薄層色譜掃描法

薄層色譜掃描法中藥二室

一、薄層色譜掃描法簡介二、影響薄層掃描定量的因素三、介紹CAMAG薄層掃描儀一、薄層色譜掃描法簡介1、簡述

薄層色譜掃描法是指用一束一定波長、一定強度的紫外或可見光對薄層板進行掃描，測定薄層板上的樣品斑點對光的吸收強度或斑點經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強度。所得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)可用于藥品的鑒別、檢查及含量測定。

中藥材：山豆根、槲寄生、女貞子、牛黃、兩面針、黃連等；中成藥：六味地黃丸（濃縮丸）、元胡止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、九分散等;2、檢測方法(1)吸收法:掃描時測定薄層板上的樣品斑點對光吸收強度的方法。(2)熒光法:測定樣品斑點經(jīng)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光強度的方法。(3)熒光淬滅法:利用某些化合物減弱吸附劑中熒光劑的紫外吸收強度而進行定量的方法。由于薄層板各部分熒光強度不均勻,對定量不太適用,而是便于斑點的定位。3、測量方式

(1)透射法：測定照射光穿透樣品斑點后光的吸收情況。(2)反射法：樣品斑點對照射光的反射情況進行測定的方法。4、測光形式

(1)單波長掃描：使用一種波長的光束對薄層進行掃描。適用于分離度好，背景干擾小的薄層色譜。(2)雙波長掃描：用測定波長和參比波長分別掃描薄層后，測定樣品斑點在兩波長下的吸收度之差，可減少分離度欠佳的組分間的相互干擾，并減少薄層板的背景干擾，能顯著改善基線的平穩(wěn)性。操作時應(yīng)選擇待測斑點無吸收或最小吸收的波長作為參比波長。5、掃描方式

(1)線性掃描：用一束比待測斑點略寬的狹窄光帶沿展開方向做單向等速掃描。適于形狀較規(guī)則斑點的掃描。在進行熒光測定時一般只用線性掃描。(2)鋸齒掃描：使用微小正方形光束沿展開方向掃描的同時，在垂直于展開方向進行往復(fù)式掃描，掃描過程中光束的運動軌跡呈鋸齒形或矩形，它對于形狀不規(guī)則或分布不均勻的斑點掃描重復(fù)性較好，但掃描速度較慢。6、定量方法

(1)外標(biāo)法：如果標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)過原點，可用一點法校正；如果不通過原點，采用二點法校正，必要時用多點校正法。測定時，供試品溶液和對照品溶液應(yīng)交叉點于同一薄層板上，每份供試品溶液點樣不得少于2個，對照品每一濃度不得少于2個，其計算結(jié)果的相對平均偏差不得大于5%。計算公式:C=kA+b(kA+b)×稀釋倍數(shù)點樣量×稱樣量(2)內(nèi)標(biāo)法：將內(nèi)標(biāo)加入供試品溶液和對照品溶液中以峰面積的比值為定量依據(jù).由于內(nèi)標(biāo)物的選擇比較困難，目前應(yīng)用較少。內(nèi)標(biāo)物：a.在樣品溶液中加入一種在樣品溶液中不存在的，

b.性質(zhì)與被測物質(zhì)類似且又與樣品中被測成分得易分離的純化物，7、系統(tǒng)適用性試驗

（1）檢測靈敏度：指用于限量檢查時，被測成分能被檢出的最低量。（2）分離度：用于限量檢查或含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度,應(yīng)大于1.0。（3）重復(fù)性：指同一薄層板上同一供試品溶液相同濃度的數(shù)個斑點，掃描結(jié)果的偏差。不顯色直接掃描，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于3.0%，顯色后掃描，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5.0%。二、影響薄層掃描定量的因素

（一）吸附劑性能及薄層質(zhì)量1、吸附劑：（1）吸附劑顆粒大小，分布均勻程度能影響分離度和檢出限度。小顆粒且分布均勻的吸附劑，分離度好，靈敏度高。（2）吸附劑的含水量影響薄層活度，如果大氣濕度過大，吸附劑含水量過高，導(dǎo)致薄層活度過低，就會影響分離效果，所以在點樣前薄層板應(yīng)進行活化在110℃干燥30分鐘。（一）吸附劑性能及薄層質(zhì)量2、薄層：薄層厚度會影響定量結(jié)果，厚度下降，展開后斑點擴散較嚴(yán)重，影響定量結(jié)果。用透射法測定時，峰面積值隨薄層厚度下降而減小，用反射法測定，峰面積值隨薄層厚度下降而增加。因此對吸附劑及薄層性能的規(guī)格化是薄層色譜重現(xiàn)性及定量準(zhǔn)確性的先決條件。薄層板的種類

硅膠G板、硅膠GF254板、硅膠H板、氧化鋁板。硅膠G板以石膏作為黏合劑；硅膠GF254板是添加熒光指示劑；常用的熒光指示劑有兩種:一種是錳激活的硅酸鋅（Zn2SiO4:Mn）,在254nm波長下能發(fā)出熒光;另一種是銀激活的硫化鋅、硫化鎘（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波長下能發(fā)出熒光。我們常用的是硅膠GF254板。硅膠H板是沒有外加黏合劑。氧化鋁板以氧化鋁作為固定相，可以分離萜類，生物堿類，脂肪族及芳香族化合物。（二）點樣

1、一般為圓點狀或窄細(xì)的條帶狀;

點樣基線距底邊10-15mm;

圓點狀直徑一般不大于3mm;

條帶寬度一般為5-10mm;

點間距離不少于8mm。2、點樣是薄層色譜的第一步,也是關(guān)鍵的一步,它既關(guān)系到能否得到可以重現(xiàn)的薄層色譜,也關(guān)系到定量測定結(jié)果的準(zhǔn)確與否,點樣量不宜過大,最好控制在10μl以下,點樣過多或原點“超載”,展開劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象,使斑點拖尾或重疊,致使掃描峰形不對稱,或達(dá)不到基線分離。(三)展開

1、預(yù)飽和薄層各個部分對展開劑蒸氣的預(yù)吸附程度不同,會影響色譜分離，因此當(dāng)用展開劑時，先將薄層及展開缸進行預(yù)飽和,以便得到重現(xiàn)的色譜圖。2、相對濕度：50%-60%較適宜相對濕度過大影響薄層活度,吸附劑吸附能力下降,分離效果不理想。3、溫度:一般18-25℃較適宜溫度變化會影響組分在兩相間的分配,被分離物質(zhì)的Rf值應(yīng)在0.2-0.8較適合,Rf值太大,斑點易擴散,掃描重現(xiàn)差,Rf值太小,斑點沒有完全展開,掃描結(jié)果不能代表真實濃度。4、邊緣效應(yīng)：同一化合物，在同一塊薄層板上,用同一混合展開劑，在同一展開槽內(nèi)展開后，薄層中間部分的斑點比薄層兩側(cè)邊緣處的斑點的Rf值小。

用展開劑將展開缸及薄層板飽和后再進行展開就可以消除邊緣效應(yīng)，飽和時間的長短因展開劑極性以及比例不同而異。5、展開劑(1)展開劑過多次數(shù)的重復(fù)使用，也會影響Rf值的穩(wěn)定。多次使用展開劑時，實際上每一次的展開劑的組成,由于揮發(fā)、吸附等原因已有改變。最好是臨用新配，這樣每次展開劑少量、定量使用，以足夠展層一次的用量為宜。

(2)每一種溶劑在展開中都有其一定的作用：a.展開劑中比例較大的溶劑起溶解物質(zhì)和基本分離的作用，極性相對較?。篵.展開劑中比例較小的溶劑,極性較大，對被分離物質(zhì)有較強的洗脫力，幫助化合物在薄層上移動，可以增大Rf值，但不能提高分辨率；c.展開劑中加入少量酸、堿可抑制某些化合物的斑點拖尾；比如：六味地黃丸測定山茱萸中的熊果酸，展開劑是：環(huán)己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20：5：8：0.1）d.展開劑中加入丙酮等中等極性溶劑可使不相混合的溶劑混溶，并可以降低展開粘度，加快展速。6、展距:一般為8-15cm

在這種展距內(nèi)得不到分離的組分,增加展距并非解決問題的辦法,不僅延長了分離的時間,而且會引起斑點擴散反而降低分離度,因此,展距內(nèi)分離不理想時,不能一味的增加展距,而是可以優(yōu)化展開劑,以得到理想的結(jié)果。

由此可見,展開時必須控制條件一致，得到重現(xiàn)的分辨率最佳的色譜，才能得到可靠的定性定量結(jié)果。（四）顯色

顯色劑必須與樣品定量反應(yīng),且靈敏度要高,專屬性要強,色點穩(wěn)定性好。

常用的是噴霧法顯色,分為自動噴霧、手動噴霧。自動噴霧的霧滴均勻而細(xì),比手動噴霧得到的背景吸收小,重現(xiàn)性及定量準(zhǔn)確度高。需注意的是：噴完顯色劑后,需加熱顯色的,應(yīng)注意控制加熱的溫度和時間，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，溫度過高或加熱時間過長易焦化，如果用硫酸等顯色劑可使板面炭化而影響顯色效果；加熱時間不夠，導(dǎo)致斑點未顯出或顯色不完全；有的成分加熱的溫度和加熱的時間不同.顯色效果是有差別的。

將顯色的薄層板避光保存，以同樣大小的玻璃板覆蓋并密封，可增加色斑的穩(wěn)定性。（五）薄層掃描定量（1）色譜條件不優(yōu)化，操作技術(shù)不規(guī)范得到的色譜很差，就不可能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。（2）輸入薄層掃描儀的參數(shù)不合理也會影響定量的準(zhǔn)確性，掃描方向應(yīng)保持一致，應(yīng)沿展開方向掃描,不宜垂直于展開方向掃描。

總之，要得到理想的色譜分離及準(zhǔn)確的定量結(jié)果，色譜條件的標(biāo)準(zhǔn)化，操作技術(shù)的規(guī)范化是十分重要的。三、介紹CAMAG薄層掃描儀

1、基本原理日本島津生產(chǎn)的CS系列儀器瑞士CAMAG公司的薄層掃描儀基本原理：就是用一束長寬可以調(diào)節(jié)的一定波長、一定強度的光照射到薄層斑點上進行整個斑點的掃描，用儀器測量通過斑點或被斑點反射的光束強度的變化達(dá)到定量的目的。2、基本用途

（1）定性—光譜測定在波長200-800nm之間進行斑點原位掃描，測得該化合物的吸收曲線及最大吸收，并與對照品比較從而對樣品中該成分進一步確證。CAMAG公司的WINCATS軟件有斑點光譜圖的儲存功能，因此可對斑點光譜進行檢索，可隨時與分析樣品或標(biāo)準(zhǔn)進行對比。（2）定量—色譜測定，前面已經(jīng)介紹了定量方法：外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法等。3、CAMAG薄層掃描的組成部分

（1）半自動點樣儀：注意：樣品溶液應(yīng)澄清，防止溶液中的沉淀堵塞點樣針。（2）數(shù)碼照相系統(tǒng)暗箱:可見光、254nm紫外光、及365nm紫外光光源。注意：薄層照相前應(yīng)揮干溶劑，防止溶劑污染,腐蝕儀器。(3)薄層掃描儀(1)由光源、單色器、薄層板臺、檢測器、WINCATS工作站組成。(2)光源：鎢燈：可見光區(qū)370-800nm

氘燈：紫外區(qū)190-450nm

汞燈：220-650nm注意：（1）儀器使用過程中，當(dāng)長時間不進行掃描（約2小時），應(yīng)把儀器內(nèi)部的三個光源燈（D2，W，Hg）通過手動控制面板熄滅