksamplescollectedfrom5retailstoresin3cities.Someofthesesampleshadextremelyhighβ-lactamaseactivity.TheministryofhealthofthePeople’sRepublicofChinaincludedβ-lactamaseintoitsnewlypublished“blacklist”ofillegalfoodadditives.β-內酰胺酶檢測MethodsHPLCCylinderplatemethodchromogenicmethodDisadvantagesSamplepreparationTimeconsuming:24hr/testTimeconsuming:30min-24hr/testModifiedcylinderplatemethod:beta-lactamaseactivityisdefinedasadifferencebetweentheinhibitoryzonesofthetestsamplesandcontrolsamples.Chromogenicmethod:hydrolyticactivityofbacterialfl-lactamaseswasestimatedbythemeasurementofabsorbancechangesofnitrocefinandpiridinium-2-azo-p-dimethylamilinechromophase(PADAC).乳品快速檢測裝置β-內酰胺酶響應待測奶樣品乳品中β-內酰胺酶檢測β-內酰胺酶檢測分析是基于這一原理:即，將特異性的酶催化反應與精確的流動量熱分析結合起來，從而實現(xiàn)獨一無二的、快速的乳品分析。其檢測原理如下圖所示。測量方法和結果1.Calibration1.Effectofflow-rate2.Effectofsamplevolume3.Effectofmilkcontents牛奶中β-內酰胺酶的檢測響應0.25U/ml0.5U/ml1.0U/ml2.0u/ml5.0U/mlControl01020304050607080

Time（min）Penicillinaseactivitydeterminedinmilkwith3%fatand50%(v/v)dilution.1mMpenicillinG,flowrateof0.5ml/minandthesamplevolumeof350μlwereapplied.

不同方法優(yōu)缺點對比costpersampleTime(min/sample)ContinuityDetectionlimitModifiedETmethod≈0.1$6minSemi0.5u/mlCylinderplatemethod[5]n/a>24hrNo4u/mlChromogenicmethod[7]n/a30min~24hrn/a0.49u/mlET特點分析方法簡單、儀器操作方便

待測奶樣品無需特殊預處理測量快速（約5-7分鐘/每樣品）

檢測成本低（約1元人民幣/每樣品）靈敏度高（β-內酰胺酶的檢測低于0.5U酶活性/ml奶樣品）適合原料奶、奶制品和其他液態(tài)食品中的β-內酰胺酶的檢測可用于其它酶的檢測或酶底物的分析乳腺炎奶檢測牛乳腺炎影響奶質量，嚴重的會引起人體中毒，因此需要嚴格控制原料乳中的乳腺炎感染狀況。乳腺炎奶通常其乳酸的含量會增加數(shù)十倍。測量乳品中的乳酸含量不僅可控制原料乳的質量，還可追蹤成品乳制品的產(chǎn)奶牛的健康狀況。因此，乳品中乳酸的檢測對于控制乳品質量具有非常重要的意義。牛奶中的乳酸的檢測Comparisonoftheresultsofbuffersamplesandmilksamples.(A)buffersamples,withflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.(B)1:1dilutedmilksampleswithflow-rateof0.75ml/minandsamplevolumeof250μL.分析結果固相酶柱在34天后其活性維持在82.5%（每天測量0.5mM的乳酸數(shù)次）

牛奶樣品（1：1稀釋）的乳酸檢測精度為62

μM檢測線性范圍0.06–1mM以上（用乳酸氧化酶）檢測時間5分鐘/樣品奶中尿素的檢測兩分析物檢測原理多指標檢測系統(tǒng)ReferencesignalMeasurementsignalCalorimetriccylinderPeristalticpumpWasteBufferInjectionvalveReferencecolumnMeasurementcolumnThermistorsReferenceprobe乳品中乳酸和尿素的同步檢測雙通道ET的乳酸和尿素檢測

A3A4B3B4UreainSMlactateinSMlactateinVL乳酸和尿素的檢測比對Thecorrelationsofureadeterminationsintwodifferenttypeofmilksbefore(A1)andafter(A2)substractingthereferencesignalofthebackground(A4)fromthemeasurementsignal(A3).Similarly,thecorrelationsforlactatebefore(B1)andafter(B2)subtractingthebackground(B4)fromthemeasurements(B3).感謝！

聯(lián)系方式：電話中國手機）

+46707686216(瑞典手機）郵箱：bin.xie@tbiokem.lth.se瑞典地址：PureandAppliedBiochemistry,Box124,S-22100Lund,Sweden中國地址：歐米克生物科技（武漢）有限公司，武漢東湖新技術開發(fā)區(qū)華光大道18號，高科大廈8058室，郵編430074。電人簡介

1982年畢業(yè)于華中工學院電子工程系,獲工學學士1988年畢業(yè)于同濟同科大學生物醫(yī)學工程專業(yè),獲醫(yī)學碩士1996年畢業(yè)于瑞典Lund大學純與應用生物化學系,獲博士學位1997-1998年在