外源基因在小鼠體內(nèi)的表達

外源基因在小鼠體內(nèi)的表達1980年至1982年三年的時間里，外源蛋白在小鼠體內(nèi)表達的概念從一個想法變成現(xiàn)實。在此期間幾個實驗室致力于引入新的基因和外源表達蛋白，首先是在小數(shù)的胚胎十細胞內(nèi)，其次是成熟的小鼠體內(nèi)。拉爾夫Brinster和理查德Palmiter是這一領(lǐng)域的先驅(qū)。在1981年，他們首次演示了病毒基因在小鼠體內(nèi)的表達。背景：用一個有效的方法來研究基因和控制他所編碼的蛋白在細胞和整個生物體的表達。DNA重組技術(shù)問世之前，生物學家通過將外源的mRNA注入青蛙的卵母細胞來研究mRNA所編碼蛋白的生物活性。分子生物學革命使得基因被融合到特意的啟動子上，從而使他們在所需的細胞系內(nèi)表達。使得生物學家可以研究人工培養(yǎng)細胞的基因的功能，他們甚至想研究活機體的基因。這需要特定外源基因在胚胎肝細胞內(nèi)的表達，將外源基因引入到動物基因組中，并檢測其在生物體內(nèi)的功能。在1970s初期，Brinster表明，外源基因可以通過將癌細胞注射到中年鼠的由早期囊胚形成的胚胎干細胞內(nèi)，使其在小鼠體內(nèi)表達的方法來實現(xiàn)。然而這種方法使得外源基因在所需的細胞類型中表達是非常困難的。這需要將外源基因?qū)胄∈蟮幕蚪M內(nèi)。1980年生物學家表明可以將含有DNA的病毒質(zhì)粒注入到小數(shù)的受精卵中，然后檢測新生小鼠中的病毒序列。這個實驗是確定外源基因整合到小鼠基因組中形成的功能性蛋白能否表達。實驗：Brinster的挑戰(zhàn)是設(shè)計這樣一個方案，設(shè)計一個簡單明了的實驗證明外源蛋白存在于小鼠內(nèi)。要做到這一點，Brinster選擇了一個表達容易測定的酶，而不是他的具有生物學意義的第一只轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白，他選擇的是單純皰疹病毒(HSV)的酪氨酸激酶，這個選擇有幾個優(yōu)點，首先，這個基因來源于人類病毒，其序列與小鼠的內(nèi)源基因不同，可以更容易的整合的小鼠的基因組中。其次磷酸酪氨酸激酶可以根據(jù)放射性標記的胸腺嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)化為胸苷一磷酸來測定。最后HSV的胸苷激酶活性的抑制劑不能抑制小鼠內(nèi)源酶的活性。使得研究人員能夠明確的檢測外源蛋白的活性。基因結(jié)合在蛋白編碼區(qū)DNA序列的上游的啟動子區(qū)被表達的，啟動子能夠控制何時、何地的基因被表達，病毒基因在小鼠體內(nèi)的表達需要生物學家去除啟動子控制區(qū)的基因，并使病毒基因去啟動子融合且在小鼠細胞內(nèi)具有活性。Brinster與Palmiter合作，研究了小鼠小鼠金屬硫蛋白-1(MT-1)基因的啟動子，Palmiter將HSV胸苷激酶基因融合到小鼠金屬硫蛋白-1(MT-1)基因的啟動子上，這樣可以確認是否一個外源蛋白能在小鼠體內(nèi)表達。為了產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因小鼠，Brinster與Palmiter將含有HSV胸苷激酶和MT-1啟動子融合基因的質(zhì)粒注射到小鼠受精卵的細胞核中，再將其植回到雌性小鼠體內(nèi)，科學家使其與正常的小鼠交配，并分析子代小鼠中含HSVDNA量和胸苷激酶的活性。用Southern印跡分析，他們檢測了MT-1啟動子/胸苷激酶融合基因，被稱為轉(zhuǎn)基因。他們分離出基因組DNA，然后用限制性核酸內(nèi)切酶切割，根據(jù)切割的DNA片段的大小利用瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，兩個科學家后用雜交放射性標記的探針對膜進行分析。分析顯示，該基因已被成功地整合到四個子代小鼠的基因組中。接著，為了確定轉(zhuǎn)基因是否表達了功能性蛋白，Brinster和Palmiter在小鼠MT-1高表達的肝臟勻漿中分析胸苷激酶的活性，該小鼠肝組織勻漿含有比

其同窩小鼠的肝組織勻漿約200倍以上的胸苷激酶活性。這只小鼠是轉(zhuǎn)基因整合到基因組中的四只中的一只。為了證明這種活性的增加是病毒胸苷激酶表達的結(jié)果，他們利用抑制劑作用于肝臟勻漿，特異性的阻斷了HSV胸苷激酶的活性。抑制劑作用后轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟勻漿中胸苷激酶的活性顯著降低，而沒有轉(zhuǎn)基因的小鼠肝臟勻漿中的激酶的活性沒有改變。（表8.1）從而Brinster和Palmiter證實病毒胸苷激酶活性的存在，并表明外源蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達在小鼠。|ExpressionofViralThymidineKinaseinTransgenicMiceMouseTransgencDNAThymidineKinaseActivity—Inhibitor-I-Inhibitor—Inhibitor-I-Inhibitor23-123-21450023-123-214500497,000[AdaptedfromR.L.Brinsteret1981,Ceti27:223-231.]討論，研究人員嘗試外源蛋白在動物體內(nèi)的表達在胚胎學和分子生物學中的進展已經(jīng)相當成熟，BrinsterandPalmiter仔細選擇容易測定的HSV胸苷激酶基因放置在金屬硫蛋白啟動子的控制下，說明了這種技術(shù)的可行性。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生使得基因功能研究變的生動可貴。在此