細(xì)胞培養(yǎng)概述

第一章細(xì)胞培養(yǎng)概述主講:況海斌Ph.D南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室計(jì)劃生育生殖內(nèi)分泌研究室khb9909@課程安排:第一次：細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史（略講）、細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)（重點(diǎn)理解其原理，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室要求的理解，如進(jìn)出培養(yǎng)間要關(guān)好每一扇門）。實(shí)驗(yàn)器械清洗、包裝和清毒（清洗要領(lǐng)、清洗液的配配制和使用的期限、包裝的具體步驟：如何包裝培養(yǎng)瓶，清毒的方式、壓力與時(shí)間。第二次：實(shí)驗(yàn)室常用儀器、設(shè)備的使用與維護(hù)：凈化臺(tái)（使用的區(qū)域、物品的擺放、操作方式、消毒、穢物處理）；自動(dòng)雙重純化水蒸餾器（使用與注意事項(xiàng)）；培養(yǎng)液的過濾器（簡(jiǎn)單與自動(dòng)抽氣泵的過濾器使用介紹、操作關(guān)鍵點(diǎn)）；清毒器（種類、消毒時(shí)間、壓力、和注意事項(xiàng)），CO2培養(yǎng)箱（使用及注意事項(xiàng)）；干燥箱；液氮生物容器；冰箱；顯微鏡；倒置顯微鏡；熒光顯微鏡；天平；酸度計(jì)；電泳儀；PCR儀；離心機(jī)；振蕩器，搖菌搖床等相關(guān)設(shè)備。第三次：細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)液（基）：水的要求；平衡鹽溶液（種類與配制）；消化液（種類與配制）；谷氨酰胺補(bǔ)充液；抗生素溶液的配制；培養(yǎng)基顏色要求與變化代表的意義；小牛血清的批號(hào)、滅活與分裝；天然培養(yǎng)基；常見合成培養(yǎng)基種類、如何配制、分裝與貯存。第四次：細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：原代細(xì)胞分離（培養(yǎng)前準(zhǔn)備、無菌操作的注意事項(xiàng)具體的流程）、培養(yǎng)（酶消化法和組織塊培養(yǎng)法、如何計(jì)數(shù)、接種密度）。細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的觀察（培養(yǎng)液顏色與透明度的變化、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞形態(tài)變化、微生物污染、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類型、細(xì)胞培養(yǎng)中的常用術(shù)語）；培養(yǎng)細(xì)胞一代生長(zhǎng)過程（分期及特點(diǎn)）；蓋玻片條細(xì)胞培養(yǎng)法；細(xì)胞傳代（消化酶、傳代的比例、及注意事項(xiàng)）；凍存與復(fù)蘇（凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融；凍存和復(fù)蘇具體操流程）。細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)（如細(xì)胞污染判斷、觀察與處理原則）。第五次：細(xì)胞培養(yǎng)的研究方法：活力的檢測(cè)（死、活細(xì)胞鑒別；凋亡細(xì)胞檢測(cè)）；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法、MTS法以及BrdU法）；細(xì)胞和細(xì)胞器分離與培養(yǎng)（速度、等密度、流式細(xì)胞分離技術(shù)）；細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究方法（細(xì)胞固定、常用染色法、細(xì)胞免疫組化，免疫熒光法）；細(xì)胞克隆技術(shù)（細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)）。第六次：具體原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)流程及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（如心肌分離與培養(yǎng)、從作者論文來分析論文設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵過程）。第七次：干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)流程、及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（使學(xué)生了解長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)流程、注意事項(xiàng)、以及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程、鑒定的流程和相關(guān)的指標(biāo)）。第八次：細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)（質(zhì)粒序列選擇、酶切位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)、如何連接、接種，挑選陽性菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，以及產(chǎn)物鑒定。磷酸鈣共沉淀法基因轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。了解病毒轉(zhuǎn)染法和RNA干擾技術(shù)。）第九次：胚胎技術(shù)：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集程序、小鼠胚胎培養(yǎng)步驟、小鼠胚胎與小鼠子宮上皮共培養(yǎng)步驟、小鼠子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)、小鼠外胎盤錐的培養(yǎng)、外胎盤錐與蛻膜細(xì)胞的共培養(yǎng)、人絨毛的分離與培養(yǎng)、胚胎移植技術(shù)、顯微操作技術(shù)）第十次：參觀與討論：

主要參考書：1.《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)》作者：程寶鸞，出版社：中山大學(xué)出版社2．《細(xì)胞培養(yǎng)》作者：司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正出版社：世界圖書出版公司3.《小鼠發(fā)育生物學(xué)與胚胎實(shí)驗(yàn)方法》作者：金巖出版社：人民衛(wèi)生出版社4.《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》作者：安德拉斯.納吉翻譯:孫青原主要內(nèi)容:一、細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展史（略講）:二、細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)（重點(diǎn)理解其原理）:三、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室無菌的基本要求:四、如何準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)器械清洗、包裝和清毒):一、組織培養(yǎng)發(fā)展簡(jiǎn)史

（一）發(fā)展史

1878ClaudeBernard:

證明一個(gè)器官在個(gè)體死亡以后仍然可以人工維持。

1885WilhelmRoux:

首次采用了“Tissueculture”這個(gè)名詞。

1887RossHarrison:

利用的青蛙淋巴液作為培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)青蛙神經(jīng)嵴，維持其活性達(dá)數(shù)星期，并觀察到了RossHarrison被稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父。

RossHarrison早期培養(yǎng)1898年Ljunggren

將人體皮膚保存在腹水中幾天至幾周后再移植手術(shù)獲得成功。1903年Jolly

用玻片懸滴法培養(yǎng)蜂螺白細(xì)胞存活近一個(gè)月1906年Beebe等用動(dòng)物血清培養(yǎng)狗的傳染性淋巴瘤細(xì)胞達(dá)72小時(shí)。1910Burrows:

率先在血漿凝塊中長(zhǎng)期培養(yǎng)雞胚細(xì)胞.

培養(yǎng)器材：Harrison（1906）通過采用單蓋片懸滴培養(yǎng)法,用淋巴液培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織數(shù)周，從此標(biāo)志著體外培養(yǎng)組織細(xì)胞的基本模式的建立。Carrel（1923）設(shè)計(jì)了卡氏培養(yǎng)瓶，進(jìn)一步研究細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)問題。Strengeway（1926）設(shè)計(jì)了表玻璃培養(yǎng)法，為研究動(dòng)物器官在體外的發(fā)育與功能作出貢獻(xiàn)。以及現(xiàn)在培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿的發(fā)展。組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖1948Fisher:

研制成了第一個(gè)化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006，該培養(yǎng)液至今還在使用。1951年Eagle開發(fā)了能促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的人工合成培養(yǎng)基。1952Gey

和同事：分離培養(yǎng)了Hela細(xì)胞。

1952Dulbecco:

發(fā)明了噬斑法，用長(zhǎng)滿的單層細(xì)胞檢測(cè)病毒。

培養(yǎng)基（液）：1955年Dulbecco發(fā)明了用胰蛋白酶消化分離組織細(xì)胞的方法，建立了單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。1961Hatflick&Moorhead:

顯示人成纖維細(xì)胞在一定的代數(shù)之后會(huì)死亡。1965Ham:

配制了第一個(gè)無血清培養(yǎng)液。1975Kohler&Miltein:

成功的得到了第一個(gè)用于單抗生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞株。（二）我國(guó)組織、細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展：20世紀(jì)30年代傳入我國(guó)。20世紀(jì)50年代起步。20世紀(jì)70年代，成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中普遍應(yīng)用的手段。（三）細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

1、活細(xì)胞：

能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)。

2、可控制：

選擇對(duì)象：均一性、重復(fù)性（類型、性質(zhì)、階段）調(diào)節(jié)條件：各種因素（物理、化學(xué)、生物等因素）利用方法：研究技術(shù)、記錄方法

3、應(yīng)用廣：

領(lǐng)域多：醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)、基因工程等

對(duì)象廣：各種動(dòng)物（低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類）

一種動(dòng)物（不同年齡、不同組織）

正?；虍惓＃[瘤）

4、較經(jīng)濟(jì)：

可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。優(yōu)點(diǎn)（四）細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)：

人工模擬的培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)相比仍然存在一定差異，培養(yǎng)的細(xì)胞或組織，其形態(tài)或功能會(huì)發(fā)生不同程度的改變。

與體內(nèi)主要不同

相對(duì)孤立、相對(duì)單一、缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。

主要表現(xiàn)

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱、細(xì)胞趨向單一化。

提示

要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。

缺點(diǎn)：二、細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)（一）細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施

無菌實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)恒溫培養(yǎng)箱其他設(shè)備（電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）1、無菌實(shí)驗(yàn)室：設(shè)計(jì)原則：防治微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵。1、無菌實(shí)驗(yàn)室：總的要求：抽風(fēng)過濾系統(tǒng)無菌實(shí)驗(yàn)室：組成：更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)與幾個(gè)操作間相通。操作間：放在內(nèi)間，供無菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。2、超凈工作臺(tái)：超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

其它老師專門講述實(shí)驗(yàn)室儀器：恒溫培養(yǎng)箱其他設(shè)備（電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、恒溫水域鍋、消毒器、抽濾裝置等）3、如何維護(hù)無菌環(huán)境：保持無菌的基本要求：（1）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：分門別類制定操作卡片，實(shí)驗(yàn)前按卡片收集、清點(diǎn)、清洗及消毒所需物品，一并放入無菌操作臺(tái)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備數(shù)要大于使用數(shù)，瓶蓋數(shù)要大于瓶數(shù)。（2）無菌室及操作野消毒實(shí)驗(yàn)前無菌室及無菌操作臺(tái)(超凈臺(tái))以紫外燈照射30分鐘滅菌，打開抽風(fēng)系統(tǒng)，抽風(fēng)大約20分鐘，進(jìn)入培養(yǎng)室。以70%ethanol擦拭無菌操作臺(tái)面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。(3)無菌操作要求無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

(3)無菌操作要求：小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn).容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。在整個(gè)無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的火焰前方進(jìn)行,瓶口、吸管、注射器使用前要經(jīng)過火焰消毒后使用。試劑用后立即封閉瓶口。專管專用，勤換吸管。瓶口液滴不能倒回瓶?jī)?nèi)，液滴用干酒精棉球擦拭，瓶口再經(jīng)火焰消毒。蓋瓶時(shí)瓶口和瓶蓋經(jīng)火焰消毒。(4)實(shí)驗(yàn)后要求實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面（一般先用加入新潔而滅或84的液體清洗）。關(guān)閉超凈臺(tái)燈、風(fēng)和電源。未使用過的器材放入飯盒中，用過的器材清水浸泡。(5)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的日常維持：實(shí)驗(yàn)室維持：

實(shí)驗(yàn)室的日常維持是動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室所必須進(jìn)行的。在實(shí)驗(yàn)室工作的每一位研究人員都應(yīng)該被安排在一定范圍內(nèi)承擔(dān)實(shí)驗(yàn)室維持工作任務(wù)，以便使實(shí)驗(yàn)室保持在一個(gè)好的工作狀態(tài)和工作秩序。(5)實(shí)驗(yàn)室日維持任務(wù)——廢物容器和廢液體應(yīng)帶出細(xì)胞培養(yǎng)室，并在每天工作完成后將其清除。如果有培養(yǎng)物污染而需要廢棄時(shí)，應(yīng)立刻從培養(yǎng)室移出，并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作的所有人員，在每天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作的前、后，用適當(dāng)?shù)南緞?如70%～75%酒精)擦拭工作臺(tái)面。

(6)實(shí)驗(yàn)室月維持任務(wù)——實(shí)驗(yàn)室月維持任務(wù)很少經(jīng)常進(jìn)行，但至少應(yīng)該定期進(jìn)行一次。如果實(shí)驗(yàn)室有多臺(tái)培養(yǎng)箱連續(xù)工作，每月應(yīng)有1臺(tái)培養(yǎng)箱停止運(yùn)行，進(jìn)行清理和保養(yǎng)，拆解培養(yǎng)箱，對(duì)各個(gè)培養(yǎng)室部件進(jìn)行消毒(我們半年進(jìn)行一次,每月會(huì)更換孵育箱的水)。定期進(jìn)行培養(yǎng)箱溫度和CO2水平的校正，如果具有自動(dòng)調(diào)零功能，至少應(yīng)1年1次，最好半年進(jìn)行1次自動(dòng)調(diào)零。四、如何準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)分門別類制定操作卡片，實(shí)驗(yàn)前按卡片收集、清點(diǎn)所需物品，進(jìn)行相應(yīng)清洗、包裝與消毒。實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備數(shù)要大于使用數(shù)（瓶蓋數(shù)要大于瓶數(shù)）。（一）一般需要準(zhǔn)備物品：1、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)液、消化液以及PBS）。2、離心管、吸管、蓋子、TIP管、凍存管、燒杯、量筒、容量瓶、飯盒,培養(yǎng)皿3、槍頭（TIP頭）4、培養(yǎng)板與培養(yǎng)皿5、手術(shù)器械。（二）實(shí)驗(yàn)器材的清洗、包裝和消毒

細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料

制品的清洗與消毒1、清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗（1）玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、干燥、浸酸和沖洗等步驟清洗后的玻璃器皿干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等先用自來水簡(jiǎn)單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)，再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會(huì)損害器皿表面光澤度干燥：50-560C浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對(duì)玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時(shí)間：一般為過夜，不應(yīng)少于6小時(shí)清潔液常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）

強(qiáng)清潔液63∶1000∶200次強(qiáng)清洗液120∶200∶1000

弱清潔液100∶100∶1000清潔液的配制配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色

沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置（超聲波洗滌器）如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次（喜歡浸泡過夜），晾干備用（2）膠塞的清洗新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH

或洗衣粉煮沸10-20分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用（3）塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時(shí)用2%NaOH

浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用2、包裝

組織培養(yǎng)的器皿要清洗晾干。在消毒前必須進(jìn)行包裝，以便消毒及儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包裝的方法：3、消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染消毒滅菌方法：物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小時(shí)過濾：0.22μm化學(xué)消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無菌室內(nèi)的壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素（主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染）物理消毒滅菌方法——干熱消毒在烤箱中進(jìn)行，主要用于消毒玻璃器皿。干熱消毒后的器皿干燥，易于保存。缺點(diǎn)是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要用較高的溫度和較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到消毒的目的，需加溫到160℃，保持90~120min方能殺死芽胞。消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。濕熱消毒是一種很有效的消毒方法，一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行。高壓消毒可在50、10、15、20磅的壓力下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間可為10、15、20、30min。根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時(shí)間，一般物品（如布類、金屬器械、玻璃器皿等）消毒的要求是15磅20min，有些常規(guī)使用液體要消毒15磅15min，橡膠用品為10磅10min。煮沸消毒可用于注射器及某些用具的快速消毒，缺點(diǎn)是濕度太大。故濕熱消毒后要進(jìn)行干烤：但過濾器不能干烤。紫外線消毒紫外線直接照射消毒是目前各實(shí)驗(yàn)室常用的方法之一，主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作臺(tái)表面及桌椅等消毒。但在房?jī)?nèi)安裝不能高于2.5米，要使各處能有0.06微瓦/cm2能量照射，否則影響消毒效果。也可以用紫外線消毒一些塑料培養(yǎng)器皿。缺點(diǎn)是有臭氧產(chǎn)生，污染空氣，影響身體健康。過濾除菌消毒

有很多組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體不能采用高壓消毒的方法進(jìn)行滅菌處理，目前培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長(zhǎng)因子等具有生物活性物質(zhì)的液體等，這些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能。因而上述液體多采用濾過消毒以除去細(xì)菌。濾器有抽吸（抽濾）式及加壓式兩種類型；濾板（或?yàn)V膜）結(jié)構(gòu)可為石棉板、玻璃或微孔膜。常用的濾器Zeiss濾器玻璃濾器微孔濾膜濾器這種濾器的基本結(jié)構(gòu)為金屬結(jié)構(gòu)，其中間為一種一次性的特制混合纖維素脂濾膜?？捎糜诎ㄑ逶趦?nèi)的各種培養(yǎng)液體的過濾除菌，速度較快，效果較好，現(xiàn)已為許多實(shí)驗(yàn)室所使用。濾膜的規(guī)格很多，主要根據(jù)濾器的直徑大小而劃分其型號(hào)，可按待濾過液體的量來選擇適當(dāng)?shù)男吞?hào)。用于小量培養(yǎng)液時(shí)，可選用2.5cm直徑濾器，以注射器推動(dòng)為壓力而過濾。微孔濾膜濾器可為加壓式（正壓式）或抽濾式，以加壓式更佳。以濾過除菌時(shí)，最好使用0.22μm孔徑的濾膜（可以除去細(xì)菌和霉菌）。由于濾膜很薄，在濾器的上層和下層的相應(yīng)部位各有一凹槽以放置一硅膠墊圈來固定、壓緊濾膜。安裝濾膜時(shí)要注意；濾膜薄而且光滑，容易移動(dòng)，千萬不能裝偏而使過濾失??；同時(shí)要注意濾膜的正反面，正面（光面）應(yīng)向上。由于濾膜薄，承受壓力有限，力量不能過大、過猛，以免造成濾膜破裂。如何安裝微孔濾膜濾器：化學(xué)方法消毒劑組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中也可利用消毒劑來進(jìn)行滅菌處理，消毒劑主要是75%酒精、過氧乙酸、乳酸、來蘇兒等化學(xué)制劑?？煞謩e用于操作人員的皮膚、實(shí)驗(yàn)臺(tái)、器械、器皿的操作表面，實(shí)驗(yàn)室的椅、桌、墻壁、地面及空氣等的處理。如：75%酒精最為常用，用途也最廣泛；0.1%新潔爾滅可以對(duì)器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦試和浸泡清毒；乳酸可用于空氣消毒；來蘇兒對(duì)皮膚有刺激性，可用于地面的消毒；過氧乙酸是一種新的消毒劑，消毒能力很強(qiáng)，在0.5%濃度下，10min可將芽孢菌殺死。

抗菌素也常在組織細(xì)胞培養(yǎng)工和中使用，但多數(shù)是為了預(yù)防。要注意的是不能完全依賴抗菌素來達(dá)到消毒滅菌。常用的抗菌素為青霉素及鏈霉素。小結(jié)：消毒方法的選擇實(shí)驗(yàn)室中空氣的消毒，最理想是采用過濾系統(tǒng)，并與恒溫設(shè)備結(jié)合使用，但價(jià)格較貴。亦可用紫外線消毒，但安置紫外線燈時(shí)要符合要求（使用壽命指UV燈管在相同能量輸入而產(chǎn)生的可利用紫外線強(qiáng)度不夠）

。另外尚可用乳酸等蒸氣或電子滅菌燈消毒。實(shí)驗(yàn)臺(tái)的消毒處理，最常用的是以酒精擦拭，亦可以紫外線照射。消毒方法的選擇：培養(yǎng)器械的消毒：多數(shù)培養(yǎng)用的器材常用干熱或濕熱消毒，不能耐高溫的塑料制品，可用消毒劑浸泡或紫外線照射。培養(yǎng)用液體的消毒：鹽溶液及一些不會(huì)因高溫破壞其成份的溶液，常采用高壓蒸汽消毒。血漿、血清等生物性的天然培養(yǎng)基，不能以高壓蒸汽消毒，必須用過濾方法除菌；合成液體培養(yǎng)基也采用過濾除菌的方法。5、準(zhǔn)備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)：第一講內(nèi)容：超凈臺(tái)

超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

濾器

CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。自動(dòng)雙重純水蒸餾器純水儀酶標(biāo)儀微孔板震蕩器培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

圖3-1研究用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室參考平面圖實(shí)驗(yàn)服、拖鞋氣塞門層流凈化罩水池pH計(jì)天平離心機(jī)離心機(jī)顯微鏡顯微鏡頂柜層流凈化臺(tái)層流凈化臺(tái)層流凈化臺(tái)垂直疊放培養(yǎng)箱層流凈化臺(tái)垂直疊放培養(yǎng)箱離心機(jī)-20℃無菌貯藏柜4℃顯微鏡顯微鏡計(jì)數(shù)儀頂柜無菌貯藏柜無菌貯藏柜無菌貯藏柜恒溫培養(yǎng)箱恒溫水浴鍋垂直疊放培養(yǎng)箱垂直疊放培養(yǎng)箱液氮生物容器AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

必需設(shè)備清洗設(shè)備浸泡缸或浸泡槽深洗槽吸管缸吸管清洗器高、低溫干燥烘箱滅菌器(高壓蒸汽滅菌器、高壓鍋)干熱滅菌烘箱4℃冰箱-20℃冰箱天平蒸餾水器純水儀超凈工作臺(tái)CO2培養(yǎng)箱5％CO2鋼瓶(用于通氣培養(yǎng))液態(tài)CO2鋼瓶倒置顯微鏡臺(tái)式離心機(jī)液氮生物容器(約35L，放1500～3000個(gè)凍存管)液氮儲(chǔ)存容器(約25～35L)用于細(xì)胞冷凍的低速冷凍器用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的磁力攪拌器血球計(jì)數(shù)器AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

有益的非必需設(shè)備磁力攪拌器pH計(jì)蠕動(dòng)泵或真空泵移液器移液塞溫室溫度記錄儀(用于滅菌烘箱、高壓蒸汽滅菌鍋)生物顯微鏡體視顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡吸管干燥器自動(dòng)分裝器臺(tái)車或手推車旋轉(zhuǎn)架(用于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng))CO2管道供氣設(shè)備CO2鋼瓶自動(dòng)轉(zhuǎn)換裝置細(xì)胞計(jì)數(shù)器AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

有用的輔助裝置

玻璃器皿清洗機(jī)-70℃～-80℃冰箱電導(dǎo)儀滲透壓儀聚乙烯袋封口機(jī)(用于包裝長(zhǎng)期保存的無菌物品)計(jì)算機(jī)(圖象儲(chǔ)存、冷凍儀記錄、細(xì)胞系基本數(shù)據(jù)處理)打印機(jī)集落計(jì)數(shù)器大容量離心機(jī)(6LxlL)離心分選機(jī)離心機(jī)和轉(zhuǎn)子顯微鏡視頻攝像和顯示器定時(shí)視頻裝置細(xì)胞大小測(cè)量?jī)x便攜式溫度記錄儀塑料切碎器廢物滅菌器程序冷凍儀熒光激活的細(xì)胞分選儀（如流式細(xì)胞儀）共聚焦顯微鏡微量滴定板閃爍計(jì)數(shù)器AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

表3-3培養(yǎng)器皿特性表3-3培養(yǎng)器皿特性

表3-3培養(yǎng)器皿特性培養(yǎng)器皿特性培養(yǎng)器皿培養(yǎng)物備份每孔面積/cm2每孔推薦液體量/ml預(yù)計(jì)的HeLa細(xì)胞產(chǎn)量多孔板微量滴定板960.320.1l×105微量滴定板1440.320.11×1054孔板4225×1056孔板69.62～42×10612孔板124.51～31×10624孔板2420.5～25×10548孔板4810.25～1—96孔板9610.05～0.1—AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

培養(yǎng)器皿培養(yǎng)物備份每孔面積/cm2每孔推薦液體量/ml預(yù)計(jì)的HeLa細(xì)胞產(chǎn)量培養(yǎng)皿直徑30mm16.921.7×10635mm19.62～32×10650mm117.53～44×10660mml2l3～55×10690nnn149101×107培養(yǎng)器皿特性AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

培養(yǎng)器皿特性培養(yǎng)器皿培養(yǎng)物備份每孔面積/cm2每孔推薦液體量/ml預(yù)計(jì)的HeLa細(xì)胞產(chǎn)量培養(yǎng)瓶10號(hào)11022×10625號(hào)12555×10675號(hào)l7510～502×107125號(hào)l12525～1005×107150號(hào)l15025～1006×107175號(hào)l17550～1007×107225號(hào)122550～1001×108滾瓶18502002.5×108攪拌瓶500ml(機(jī)械攪拌)1505×1075000ml(吹氣攪拌)140004×109AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

動(dòng)物細(xì)胞的工程化操作是基于無菌(asepsis)條件下進(jìn)行的，需要建立一套滿足無菌操作(asepticmanipulation)技術(shù)和無菌培養(yǎng)(asepticculture)的環(huán)境。有了這些基礎(chǔ)，就可以通過無菌操作過程獲得動(dòng)物組織、器官和細(xì)胞等無菌培養(yǎng)物，并在適宜環(huán)境條件下生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖。歸納起來，實(shí)驗(yàn)室要具備進(jìn)行洗滌、儲(chǔ)藏、準(zhǔn)備、滅菌、無菌操作、培養(yǎng)和檢測(cè)等6項(xiàng)主要功能。按照這些功能要求，動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室一般分為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作區(qū)和無菌操作區(qū)兩大主要區(qū)域，可按照具體執(zhí)行的功能再進(jìn)行細(xì)分，各個(gè)功能區(qū)域都應(yīng)配備有專用儀器設(shè)備和器材。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及主要儀器設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室功能要求與規(guī)劃布局AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

1．洗滌區(qū)用于各種實(shí)驗(yàn)用具和實(shí)驗(yàn)材料的洗滌。

2．普通貯藏區(qū)用于各種實(shí)驗(yàn)器皿、培養(yǎng)液、化學(xué)藥品等放置。

3．培養(yǎng)液配制區(qū)用于培養(yǎng)液滅菌前試劑的稱量、稀釋等。如果培養(yǎng)液的市場(chǎng)供應(yīng)便捷，小型實(shí)驗(yàn)室不必自備培養(yǎng)液。但對(duì)從事細(xì)胞培養(yǎng)工作人數(shù)較多的大型實(shí)驗(yàn)室來說，用自備培養(yǎng)液較為經(jīng)濟(jì)，需要有專門的培養(yǎng)液配制區(qū)。4．滅菌區(qū)熱穩(wěn)定溶液和耐熱器材的高壓蒸汽滅菌或干熱滅菌工作在非無菌的準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)進(jìn)行，滅菌區(qū)用于動(dòng)物細(xì)胞操作器械、物品及培養(yǎng)液的滅菌，滅菌后存放到無菌儲(chǔ)藏柜或?qū)Ｓ脽o菌貯藏區(qū)。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及主要儀器設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室功能要求與規(guī)劃布局(一)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備區(qū)功能要求及配置原則AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作區(qū)的各個(gè)區(qū)域的設(shè)置應(yīng)彼此相鄰，以方便操作。當(dāng)然最好的設(shè)置是將實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作區(qū)與細(xì)胞培養(yǎng)與胚胎工程無菌操作區(qū)分開，但在分開的同時(shí)最好與無菌操作區(qū)相近且無臺(tái)階阻隔，以便于工作進(jìn)行及方便使用手推車、臺(tái)車，若它們之間僅相隔一個(gè)走廊最理想的。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及主要儀器設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室功能要求與規(guī)劃布局(一)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備區(qū)功能要求及配置原則AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室無菌操作區(qū)主要分為緩沖準(zhǔn)備區(qū)、操作液體和培養(yǎng)液的無菌配制區(qū)、無菌儲(chǔ)藏區(qū)、培養(yǎng)物無菌操作區(qū)、培養(yǎng)區(qū)及鑒定分析區(qū)。操作液體等無菌配制區(qū)和培養(yǎng)物無菌操作區(qū)，以及培養(yǎng)區(qū)和鑒定分析區(qū)也可以合并使用。條件允許時(shí)，應(yīng)有專門的無菌儲(chǔ)藏區(qū)或配備專用的無菌物品儲(chǔ)藏柜。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及主要儀器設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室功能要求與規(guī)劃布局(二)無菌操作區(qū)功能要求及配置原則AnimalCellBiotechnology——CollegeofVeterinaryMedicine——MABao-hua動(dòng)物細(xì)胞工程的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)

1．標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室無菌操作區(qū)(1)緩沖準(zhǔn)備區(qū)(2)操作液體無菌配制區(qū)(3)無菌儲(chǔ)藏區(qū)(4)培養(yǎng)物無菌操作區(qū)(5)培養(yǎng)區(qū)(6)鑒定分析區(qū)2．層流凈化實(shí)驗(yàn)室層流凈化實(shí)驗(yàn)室（laminar-flowlaboratory）第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及主要儀器設(shè)備一、實(shí)驗(yàn)室功能要求與規(guī)劃布局(二)無菌操作區(qū)功能要求及配置原則AnimalCellBiotechnology——